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 Ministerio de Salud INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jr. Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara Telf. 471-3254 I Fax: 471-7443 Lima, Per, 1997 Diseo e impresin: Art. Lautrec S.R. Ltda.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO HISTOPATOLOGICO

COMITE DE REDACCION: Dra. Cecilia Morn Cortijo T.M. Mara Elena MUfloz Zamlbrano Dra. Myriam Yasuda Espinoza

COMITE EDITOR: Dr. Alfonso Zavaleta MartnezVargas Dr. Csar Cabezas Snchez Dr. Carlos Carrillo Parodi Dr. Jaime Chang Neyra

MINISTERIO DE SALUD ALTA DIRECCION Dr. Marino Costa Bauer Ministro Dr. Alejandro Aguinaga Recuento Viceministro INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Dr. Carlos Carrillo Parodi Jefe CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA Dr. Csar Cabezas Snchez Director General

PERFIL DE LOS AUTORES

Dra. Cecilia Morn Cortijo Mdico Cirujano, Especialista en Patologa y Laboratorio Clnico Jefe de la Divisin de Patologa y Patologa Clnica, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA, T.M. Mara Elena Muoz Zambrano Tecnlogo Mdico Divisin de Patologa y Patologa Clnica, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA Docente, Facultad de Tecnologa Mdica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos Dra. Myriam Yasuda Espinoza Mdico Cirujano, Especialista en Patologa Clnica Jefe de Laboratorio de Patologa Clnica, Divisin de Patologa y Patologa Clnica Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA.

PERFIL DE LOS EDITORES

Dr. Alfonso Zavaleta Martnez- Vargas Mdico Cirujano, Doctor en Farmacologa Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA. Profesor Principal, Seccin Farmacologa, Departamento Acadmico de Ciencias Fisiolgicas, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano Heredia Miembro, Instituto de Medicina Tropical "Alexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Csar Cabezas Snchez Mdico Cirujano, Master en Medicina Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA. Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Carlos Carrillo Parodi Mdico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Acadmico de Microbiologa, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Jefe, Instituto Nacional de Salud. Dr. Jaime Chang Neyra Mdico Cirujano, Master of Science in Community Health in Developing Countries Director Ejecutivo de Certificacin y Garanta de la Calidad, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA. Investigador, Instituto de Medicina Tropical "Alexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia.

La edicin de este Manual se efectu en el marco del Convenio de Cooperacin suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la Universidad Peruana Cayetano Heredia. B Comit Editor agradece al Dr. Jorge Barnaby Rodrguez, por la revisin y los comentarios efectuados a esta obra.

INDICE

Presentacin ............................................................................................................................................. 7 Resolucin Jefatural ................................................................................................................................. 8 CAPITULO I Introduccin ............................................................................................................................................. 9 CAPITULO II Normas de Bioseguridad .......................................................................................................................... 10 CAPITULO III Obtencin de Muestras ............................................................................................................................. 13 CAPITULO IV Fijacin y Envo de Muestras ................................................................................................................... 15 CAPITULO V Deshidratacin, Aclaramiento, Inclusin ................................................................................................. 17 CAPITULO VI Corte ......................................................................................................................................................... 23 CAPITULO VII Tincin ..................................................................................................................................................... 26 CAPITULO VIII Diagnstico Citolgico............................................................................................................................. 28 CAPITULO IX Coloraciones especiales............................................................................................................................ 31 CAPITULO X Inmunohistoqumica ................................................................................................................................. 33 CAPITULO XI Bibliografa............................................................................................................................................... 36 CAPITULO XII (Anexos)................................................................................................................................................... 37 Anexo 1: Fijadores ................................................................................................................................... 38 Anexo 2: Coloraciones Rutinarias............................................................................................................ 39 Anexo 3: Coloraciones Especiales ........................................................................................................... 41 Anexo 4: Soluciones en lnmunohistoqumica .......................................................................................... 49 Anexo 5: Solicitud de Examen Histopatolgico....................................................................................... 50

PRESENTACION

Los mtodos histopatolgicos continan siendo herramientas importantes para el diagnstico de enfermedades transmisibles y no transmisibles. Gracias al desarrollo de nuevas tcnicas, se ha incrementado la capacidad de detectar la presencia en las muestras de diferentes tejidos de: agentes patgenos, de antgenos y anticuerpos, y de cambios en los tejidos y sus componentes. Entre las reas en las que el avance ha sido ms significativo podemos mencionar, como ejemplo, a la inmunohistoqumica. Para el mejor aprovechamiento de estas herramientas diagnsticas, se requiere de la obtencin y preparacin adecuadas de las muestras antes de su examen. Por esto, con el objeto de contribuir a mejorar la calidad del diagnstico histopatolgico en los laboratorios de los servicios de salud, el Instituto Nacional de Salud pone a disposicin de la comunidad tcnico cientfica nacional el "Manual de Procedimientos de Laboratorio para el Diagnstico Histopatolgico", que esperamos constituya una herramienta de consulta bsica en la Red Nacional de Laboratorios de Salud.

EL COMITE EDITOR

CAPITULO I INTRODUCCION
La tcnica para el diagnstico histopatolgico comprende la preparacin de los tejidos para su estudio microscpico, sometindolos a una serie de procesos: fijacin, deshidratacin, aclaramiento, inclusin, corte y tincin. El manual est elaborado con una aproximacin simple y prctica, de tal manera que su contenido sea fcilmente accesible al personal que labora en laboratorios de Patologa. El principal objetivo del manual es uniformizar la metodologa empleada en el procesamiento del tejido, desde que la muestra es enviada al Laboratorio de Patologa, hasta obtener el producto final en la mesa del patlogo. Esperamos, asimismo, que sirva de una gua base, que pueda ser enriquecida en el tiempo con nuevos aportes. El manual est dividido en las siguientes secciones: - Bioseguridad: Fundamental en el manejo y funcionamiento de todo laboratorio. Sealaremos los principales factores de riesgo ocupacional en el laboratorio de Patologa, y cmo contrarrestarlos de la mejor manera. - Procesamiento de la muestra, desde su obtencin hasta la tincin. Diagnstico citolgico: ser abordado en forma breve.

Secciones especiales: Coloraciones especiales e inmunohistoqumica.

CAPITULO II BIOSEGURIDAD
Bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas mnimas para proteger la salud y seguridad del personal que trabaja en el laboratorio frente a diferentes riesgos biolgicos. 2.1 FACTORES DE RIESGO OCUPACIONAL Estos se pueden agrupar en varias categoras: 2.1.1 Fsicos Mecnicos: Cuchillas de micrtomo rotatorio, criostato. Trmicos: Estufas, mecheros. Radiacin: Microscopio de luz ultravioleta

2.1.2 Qumicos - Colorantes: Estas sustancias por la naturaleza de su estructura son txicas e irritantes para los ojos, sistema respiratorio y piel; algunas de ellas pueden ser explosivas y otras son potencialmente cancergenas. Ejemplo: Hematoxilina, Acido pcrico, etc. - Reactivos: a) Acidos: Los accidentes ms frecuentes son las proyecciones de cidos sobre las manos, ojos y cara. b) Alcalis: En forma slida o en solucin. Ejemplo: Hidrxido de sodio. c) Solventes orgnicos: Xilol, potencialmente cancergeno; Eter, produce depresin del sistema nervioso. d) Gaseosos: Formol (solucin saturada de gas formaldehdo en agua, aproximadamente 40% de gas en peso), es irritante para las fosas nasales y puede provocar dermatitis. 2.1.3 Biolgicos: - Parsitos - Bactrias - Virus - Hongos 2.1.4 Ergonmicos: - Instalaciones fsicas de la Institucin - Diseo inadecuado de Laboratorio - Ventilacin inadecuada. 2.2 PROGRAMA DE SEGURIDAD La seguridad es fundamental en el manejo y funcionamiento de todo laboratorio. El personal de laboratorio debe estar consciente sobre los riesgos presentes y conocer cmo hacerles frente. 2.2.1 Consideraciones generales Un ambiente confortable y seguro provee una sensacin de seguridad y reduce la aprehensin respecto a la manipulacin de espcimenes, reactivos o equipos. Todo el personal debe estar consciente de los riesgos y saber como prevenirlos. Para incrementar el conocimiento y la experiencia al respecto, es necesario contar con:

