PRACTICA N 2. AISLAMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS.

TECNICAS DE SEMBRADO INTRODUCCIN Cuando intentamos estudiar la flora bacteriana del cuerpo, suelo, agua, alimentos o cualquier otra parte de nuestro entorno, pronto descubrimos que las bacterias existen en poblaciones mixtas. Slo en muy raras situaciones se presentan como una sola especie. Para poder estudiar las caractersticas del cultivo, morfolgica y fisiolgica de una especie individual, es esencial, en primer lugar, que el organismo deba separarse de la otras especies que normalmente se encuentran en su hbitat; en otras palabras, debemos tener un cultivo puro del microrganismo. Varios mtodos diferentes para obtener un cultivo puro de un cultivo mixto estn disponibles para nosotros. Los dos los mtodos utilizados con ms frecuencia implican hacer un estriado en placa o el vertido en placa. Ambas tcnicas de placa implican raleamiento de los organismos para que especies individuales puedan seleccionarse de los dems. En esta prctica tendrs la oportunidad de utilizar ambos mtodos de aislamiento y las tcnicas del sembrado en un intento para separar distintas especies que contiene una mezcla o pull de microrganismos presentes en la degradacin o descomposicin de alimentos y sustancias orgnicas.
CAPACIDAD:

Manipula los instrumentos de laboratorio de manera correcta Conoce la tcnicas de aislamiento y siembra de los microrganismos

TECNICA DE TRABAJO METODO DE PLACA ESTRIADA Para la economa de materiales y tiempo, este mtodo es el ideal. Sin embargo, requiere una cierta habilidad, para la siguiente experiencia. Una apropiada ejecucin del estriado en placa dar como resultado un buen aislamiento para la mayora de los trabajos. 21.1 Figura ilustra cmo las colonias de un cultivo mixto deben ser distribuidas en un correcto estriado en placa. Lo importante es producir buen espaciamiento entre las colonias. Materiales: Cocina elctrica Mechero de Bunsen Alambre nicron (resistencia cocina electrica) Termmetro Marcado de vidrio Agar nutritivo vertido en placa Petri Cultivo mixto ( alimentos contaminados a examinar) 1. Prepare su mesa o rea de trabajo, desinfeccin la superficie con el desinfectante disponible del laboratorio. Use una esponja para fregar y limpiar. 2. Marque la superficie inferior de una placa de Petri estril con su nombre y fecha. Utilice un marcador de vidrio. 3. Licuar un tubo de agar nutritivo, enfriar a 50 C, y Vierta el medio en la parte inferior y central de la placa, siguiendo el procedimiento que se ilustra. Asegure que el cuello del tubo se exponga a la llama antes de verter, para destruir las bacterias de alrededor. Despus de verter suavemente el medio en la placa, Gire la placa de manera que se distribuye uniformemente, pero que no salpique sobre los lados. Agar-agar, el agente slidificante en este medio, se convierte en lquido cuando hierve y resolidifica alrededor de 42 C. Verterlo sobre los 50 C en la placa producir condensacin de humedad en la

cubierta. Cualquier humedad en la cubierta es indeseable porque si cae en las colonias, los organismos de una colonia pueden extenderse a otras colonias, perjudicando toda la tcnica de aislamiento. 4. realiza estras en la placa por uno de los mtodos mostrados. El instructor indicar que tcnica que debe usar. PRECAUCIN: Asegrese de seguir la rutina en la figura 21.3 para obtener el cultivo de organismos. 5. Incube la placa en una posicin invertida a 25 C de 24 a 48 horas. Incubar las placas boca abajo, minimiza el problema de humedad en la cubierta.

ESTRIADO DE CUADRANTES (Mtodo A) 1. Estri una asada cargada de organismos a travs de la zona 1 cerca del borde de la placa. Aplicar el asa ligeramente. No sobrecorte el medio. 2. Flamee el asa, enfri 5 segundos, y realice 5 de 6 estriados desde el rea 1 al rea 2. Momentneamente coloque el asa en una zona estril del medio, antes de realizar el estriado, con el fin de asegurar su enfriado. 3. Flamee el asa de nuevo, enfriar y hacer 6 o 7 rayas desde el rea 2 a travs de la zona 3. 4. Flamee el asa de nuevo y hacer el numero de estras posibles de la zona 3 en el rea 4, utilizando el resto de la superficie de la placa. 5. Flamee el asa antes de poner a un lado. ESTRIADO DE CUADRANTES (Mtodo B) 1. Estri una asada llena de organismos y hacia el centro sobre la zona 1, comenzando en el punto designado por "s". Aplique ligeramente el asa. No sobrecorte el medio. 2. Flamee el asa, enfri 5 segundos y toque el medio en rea estril momentneamente para asegurar el enfriado. 3. Gire la placa 90 grados mantenindola cerrada. Estri la zona 2 con varios trazos hacia adelante y atrs, tocando la estra original unas cuantas veces. 4. Flamee nuevamente el asa. Gire la placa y estri la zona 3 varias veces, tocando la ltima rea varias veces. 5. Flamee el asa, enfrela y gire la placa 90 grados nuevamente. Estri de zona 4, haciendo contacto con el rea 3 varias veces y arrastre el cultivo como se ilustra. 6. Flamee el asa antes de ponerlo a un lado.