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a) Manual de Procedimientos operativos, donde consten todas las funciones del Laboratorio, procedimientos, equipos y productos qumicos dentro de cada laboratorio. b) Manual de Seguridad: Debe cubrir requerimientos de seguridad especficos y directivas para cada unidad del laboratorio. Es responsabilidad de la Jefatura del Departamento el manejo sin riesgo de un Laboratorio, y elaboracin de ste manual. c) Entrenamiento en Seguridad: El tener los dos manuales previos no va a evitar los accidentes. Informaciones que sean actualizadas, relevantes, deben de darse peridicamente; asimismo deben acompaar la introduccin de nuevos procedimientos, qumicos, reactivos, o agentes infecciosos. Se deben programar (al menos anualmente) capacitaciones a los trabajadores en temas como resucitacin cardiopulmonar y primeros auxilios. 2.2.2 Consideraciones sobre el factor de riesgo qumico Los factores de riesgo qumico pueden disminuir teniendo en cuenta las siguientes medidas generales de prevencin: a) Uso de seales de peligro y rtulos: Todos los reactivos deben estar rotulados, sealando las precauciones a tener en cuenta. b) Empleo de ropa de proteccin: Guantes protectores, mandiles, protectores raciales o gafas protectoras y mascarilla. c) Manejo de qumicos: Colocar los recipientes que contienen qumicos peligrosos en su sitio y mantener el rea de trabajo organizada y limpia. Esto reducir los derrames accidentales y roturas. Con sustancias peligrosas como el xilol, evitar el contacto directo en lo posible; usar pinzas para introducir lminas en el xilol. d) Almacenaje de inflamables: Se recomienda que los reactivos inflamables sean colocados en posicin fcilmente accesible y lo ms cercano al piso. e) Eliminacin de qumicos: El mtodo de eliminacin (incineracin, dilucin, eliminacin por el sistema de drenaje, autoclave) depende del tipo de qumico y sus especificaciones. 2.2.3 Consideraciones sobre el factor de riesgo biolgico Todas las muestras son potencialmente infecciosas, y es prudente, por tanto, manejar estos materiales en forma tal que permita reducir razonablemente la exposicin del personal a los patgenos. a) Implementos de proteccin: - Todo el personal que manipula muestras fijadas debe usar mandil y guantes. - Usar guantes dobles, protectores faciales o gafas y mascarilla, aquellos que manipulan o disecan especmenes no fijados. b) Manejo de especmenes: - Los espcimenes deben ser colocados en recipientes a prueba de derrames o en bolsas plsticas seguras. Si el recipiente primario est contaminado por fuera, debe colocarse en un contenedor secundario seguro, antes de transportarlo al laboratorio. - La hoja de solicitud de examen debe mantenerse no contaminada, si ocurriera, debe ser descartada y reemplazada. - Los tejidos deben ser fijados lo ms pronto posible. Si se va a retener especmenes no fijados, deben ser colocados en bolsas plsticas dobles y guardarlos en el refrigerador y rotulados como material peligroso. . - Los extendidos vaginales, improntas y extendidos de fluidos corporales deben considerarse contaminados hasta que sean fijados (con alcohol corriente, o una solucin de alcohol-ter) o hasta que sean teidos y montados en la lmina. - Los fluidos corporales usados para preparar extendidos o block cells son extremadamente peligrosos. Mientras se decantan o fraccionan gran cantidad de fluidos, se debe usar doble par

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de guantes, mandilones, y protector facial. Si el riesgo de dispersin de gotas es alto, realizar el procedimiento en cabina de seguridad biolgica para contener cualquier fluido dispersado. c) Descontaminacin: La mesa de trabajo debe ser lavada con detergente, enjuagar con agua, limpiar con tela remojada en leja al 10% o 1% u otro germicida y finalmente enjuagar con agua. Lavar el instrumental con detergente, enjuagar con agua y descontaminar con leja al 10% u otro germicida. Una exposicin de \O minutos es suficiente. Toda la ropa e implementos descartables contaminados deben colocarse en recipiente de seguridad para ser autoclavados antes de su eliminacin. Si es ropa: toallas, reusables, deben colocarse en bolsas plsticas y enviarlas a la lavandera de la Institucin.

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CAPITULO III OBTENCION DE LA MUESTRA

El estudio anatomopatolgico se lleva a cabo en muestras obtenidas por biopsia, especmenes quirrgicos o especmenes de necropsias (post mortem). La biopsia es un fragmento de tejido que se extrae de un rea representativa de una lesin, y que nos brinda informacin histolgica para el diagnstico. Puede ser obtenida de cualquier rgano mediante diversos procedimientos, muchos de ellos realizados nicamente por personal mdico especializado, como endoscopas, broncoscopas, legrados uterinos, etc. La biopsia de piel es la de ms fcil acceso, pudiendo ser realizada por personal paramdico; asimismo la toma de muestras post-mortem. 3.1 BIOPSIA DE PIEL 3.1.1 Tcnica para la toma de muestra Las tcnicas ms comunes para la obtencin de muestras de piel son: sacabocado (punch), biopsia por excisin y biopsia por incisin. Lo primero es realizar una buena asepsia y anestesia, cualquiera que sea la tcnica a emplear. En lo posible debe seleccionarse un rea sana, y otra con la lesin. Una vez seleccionada la lesin o el rea a ser biopsiada, se realiza la asepsia con agua y jabn, seguido de un antisptico. Se aisla la zona con gasas estriles (campos). Se infiltra con anestsico. Inmediatamente despus de obtenida la muestra, debe ser colocada en un fijador para evitar que se seque o que se inicie el proceso de degradacin del tejido (autlisis). 3.1.2 Biopsia por sacabocado (punch): El sacabocado es un instrumento que consta de un mango cilndrico que tiene en uno de sus extremos una cuchilla circular con un dimetro fijo. Tomar el sacabocado entre los dedos ndice, medio y pulgar, presionar firmemente perpendicularmente a la epidermis y girar secuencialmente en el mismo sentido y sentido contrario a las manecillas del reloj hasta obtener la profundidad deseada. Retirar el sacabocado. Con una aguja hipodrmica se engancha y tracciona hacia arriba la biopsia cilndrica, seccionndola en su porcin ms inferior con bistur o tijera. Colocar la biopsia en el fijador INMEDIATAMENTE. Presionar la herida con gasa por 5 minutos para controlar el sangrado. Dejar la herida cubierta con venda adhesiva o apsitos. 3.1.3 Biopsia por Excisin: Es la reseccin de toda la lesin para el estudio anatomopatolgico. Est indicada cuando la lesin es bien delimitada y mide menos de 1 cm de dimetro. La incisin quirrgica se realiza con hoja de bistur.Debe incluir un margen de piel sana. Se hace un corte perpendicular a la epidermis. El eje mayor de la biopsia debe seguir el sentido de los pliegues cutneos. Inmediatamente se coloca la biopsia en fijador. La sutura se realiza con seda o nylon 4/0 5/0.

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3.1.4 Biopsia por Incisin: Es la reseccin de una parte de la lesin. Se realiza cuando la lesin es de gran tamao. Con una hoja de bistur se realiza la incisin en forma de cua o fusiforme, perpendicular a la epidermis. Inmediatamente se coloca la biopsia en el fijador. La sutura se realiza con seda o nylon 4/0 5/0. 3.2 ESPECIMENES POST MORTEM Es necesario que se obtenga lo ms pronto posible despus del fallecimiento, pero si es inevitable el retraso, el cadver debe ser colocado en refrigeracin (a 4 C). Las muestras post mortem pueden dar informacin al patlogo hasta 12 horas despus del fallecimiento, pero cuanto menos tiempo transcurra, el diagnstico ser ms confiable. Como ilustracin nos referiremos a la tcnica de la Incisin para obtencin de tejido heptico post mortem: Con un bistur o cuchilla corriente hacer incisin oblicua de aproximadamente 7 cm partiendo de la lnea media clavicular derecha, debajo del reborde costal y continuando hacia abajo ya la derecha. Luego profundizar la incisin hasta encontrar el hgado. A continuacin sujetar el hgado con pinzas y realizar un corle para obtener fragmentos de 3x3cm aproximadamente. Para fijar los fragmentos hay que adelgazarlos, y estos preferiblemente no deben ser mayores de 5 mm de grosor. Colocar en fijador (formal al 10%). Si la muestra va a ser procesada por tcnicas inmunohistoqumicas, debe utilizarse formal neutro.

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CAPITULO IV FIJACION Y ENVIO DE MUESTRAS

En cuanto se extirpa un tejido del organismo o se priva de su irrigacin, ste empieza a descomponerse, lo cual es una consecuencia de la falta de oxgeno y metabolitos esenciales, de la acumulacin de CO2 y otros productos del metabolismo celular y de la accin de diversas enzimas (autlisis). Para preservar el estado natural de los tejidos es indispensable detener cuanto antes estos procesos de descomposicin. Para este propsito, debe colocarse el tejido en un volumen adecuado de una solucin fijadora, lo ms pronto posible despus de la extirpacin. 4.1 FIJACION Es el proceso mediante el cual los elementos constitutivos de los tejidos son tejidos, en cuanto a su estado fsico y parcialmente tambin en su estado qumico, de manera que puedan resistir el tratamiento sucesivo con varios reactivos sin distorsin importante de sus estructuras o descomposicin. En condiciones ideales un fijador debe penetrar rpidamente al tejido, su accin debe ser inmediata, y debe causar una prdida y alteracin qumica y fsica mnima de las clulas y sus componentes. La mayora de fijadores producen cierto endurecimiento tisular, facilitando as el corte; pero generalmente este efecto endurecedor es reforzado por la accin de alcoholes, que son empleados durante el proceso de deshidratacin (ver Captulo V). Los fijadores tambin aumentan, por lo general, la diferenciacin ptica de las estructuras tisulares, y reducen el riesgo de infeccin en las personas que manejan los tejidos. 4.1.1 Principios Generales de Fijacin de las Muestras a) Cantidad de Fijador: Debe ser aproximadamente 10 a 20 veces el volumen de la muestra, as por ejemplo: Muestra de 0,5 x 0,5 cm: 6 a 10 mL Muestra de 0,5 x 1 cm: 10 a 15 mL Muestra de 2 x 1 cm: 20 a 40 mL Muestra de 2 x 2 cm: 40 a 80 mL h) Deben colocarse en frascos preferentemente de plstico, de boca lo suficientemente ancha para que el tejido pueda ser extrado del frasco sin dificultad. Una vez que el tejido est fijado se endurece, y si el frasco es muy pequeo, en relacin al volumen de la muestra, surgen dificultades al intentar extraerlo del frasco. c) El fijador empleado rutinariamente en Patologa es el formol al 10% en solucin acuosa o en solucin acuosa tamponada (formol neutro) (ver Anexo 1), pero existen otros que mencionaremos para su conocimiento: Fijador de Zenker: Es un fijador de sales mercuriales. Tienden a mejorar la tincin de ncleos y el tejido conjuntivo. Preserva mejor los detalles para fotografas. Fijador de Bouin: Es un fijador derivado del cido pcrico. Es uno de los mejores fijadores para el estudio del glucgeno y que penetra rpidamente al tejido. d) Tempo de Fijacin: Vara segn el fijador que se utilice y el tamao de la muestra. Con el fijador de uso comn, el formol al 10%, las biopsias pequeas pueden tomar 6 horas

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aproximadamente en fijarse. Las muestras grandes toman aproximadamente 24 horas. Se pueden dejar en el lquido fijador por ms tiempo, pero si los tejidos van a ser sometidos a procedimientos especiales como Inmunohistoqumica, requieren idealmente un tiempo de fijacin mximo de 24 horas. (Ver Captulo X). 4.2 ENVIO DE MUESTRAS Todos los espcimenes para examen histopatolgico deben ser remitidos con su ficha de envo de muestra correctamente llenada. (ver Anexo 5). El recipiente conteniendo la biopsia debe ser rotulado claramente con el nombre del paciente, la naturaleza del espcimen, (hgado, pulmn, etc.). El recipiente se tapa hermticamente, se sella con esparadrapo, y se coloca en una caja de cartn, protegiendo el frasco para evitar roturas, si es de vidrio rellenar con papel, espuma plstica. No necesita refrigeracin. Las muestras deben remitirse en frascos con fijador. (ver 4.1.) Son criterios para rechazar una muestra para estudio anatomo-patolgico: - Recipiente del espcimen sin rotular. - Discrepancia entre la ficha de envo de muestra y el rtulo del recipiente. - Inadecuada o insuficiente informacin en la ficha de envo de muestra. - Inadecuado envo.

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CAPITULO V DESHIDRATACION, ACLARAMIENTO E INCLUSION

5.1 MANEJO AUTOMATICO DE LOS TEJIDOS En la actualidad el proceso de deshidratacin, aclaramiento, y la preparacin para la inclusin de los tejidos se llevan a cabo con alguno de los aparatos automticos de que se dispone en el mercado. Se trata en general de un huso central giratorio que lleva en el extremo del brazo horizontal una canastilla. Un sistema de relojera elctrico hace girar una tarjeta circular con muescas, en cuya circunferencia se desliza un "diente" equilibrado por un resorte. El nmero de muescas o perforaciones es de acuerdo al esquema de tiempo deseado: Cuando el diente cae dentro de una muesca echa a andar un motor que eleva el huso central, el cual por efecto de un tomillo fijo gira automticamente y la canastilla baja en la solucin. Un pequeo movimiento vertical repetido del brazo lateral que eleva la canastilla agita continuamente sta dentro de la solucin. Finalmente, dos recipientes o vasos metlicos contienen la parafina que se mantiene a una temperatura constante, de aproximadamente 56 C, por efecto de termostatos dentro de las paredes de los recipientes (Fig. 2a). Existen tambin en el mercado procesadores automticos con reloj digital, sistema que reemplaza la tarjeta circular con muescas descrita anteriormente. (Fig. 2b) 5.2 ESQUEMAS DE TIEMPO PARA LA DESHIDRATACION, ACLARAMIENTO E INCLUSION EN PARAFINA El tejido (biopsia o pieza quirrgica) a ser procesado es descrito en sus caractersticas macroscpicas por el mdico patlogo, luego de lo cual procede a tomar cortes representativos de la lesin y lo introduce en cpsulas o canastillas metlicas para que a continuacin sea sometido al proceso de deshidratacin, aclaramiento e inclusin.