ESTRIADO RADIANTE 1. Extienda una asada llena de organismos en un rea pequea cerca del borde de la placa en la zona 1. No sobrecorte el medio. 2. Flamee el asa y deje que se enfre durante 5 segundos. Tocar un rea estril del medio asegurando su enfriado. 3. Desde el borde del rea 1 hacer 7 o 8 estras rectas para el lado opuesto de la placa. 4. Nuevamente flamee el asa, enfre lo suficiente y cruce estras sobre las ltimas realizadas, comenzando cerca de zona de 1. 5. Flamee el asa de nuevo antes de ponerlo a un lado.

ESTRIADO CONTNUO 1. Comenzando en el borde de la placa (rea A) con una asada llena de organismos propagados en un solo movimiento continuo hacia el centro de la placa. Utilice una ligera presin y evite sobrecortes del medio. 2. Gire la placa 180 grados para la porcin inoculada de la placa est lejos de usted. 3. Sin flamear el asa y utilizando la misma cara de esta, continuar estriando la otra mitad de la placa comenzando por la zona b y ejecutndolo hacia el centro. 4. Antes de ponerlo a un lado flamee el asa.

METODO DE PLACA VERTIDA (Dilucin de asada) Este mtodo para separar una especie de bacterias de otra consiste en diluir una asada llena de organismos con tres tubos de agar nutritivo licuado de tal manera que una de las placas vertida tendr un nmero ptimo de organismos para proporcionar buen aislamiento. Se ilustra el procedimiento general. Una ventaja de este mtodo es que se requiere un poco de menos habilidad del utilizado en el estriado en placa; una desventaja, sin embargo, es que requiere ms medios, tubos y planchas o cocinas elctricas. Procede de realizar tres dilucin en placas vertidas, utilizando el mismo cultivo mixto que utiliz para el estriado en placa. Materiales: cultivo mixto de bacterias 3 tubos de agar nutritivo 3 placas de Petri estriles Plancha o cocina elctrica vaso de agua termmetro asa de inoculacin marcador de vidrio 1. Etiquetar los tres tubos con agar nutritivo, roturarlos y colocarlos en un vaso de precipitacin con agua sobre una plancha o cocina elctrica para ser licuado. Para ahorrar tiempo, empezar con agua caliente si est disponible. 2. Mientras se estn calentando los tubos de medios de comunicacin, etiqueta los fondos de las tres placas de Petri I, II, y III.

3. Para enfriar los tubos con medio agar nutritivo a 50 C, utilice el mismo mtodo que se utiliz para la placa estriada. 4. Despus de seguir la fig, inocular 1er tubo con una asada llena de organismos del cultivo mixto. Tenga en cuenta la secuencia y la manera de manejo de los tubos segn la fig. 5. Inocular el 2do tubo con una asada llena deI 1er tubo, despus mezclar bien los organismos en tubo agitndolos de lado a lado o hacindolos rodar vigorosamente entre las palmas de ambas manos. No salpicar el medio hacia arriba sobre las tapas . Regresar los tubos a bao. 6. Agite el 2do tubo para dispersar completamente a los organismos e inocular 3er tubo con una asada del 2do tubo. Retornar el 2do tubo en el bao de agua. 7. Agite el 3er tubo, flamear y verter su contenido en la placa 3. 8. Flamear los cuellos de los tubos 2 y 3, y vierta su contenido en sus respectivas placas. 9. Despus de que el medio se ha solidificado completamente, incubar las placas de forma invertida a 25 C durante 24 a 48 horas.

VALORACION DE LOS DOS METODOS Despus de 24 a 48 horas de incubacin examine las placas Petri. Buscar colonias que estn bien aisladas de los dems. Observe cmo se aglomeran las colonias que aparecen en las placa 1 realice la comparacin con placas 2 y 3. Las placas 2 o 3 tendrn el aislamiento ms favorable de las colonias. Dibujar la aparicin de las placas estriadas y reporte los resultados sobre el informe de laboratorio.

TECNICAS DE SUBCULTIVO El siguiente paso en el desarrollo de un cultivo puro es para transferir a los organismos de la placa de Petri a un tubo de caldo nutritivo o de agar nutritivo inclinado. Despus de esto y que el subcultivo ha sido incubado por 24 horas, una tincin del subcultivo puede hacerse para determinar si un cultivo puro se ha logrado. Al transferir los organismos de la placa a tubos, una aguja de inoculacin (alambre recto) se utiliza en lugar del asa de alambre. Se inserta la aguja en el centro de la colonia donde existe una mayor probabilidad de contraer slo uno especie de organismo. Utilice la siguiente rutina para subcultivos de los organismos diferentes.

Materiales: tubos de agar nutritivo inclinado aguja de inoculacin Quemador de Bunsen 1. Identifique los tubos de cultivo puro utilizando pruebas bioqumicas 2. Incubar durante 24 a 48 horas a 25 C. 3. Utilice tablas de comparacin bioqumica 4. Utilice coloraciones especificas y observe al microscopio 5. Dibujar los organismos para el informe de laboratorio. Completar el informe de laboratorio para este ejercicio.