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Podemos dar el siguiente ejemplo de un esquema de 12 horas automatizado: Alcohol etlico corriente Alcohol etlico corriente Alcohol etlico corriente Alcohol etlico absoluto Alcohol etlico absoluto Alcohol etlico absoluto Xilol Xilol Xilol Paralina Paralina 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 2 horas

Este procesamiento de tejidos tambin se puede realizar en forma manual. Un esquema acortado que nos da resultados aceptables en el mtodo manual es: Alcohol etlico corriente Alcohol etlico corriente Alcohol etlico corriente Alcohol etlico absoluto Alcohol etlico absoluto Alcohol etlico absoluto Xilol Xilol Parafina Parafina 45 a 60 minutos 45 a 60 minutos 45 a 60 minutos 45 a 60 minutos 45 a 60 minutos 45 a 60 minutos 45 a 60 minutos 45 a 60 minutos 45 a 60 minutos 45 a 60 minutos

En el tercer alcohol absoluto se puede interrumpir el procedimiento y dejar los tejidos en l hasta el da siguiente. Los resultados con el mtodo manual no son tan ptimos como con el equipo automatizado, sobre todo por la falta del movimiento vertical que agita continuamente las sustancias qumicas y los tejidos. Pero realizando secciones finas de los tejidos, y procesando pocos tejidos por vez (ejemplo 4 secciones de 2xl cm en un frasco con 100 mL de alcohol), se puede parcialmente

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subsanar la falta de un equipo automatizado. 5.3 DESHIDRATACION Los tejidos contienen grandes cantidades de agua que debe ser eliminada y reemplazada por parafina. Este proceso se denomina deshidratacin. El mejor agente para ello es el alcohol etlico. La deshidratacin se logra mejor utilizando alcoholes de menor a mayor concentracin. No es aconsejable el paso directo del tejido del formol al alcohol concentrado ya que provoca distorsin del tejido. Los alcoholes deben ser renovados dependiendo de la frecuencia de uso y de la cantidad de tejidos introducidos en ellos; se descarta el primer recipiente de alcohol y el segundo queda como primero; en el ltimo se coloca de nuevo alcohol absoluto. El volumen de alcohol debe ser aproximadamente 10 veces el volumen del tejido a deshidratar.

5.4 ACLARAMIENTO (Desalcoholizacin) Permite que el alcohol de los tejidos sea reemplazado por un lquido que disuelva la parafina con la cual el tejido va a ser impregnado. Adems, muchas de estas sustancias tienen la propiedad de volver transparentes los tejidos. Tambin se utiliza para la desalcoholizacin de los cortes teidos, antes de montarlos en Blsamo de Canad o Permount u otro. El solvente de parafina ms usado es el Xilol. El volumen mnimo debe ser 10 veces el volumen del tejido. Nunca debe dejarse los tejidos en Xilol ms de 3 horas; si no es difcil hacer los cortes. Cuando la deshidratacin no es completa, el xilol toma un aspecto lechoso cuando se le aade el tejido. - Otros agentes aclarantes son: Tolueno, Cloroformo, Aceite de cedro, entre otros.

5.5 INCLUSIN Comprende la impregnacin de los tejidos con un medio que llene todas las cavidades naturales, y que proporcione la consistencia firme necesaria para hacer cortes bien delgados sin provocar distorsin. La inclusin en parafina es la ms usada y ms simple. Un sustituto de la parafina es el Paraplast (combinacin de parafina con polmeros plsticos). El volumen del medio de impregnacin debe ser aproximadamente 25 veces mayor que el volumen del tejido.

5.5.1 Moldes para Bloques Son de varios tipos: a) "L" de inclusin: Consiste en dos piezas en forma de L de material pesado tipo bronce, que descansan sobre una base metlica plana. b) Moldes plsticos para inclusin: Consiste en una base de plstico o de acero inoxidable dentro de la cual se incluye la pieza tisular. Luego se pone encima un molde de plstico que se llena de parafina, dndole mayor soporte al bloque. c) Centro de Inclusin: Son unidades multifuncionales usualmente equipadas con dispensador de parafina, porta espcimenes, platillo caliente para orientar el espcimen en la parafina derretida y platillo fro para transformar la parafina en un bloque slido despus que el espcimen ha

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sido orientado. 5.5.2 Tcnica Se recomienda un punto de fusin para la parafina entre 54 y 58 C. Mantener la parafina lquida en el recipiente final de parafina del procesador automtico, el cual se pasa a la mesa de trabajo. Se coge una cpsula metlica que contiene el tejido procesado. Se extrae el tejido de la cpsula y se coloca en el molde para hacer bloques llenos con parafina derretida. La cara del tejido donde se quieren hacer los cortes se coloca hacia abajo, y los tejidos deben orientarse cuidadosamente para que el plano de corte sea el deseado (ver 5.5.3 orientacin del espcimen). Una vez que los tejidos han sido incluidos as, y en cuanto la parafina se solidific en parte, los moldes se colocan en un recipiente con hielo por 30 minutos o toda la noche, lo cual reduce la tendencia de algunas parafinas a cristalizarse y permite obtener bloques de consistencia firme y uniforme. Retirar el molde, quedando el bloque de tejido parafinizado listo para cortar.

5.5.3 Orientacin del Espcimen El tcnico debe revisar minuciosamente cada uno de los fragmentos de tejido, analizar su estructura y decidir cmo colocar el tejido en el bloque. Es por tanto, necesario tener un conocimiento bsico de la estructura tisular macroscpica y anatoma, se recomienda siempre la comunicacin con el patlogo. a) Consideraciones generales - Las secciones de tejido son incluidas perfectamente planas para poder obtener una seccin completa (ver Figura 3).

- La orientacin debe ser tal que la resistencia que el tejido ofrece a la cuchilla vaya desde la menor hacia la mayor cantidad conforme el bloque es seccionado. Esto produce secciones ms lisas. (Ver Figura 4)

- Estructuras tubulares: Como vasos deferentes, trompas de Falopio, arterias, deben incluirse de tal modo que la cuchilla corte a travs del lumen. La cuchilla debe cortar perpendicularmente al eje mayor del tubo (ver Figura 5).

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- Superficie epitelial: Tejidos con superficie epitelial como piel, intestino y vescula, deben colocarse de modo que el plano de seccin atraviese todas las capas del tejido. La superficie epitelial debe ir arriba del bloque, de tal modo que se corte al final, as se minimiza la compresin, rasgaduras y cortes en las capas subcutneas (ver Figura 6).

- Mltiples espcimenes: Deben colocares lado a lado, con espacio entre ellos. Si se colocan uno encima del otro hay mayor posibilidad que el tejido inferior distorsione al superior (ver figura 7).

- Estructuras qusticas: Los quistes disecados tienen forma de media luna. El quiste debe ser

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incluido con la superficie de corte hacia abajo, de tal forma que la cuchilla corte a travs de todas las capas de la pared qustica (ver figura 8).

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CAPITULO VI CORTE DE LOS TEJIDOS

6.1 CUCHILLAS DE MICROTOMOS La seleccin de la cuchilla de micrtomo (de acero inoxidable, diamante, vidrio, o cuchilla descartable) depende de la estructura del espcimen a ser seccionado y el medio usado para la inclusin. - Cuchillas de acero inoxidable: Para cortar parafina. La longitud de las cuchillas vara de 110 mm a 250 mm. - Descartables: Excelentes para cortes en parafina. Existen disponibles en diversos tamaos y grosores. El porta cuchillas descartables debe mantenerse limpio y bien lubricado, para que la cuchilla est segura. - Diamante o vidrio: Para espcimenes incluidos en resinas, pues tienen filos ms gruesos. 6.2 AFILADO DE LAS CUCHILLAS Puede hacerse a mano o a mquina, de acuerdo a procedimientos internacionales recomendados. 6.2.1 A mano Se hace utilizando una de stas dos formas: - Con piedra de afilar: Es una piedra natural o superficie dura para afilar un cuchillo u otro instrumento cortante. Utilizan aceite como lubricante. - Con placa de vidrio: Se usa con polvo abrasivo. 6.2.2 Afiladores automticos 6.3 MICROTOMOS 6.3.1 Tipos de micrtomos Rotatorio: El ms usado, donde el bloque se mueve. La cuchilla se ubica con el filo hacia arriba (Fig. 9) De deslizamiento: La cuchilla es la que se mueve, es particularmente til cuando se seccionan grandes bloques (ejemplo: cortes de pulmn entero).

6.3.2 Grosor del corte El grosor ideal es de 3 a 4 micras. Esto reduce la superposicin de ncleos.

6.3.3 Orientacin del bloque Debe ser correctamente ubicado en el micrtomo, para obtener preparaciones de la superficie entera, libre de lneas, pliegues, o distorsin celular.

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6.3.4 Seccin del bloque Antes de seccionar el bloque, examinarlo y establecer cmo debe ser colocado en el sujetador de bloque del micrtomo. Una vez que el bloque est seguro en el sujetador, iniciar el corte grueso, avanzando repetidamente el bloque manualmente obteniendo cortes, detenerse cuando la superficie del bloque entera es expuesta. Enfriar la cuchilla y el bloque brevemente con un cubo de hielo. Luego se procede a hacer cortes finos sucesivos que forman una "cinta" de tejido, para lo cual la manija debe ponerse a velocidad lenta. Colocar el corte fino en la superficie del bao de flotacin. 6.3.5 Flotacin El bao de flotacin debe ser calentado a pocos grados bajo el punto de fusin de la parafina. El uso de agua destilada en el bao ayuda a eliminar burbujas (puede usarse agua de cao) (ver 6.3.7). La cinta de tejido es puesta gradualmente en el bao de flotacin para eliminar arrugas y aire atrapado. Los cortes son luego puestos en lminas limpias ya rotuladas con el cdigo del tejido. Son secadas verticalmente en el secador de lminas a temperatura de 37 a 40 C de un da para otro o a 58C en estufa por 20 a 30 minutos. 6.3.6 Adhesivos para tejidos El adhesivo ms usado es la gelatina. Tambin se utiliza albmina bovina. Se coloca una capa de albmina sobre la lmina en que se recoge el tejido del bao de flotacin. 6.3.7 Preparacin de agua de cao para el bao de flotacin: Acido clorhdrico al 1% ................................................. 20,0 mL Agua de cao.............................................................. 4000,0 mL

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Agregar lentamente cido al agua. Llevar la solucin a ebullicin. Enfriar y agregar al bao de flotacin conforme se necesite. El hervido remueve el CO2 del agua, reduciendo la formacin de burbujas de aire. El cido clorhdrico al 1% previene la precipitacin de sales minerales que ocurre luego que el CO2 ha hervido. 6.4 DIFICULTADES EN LA REALlZACION DE LOS CORTES 6.4.1 Dificultades que provienen de mala fijacin - Bloques blandos que al cortarse pueden quebrarse, por fijacin incompleta. - Bloques duros, que pueden hacer vibrar la cuchilla, produciendo en el corte lneas paralelas al filo de la cuchilla, o dando cortes alternativamente gruesos y finos. Esto por fijacin prolongada en fijadores como Zenker o Bouin. 6.4.2 Dificultades que provienen de defectuosa deshidratacin, aclaramiento o inclusin - Si el tejido ha sido insuficientemente deshidratado, el aclarador se vuelve lechoso. El aclaramiento y la impregnacin con parafina no puede completarse, resultando un bloque blando. Si esto ocurre se puede remediar volviendo a tratar el tejido con alcohol absoluto. - El aclaramiento insuficiente hace que el tejido aparezca opaco o nebuloso, haciendo muy difcil el corte. Si el tejido ya ha sido incluido en bloques, estos deben ser regresados al bao de parafina hasta que se fundan completamente y pueda regresarse al aclarador para continuar el proceso. - La impregnacin insuficiente puede producir un bloque "hmedo" que tiende a desmoronarse. La impregnacin prolongada endurece demasiado el tejido y lo encoge ms. 6.4.3 Dificultades que provienen del tejido - Para tejidos grasos es mejor hacer cortes ms delgados con el bistur (2 mm). - Hay ciertos tejidos que suelen endurecerse mucho como el cervix. Se obtienen mejores resultados si se reemplaza los agentes deshidratantes y aclaradores por tetrahidrofurano. 6.4.4 Dificultades que provienen de la cuchilla Si la cuchilla no se fija bien al micrtomo, puede saltar, especialmente al cortar tejidos duros. Si la cuchilla se ladea demasiado, se raspa ms de lo que se corta y puede ser imposible obtener un corte. Se producen cortes de grosor irregular por mal ajuste del sujetador del bloque. Una cuchilla roma no puede producir buenos cortes. Las dentaciones o pequeas melladuras en el filo de la cuchilla rayan o raspan los cortes en la direccin del movimiento. Si la cuchilla no est bien afilada puede ser difcil obtener "cintas" de tejido. Un borde romo produce distorsin y compresin del corte y aumenta cualquier tendencia a formacin de pliegues.

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CAPITULO VII TINCION Y MONTAJE

7.1 TlNCION La tincin de los cortes histolgicos permite estudiar y conocer las caractersticas fsicas de los tejidos y las relaciones entre las clulas que los constituyen. Se efecta generalmente usando mezclas de sustancias qumicas denominadas colorantes. Los colorantes utilizados se pueden clasificar como cidos, bsicos o neutros. Los componentes de los tejidos que se tien fcilmente con colorantes bsicos se denominan basfilos; reciben el nombre de acidfilos aquellos que se unen a colorantes cidos. El azul de toluidina y el azul de metileno son ejemplos de colorantes bsicos, as como la hematoxilina. Los componentes ms importantes de los tejidos que reaccionan con los colorantes bsicos son las nucleoproteinas y los glucosaminoglicanos cidos, debido a los grupos cidos ionizables que contienen. Colorantes cidos tales como el Orange G, la Eosina y la Fucsina cida tien principalmente los componentes bsicos de las protenas citoplasmticas. 7.1.1 Tincin con Hematoxilina y Eosina (H-E) Existen dos procedimientos de Hematoxilina que son los ms usados: a) Mtodo de Harris: Es un mtodo regresivo, pues tie todas las estructuras (ncleo, citoplasma, tejido conectivo, etc.) y es seguido por una decoloracin controlada y "azuleamiento" para llegar al ptimo resultado de tincin nuclear. Procedimiento: Xilol 5 minutos (2 baos). Alcohol absoluto 5 minutos Alcohol corriente 5 minutos (2 baos). Agua de cao. Hematoxilina 3 minutos. Agua de cao. Alcohol acido 1% 1 o 2 segundos Agua amoniacal 30 segundos. Agua de cao. Eosina 2 minutos. Alcohol corriente 5 minutos (dos baos). Alcohol absoluto 5 minutos. Xilol 5 minutos (2 baos). Montaje.

Resultados: Ncleo ........................................................................ ....azul Citoplasma ................................................................. .rosado-rojo Otras estructuras tisulares .......................................... .rosado-rojo

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b) Mtodo de Mayer: Es un mtodo progresivo que tie slo el ncleo. La coloracin prosigue hasta lograr la intensidad deseada de coloracin. Un mejoramiento del color azul se logra lavando las lminas en agua de cao. Procedimiento: Xilol 5 minutos (2 baos). Alcohol absoluto 5 minutos. Alcohol corriente 5 minutos (2 baos). Agua de cao. Hematoxilina 15 minutos. Agua de cao 15 minutos. Agua destilada. Alcohol corriente 2 minutos. Eosina 2 minutos. Alcohol corriente 2 minutos (2 baos). Alcohol absoluto 2 minutos. Xilol 2 minutos (2 baos). Montaje.

Resultados: Ncleoazul Citoplasma ................................................................. ..rosado-rojo Otros tejidos ............................................................... ..rosado-rojo 7.2 MONTAJE El paso final en la preparacin de una lmina es cubrir la porcin que contiene el tejido con una laminilla. Esto hace a la lamina permanente y permite el examen microscpico. Para fijar la laminilla se pueden usar medios de 3 tipos: a) Resinas naturales: Blsamo de Canad: Fue el estndar en el pasado, pero toma mucho tiempo en secar. b) Resinas sintticas: Actualmente las ms usadas. Entre ellas tenemos el Permount, Cytoseal , etc. c) Medios acuosos: Se usa cuando los colorantes o estructuras son destruidas o alteradas por deshidratacin o aclaramiento. Entre stos tenemos gelatina de glicerina y medio de montaje de alcohol polivinil.

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CAPITULO VIII DIAGNOSTICO CITOLOGICO

La citologa exfoliativa consiste en estudiar el frotis de clulas descamadas (exfoliadas), principalmente de zonas como cervix uterino, vagina, bronquios; tambin se aplica a las clulas de orina, LCR, y fluidos corporales (peritoneal, pleural, pericrdico). Tambin son tiles los frotis de material obtenido por puncin y aspiracin de ciertos tumores (mama, hgado, etc.). 8.1 FIJACION DEL FROTIS - El mejor fijador es el alcohol-ter (volmenes iguales de alcohol etlico corriente y ter). Otros prefieren usar alcohol etlico corriente solamente. - Se coloca el fijador en un frasco Coplin. - Existen otros fijadores en spray (Cytospray, Spraycite). - Como regla general, los frotis no se deben dejar secar pues se altera la morfologa de las clulas (degeneran). En cuanto estn listos y mientras estn hmedos todava, se ponen en el fijador por 15 minutos. 8.2 IDENTIFICACION DEL FROTIS Una vez fijado, el frotis debe rotularse la lmina con el nombre del paciente, la naturaleza del frotis y fecha. Para ello son ideales las lminas con un extremo despulido, en donde se puede escribir con lpiz ordinario. Si no se cuenta con ellas, adosar con un clip un papel a la lmina con estos datos. 8.3 ENVIO DE LAMINAS CON FROTIS Existen en el mercado fijadores de recubrimiento bajo la forma de aerosoles: Cytospray, Spray-cyte, Cyto-fix. Contienen como fijador alcohol o alcohol-eter mas una pequea proporcin de polietileno o propilenglicol como recubridor. Se pueden fijar en un recipiente en la siguiente solucin por 30 minutos:

100 volmenes de alcohol etlico al 95%, 100 volmenes de eter etlico. y I a 5 volmenes de propilenglicol. Antes de la tincin, los frotis deben pasarse por 2 baos de alcohol-eter por 1 a 2 minutos cada vez, para quitar la cubierta protectora de alcohol superior polimerizado que podra contaminar la hematoxilina. - Otro mtodo de preparacin para el envo de muestras de frotis consiste en tijar el frotis, tratar con alcohol absoluto y xilol, y montar la lmina, y dejar secar. El laboratorio que recibe la muestra quita el cubreobjetos remojando la preparacin en xilol toda la noche. 8.4 OBTENCION DE MUESTRAS Y PREPARACION DE FROTIS 8.4.1 Ginecolgicas a) Cervicovaginal: - Con una esptula se raspa ligeramente las paredes laterales del tercio superior de la vagina y el ectocrvix; con cepillo citolgico el endocrvix. - Extender uniformemente y en frotis delgado sobre la lmina. - Fijar inmediatamente. - No usar formol.

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b) Endometrial : Existen dos mtodos ms usados: - Aspirado. - Cepillado endometrial. 8.4.2 Broncopulmonares a) Esputo: - Colectar el espcimen en un recipiente de boca ancha con tapa. - Los espcimenes se colectan en 3 das consecutivos preferiblemente temprano en la maana. - Instruir al paciente en aclarar primero la garganta y descartar la saliva o secrecin postnasal. Luego pedirle que inspire profundamente y tosa. La saliva no sirve para diagnstico. - Evitar colectar muestra durante o inmediatamente post ingesta. - La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio o ser refrigerada. - Si el espcimen va a demorar en llegar al laboratorio, es preferible preparar y enviar los frotis fijados. Se busca de preferencia el material sospechoso como restos sanguinolentos y fragmentos tisulares. Fijar inmediatamente con alcohol etlico corriente o con Cylospray (fijador de recubrimiento) y enviar. b) Muestras obtenidas por broncoscopas: - Se prepara el frotis directamente de la superficie de las zonas sospechosas y se fijan inmediatamente en alcohol etlico corriente. - Los lavados y cepillados bronquiales deben ser colectados en tubos y centrifugados, luego preparar los frotis con los sedimentos sobre un portaobjetos tratado con albmina. Fijar en alcohol etlico corriente inmediatamente. 8.4.3 Lquidos corporales (Derrames): Pleural, peritoneal, pericrdico, sinovial. Es indispensable estudiar pronto estos lquidos pues las clulas que contienen degeneran rpidamente. Colectar la muestra en un recipiente con tapa y llevar inmediatamente al laboratorio. No es necesario agregar fijador. Si el volumen de la muestra es considerable, dejar sedimentar en el refrigerador por 30 a 60 minutos. Sacar y desechar el lquido con excepcin de los ltimos 100 a 200 mL que se centrifugan; se preparan frotis con los sedimentos en lminas tratadas con albmina, y se fijan inmediatamente. Si el espcimen va a demorar en llegar al laboratorio, es preferible enviar el frotis fijado. Centrifugar la muestra y hacer el extendido con el sedimento. Fijar inmediatamente en alcohol etlico.

8.4.4 Exceso de sangre: - Se puede destruir los glbulos rojos antes de la fijacin aadiendo cido actico concentrado a razn de 2 a 5 mL por 100 mL de muestra. 8.4.5 Tincin del frotis: a) Papanicolaou: Es la tcnica ms empleada. Para la preparacin de reactivos (ver Anexo 2). Procedimiento: Fijador (alcohol ter).

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Alcohol corriente 1 minuto (2 baos). Agua de cao. Hematoxilina Harris 4 minutos. Agua de cao. Agua amoniacal 30 segundos Agua de cao. Alcohol corriente l minuto (2 baos). OG6 2 a 4 minutos. Alcohol corriente l minuto (2 baos). EA36 2 a 4 minutos. Alcohol corriente 1 minuto (2 baos). Alcohol absoluto 1 minuto (2 baos). Xilol 1 minuto (2 baos). Montaje.

b) Hematoxilina-Eosina: Siguiendo los mismos pasos que para la tincin de tejidos. Da resultados satisfactorios para el diagnstico de cncer.

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CAPITULO IX COLORACIONES ESPECIALES

9.1 PARA MICROORGANISMOS Las tcnicas de coloraciones especiales que demuestran organismos infecciosos en cortes de parafina son de gran utilidad diagnstica para el patlogo. 9.1.1 Bacterias La mayora de bacterias son visibles en H-E usando el lente de inmersin. a) Bacterias Gram (-) y Gram (+): Los colorantes utilizados en la tcnica de Gram son siempre colorantes bsicos, que se fijan por un extremo de sus molculas a las protenas, y por el otro extremo al yodo, formndose as un complejo yodo-colorante-protena. En el caso de elementos y microorganismos Gram positivos ste complejo no se disuelve en alcohol. Los pasos bsicos involucrados en la mayora de tinciones Gram son: 1. Tincin primaria (Cristal Violeta). Lavar. 2. Yodo: Fija el colorante primario en los organismos Gram (+). Lavar. 3. Decolorar con acetona. Los grmenes Gram (+) van a retener su color. Lavar. 4. Tincin de contraste. (Fucsina bsica). Lavar. 5. Diferenciar con solucin de Gallego. Los grmenes Gram (-) van a retener su color. Lavar. 6. Diferenciar con solucin de cido pcrico - acetona. 7. Usar solucin acetona/xilol y xilol para deshidratar y aclarar. b) Bacterias alcohol cido resistentes: Se incluyen las Microbacterias y Nocardia asteroides. Se emplea la coloracin de ZiehlNeelsen. Algunas bacterias. como el Mycobacterium tuberculosis, son relativamente difciles de teir; pero despus de que fijan un colorante potente, con intervencin del calor, resisten a la decoloracin por cido. Esta caracterstica se debe a la presencia de lpidos en la estructura del microorganismo. Un procedimiento general para sta coloracin es el siguiente: l. Posterior a la desparafinizacin, teir con Fucsina. Lavar. 2. Decolorar. Los organismos alcohol cido resistentes mantienen su color rojo y el background es claro 3. Tincin contraste con azul de metileno. Nota: Si es muy oscuro el contraste, los organismos no sern visibles. Una tincin muy suave no demostrar adecuadamente los componentes tisulares. 4. Deshidratar, aclarar, y montar. 9.1.2 Hongos Se utilizan las coloraciones de Grocott nitrato de plata metenamina, que colorea la pared de los hongos de negro, y de Peryodic Acid Schiff (PAS), que la colorea rojo a prpura. La coloracin de Grocott es una modificacin del mtodo de Gomori con nitrato de plata-metenamina. Se diferencia en que Grocott incuba por una hora los cortes en plata-metenamina a 60 C. Los grupos

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aldehdo quedan expuestos por oxidacin con cido crmico y pueden reducir la metenamina-nitrato de plata en solucin alcalina. La pared del hongo es argiroflica, tomando la coloracin negruzca con sta reaccin. En la coloracin de PAS, el cido perydico (HIO4) oxida los azcares que poseen los grupos hidroxilo libres, apareciendo una frmula de tipo dialdehdo. Esta frmula, debido a la oxidacin de la glucosa por el HIO4, produce una intensa reaccin con el reactivo de Schiff, y lo mismo ocurre con otros azcares como galactosa, manosa entre otros. Como regla general la intensidad de la reaccin es proporcional al contenido de estos azcares en la sustancia estudiada. Las cpsulas de los hongos contienen mucopolisacridos neutros que son positivos al PAS. 9.1.3 Parsitos Los parsitos malricos pueden ser vistos con Giemsa. Pneumocystis carinii se puede apreciar con Grocott. Otros platelmintos y nemtodes pueden verse con H-E, Giemsa, PAS.

9.2 PARA TEJIDO CONECTIVO El tejido conectivo est constituido por clulas y fibras extracelulares inmersas en una sustancia de fondo. Clulas: Fibroblastos, adipocitos, mastocitos, etc. Fibras: Colgeno, elastina, reticulina. Colgeno es la fibra predominante y es fcilmente demostrable con coloracin H-E. La coloracin Tricrmica de Masson es til en diferenciar el colgeno del msculo y otros elementos. Reticulina es una libra argiroflica que se tie con solucin de plata.

9.3 PARA CARBOHIDRATOS La tcnica ms usada para la demostracin de carbohidratos es el PAS (Peryodic acid Schift). Para detalles sobre las tcnicas de las coloraciones mencionadas (ver anexo 3)

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CAPITULO X INMUNOHISTOQUIMICA
La creciente popularidad y demanda por la identificacin inmunohistoqumica de sustancias especficas han abierto una nueva era en la histopatologa. La Inmunohistoquimica es el uso de anticuerpos seleccionados precisamente para identificar (marcar) antgenos especficos. Son extremadamente sensibles y pueden detectar cantidades muy pequeas de una sustancia. 10.1 ANTIGENOS y ANTICUERPOS Antgeno es la molcula que, cuando se introduce en el cuerpo, estimula una respuesta inmune (produccin de anticuerpos). En Inmunohistoqumica, el antgeno es la sustancia que estamos tratando de demostrar. Anticuerpo es una protena srica (inmunoglobulina) que se produce en respuesta a sustancias especficas (antgenos). Su propsito es contraatacar o neutralizar el efecto del antgeno. Se produce la unin del antgeno y anticuerpo en combinacin con una enzima que precipita un cromgeno, facilitando la visualizacin de la reaccin inmune. 10.2 METO DOS 10.2.1 Directo Un marcador visual, fluorescente o enzimtico es qumicamente unido al anticuerpo primario. El anticuerpo primario es el anticuerpo que est dirigido contra el antgeno que queremos demostrar. 10.2.2 Indirecto El marcador visual se une a un anticuerpo secundario. El tejido es primero expuesto al anticuerpo primario y luego al anticuerpo secundario, el cual es dirigido contra el anticuerpo primario y se unir con ste. 10.2.3 Peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) Utiliza un anticuerpo primario, anticuerpo secundario, y un antianticuerpo unido a una enzima peroxidasa (Complejo PAP). El anticuerpo secundario es producido en especies diferentes del complejo primario y PAP, y el anticuerpo primario y el complejo PAP son producidos de la misma especie. El anticuerpo secundario entonces. acta como puente o ligante. 10.2.4 Complejo Avidina-Biotina (ABC) Utiliza un anticuerpo primario, anticuerpo secundario que est qumicamente unido a la vitamina Biotina y un complejo de la glicoproteina. Avidina unida a Biotina y peroxidasa. Avidina tiene la habilidad de unirse no inmunolgicamente a 4 molculas de Biotina, lo que determina la excelente sensibilidad de ste mtodo. 10.3 REACCIONES DEL SUSTRATO Las enzimas son catalizadores que actan sobre un sustrato para acelerar su conversin a un producto. La peroxidasa usada en inmunohistoqumica reacciona con perxido de hidrogeno, en presencia de electrn donante, para formar una molcula coloreada. La enzima no se depleta y puede continuar catalizando la reaccin formando muchas molculas coloreadas.

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Ejemplos de donadores de electrones son: 3,3 Diaminobencidina, -3,3 Diamino bencidina tetrahidrocloruro (DAB), produce un color marrn en el producto final y es montado con medio resinoso de montaje. -3 Amino 9 etilcarbazol (AEC) produce un color rojo en el producto final y debe ser montado con medio acuoso. 10.4 REACTIVIDAD INESPECIFICA Existen dos fuentes de reactividad inespecfica: Anticuerpos primarios o secundarios: Pueden unirse a elementos tisulares altamente cargados como tejido conectivo, resultando en una reaccin y tincin positiva en sitios distintos al que contiene el antgeno primario. Estos sitios pueden "llenarse" previamente a la tincin, con protenas de sueros no inmunes, previniendo la unin del anticuerpo secundario al tejido. Actividad de peroxidasa endgena: La mayora de tejidos contienen peroxidasa, que acta de la misma forma que el reactivo de peroxidasa que se une al antgeno. Esta actividad generalmente se localiza en reas conteniendo grandes nmeros de clulas sanguneas. Esto puede inhibirse tratando los tejidos con H2O2 al 3% en solucin de metanol (10 mL H2O2 al 30% + 90 mL metanol absoluto), por 30 minutos previos a la tincin.

10.5 FIJACION El fijador de eleccin es formal neutro al 10% fresco. (pH 7,0-7,6). El tejido debe ser expuesto al fijador solo el tiempo necesario para obtener buena preservacin y morfologa. El tiempo ideal de fijacin es menos de 24 horas. La sobrefijacin puede causar formacin de uniones aldehdo en exceso que "enmascaran" los sitios de unin antignica y previenen la unin del anticuerpo primario al antgeno. Algunos mtodos usados para liberar estos sitios de unin son la digestin con enzimas proteolticas (tripsina o pepsina), o sumergir la lmina con el tejido en buffer citrato y llevar al horno microondas para hervido. 10.6 PROCESAMIENTO Los procedimientos rutinarios en parafina se adecan a la inmunohistoqumica. NO se debe permitir temperaturas mayores de 60C, pues el exceso de calor puede destruir los antgenos y la morfologa celular. 10.7 ADHESIVO PARA CORTES Debido a los numerosos pasos y constante manipuleo los cortes frecuentemente se desprenden de la lmina. Existen para ello adhesivos comerciales disponibles. Hay que pretratar las lminas con pegamentos como Silane A-174, como sigue: Colocar la lmina nueva no usada en un soporte de tincin. Agitar las lminas en agua jabonosa tibia por algunos minutos. Lavar todo residuo de jabn de las lminas con un chorro de agua de cao y luego con agua destilada. Enjuagar en alcohol etlico absoluto y secar al aire. Sumergir la porcin de lmina a usar en solucin acuosa fresca de Silane. Secar el pegamento de la parte posterior de la lmina con tela limpia. Secar al aire las lminas y guardarlas en cajas hasta su uso.

10.8 CORTE (MICROTOMO) Se cortan tejidos en parafina a 4-5 micras de espesor y se ponen a flotar en bao de agua destilada a 42C. Recoger secciones con lminas pretratadas y secar horizontalmente a 37C toda la noche o pueden secarse a 60C por 30 minutos, con cuidado de no sobrecalentar las lminas. 10.9 CONTROLES

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Deben procesarse tambin controles positivos (+) y negativos (-) con cada grupo de lminas durante el proceso de tincin. - Control (-): Suero no inmune normal en lugar del anticuerpo primario. - Control (+): Lminas que se sabe contienen el antgeno en prueba y que han dado resultado positivo en el pasado. La siguiente tabla muestra las lminas a ser teidas, solucin a usar y resultados esperados para una prueba vlida.

10.10 PROCEDIMIENTO Mtodo Complejo Avidina-Biotina - Deparafinizar e hidratar hasta agua destilada. - Bloquear actividad de peroxidasa endgena con Hp2-metanol al 3% por 30 minutos. - Lavar x 2 en agua destilada, l minuto cada vez. - Colocar en solucin salina de buffer fosfato (PBS) por 2 minutos. - Colocar suero normal de la misma especie en el cual el anticuerpo biotinilado es producido por 30 minutos. Escurrir pero no enjuagar lminas - Agregar solucin de anticuerpo primario por 1 hora (o incubacin toda la noche). - Lavar en PBS por 5 minutos. - Agregar solucin de anticuerpo biotinilado secundario por 45 minutos. - Lavar con PBS por 5 minutos. - Colocar la solucin ABC (avidin biotin complex) por 45 minutos. - Lavar con PBS por 5minutos. - Agregar el DAB (solucin sustrato) por 10 minutos. - Lavar con agua destilada. - Colorear con hematoxilina Mayer por 5 minutos. - Lavar en agua de cao por 10 minutos. - Deshidratar y aclarar. Montar con medio resinoso. Para preparacin de soluciones ver Anexo 4.

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CAPITULO XI BIBLIOGRAFIA
1. Lynch,M. (1972) Mtodos de Laboratorio. 2da Edicin. Nueva Editorial Interamericana, S.A. 1522 pgs. 2. Nquira, C., Guilln, A., Palacios R., Guevara, M., Guerra, H. (1995). Manual de procedimientos de Laboratorio para la obtencin y envo de muestras (I) (Zavaleta, A., Cabezas, C., Chavez, J., Eds.) Ministerio de Salud. Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica. Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica. Serie de Normas Tcnicas N15, Lima, Art. Lautrec, 98 pgs. 3. Laboratory Methods in Histotechnology. (1992) Washington D.C. Armed Forces Institute of Pathology. Washington D.C. 274 pgs. 4. Bauer.S., Alpert, L., Di Salvo A., Favero M., et al.( 1990) Protection of Laboratory workers from Infectious Disease Transmitted by blood, body fIuids and tissue. NCCLS. 19 (1): 16 - 20. 5. Bourne, J. (1983). Handbook of Inmunoperoxidase Staining Methods. Santa Barbara, Dako Corporation. 41 pgs. 6. Organizacin Mundial de la Salud. (1994). Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. 2da Ed. Ginebra. Organizacin Mundial de la Salud. 149 pgs. 7. Guilln, A., Beltrn, M., Quispe, N., Valverde, A., Zavaleta, A. (1997). Manual de Normas de Bioseguridad. (Zavaleta, A., Cabezas, C., Carrillo, C., Chang, J., Eds.) 2da Ed. Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica. Serie de Normas tcnicas N18, Lima, Art Lautrec, 61 pgs.

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CAPITULO XII (ANEXOS)

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ANEXO 1 FIJADORES
l. Formol al 10% Formaldehido al 37% .....................................................................100 Agua................................................................................................900 2. Formol Tamponado Formaldehido al 37%100,0 Agua destilada900,0 Fosfato de sodio monobsico (NaH2PO4)..4,0 Fosfato de sodio di bsico (Na2HPO4)6,5 mL rnL g g mL mL

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ANEXO 2 COLORACIONES RUTINARIAS

l. Hematoxilina de Mayer 1.1 Reactivos: Alumbre de Amonio o Potasio50,0 Agua destilada.1000,0 Cristales de hematoxilina..1,0 Yodato de Sodio0,2 Acido ctrico..1,0 Hidrato de cloral 50,0 1.2 Procedimiento - Disolver la Hematoxilina en agua destilada agitando fuertemente. - Agregar yodato de sodio para "madurar" la solucin. - Agregar alumbre de amonio o potasio y agitar hasta disolucin completa. - Aadir tambin cido ctrico en ese momento. - Aadir hidrato de cloral como preservante. 1.3 Tiempo de conservacin de la solucin: 3 a 6 meses. 2. Hematoxilina de Harris 2.1 Reactivos Hematoxilina.5,0 g Alcohol etlico absoluto 50,0 mL Alumbre de potasio o amonio100,0 g Agua destilada..1000,0 mL Oxido mercrico (rojo)...2,5 g Acido actico glacial.40,0 mL 2.2 Procedimiento Disolver el alumbre de potasio o amonio en agua destilada, calentando y agitando. Se lleva a 60 C Aadir solucin de Hematoxilina en alcohol absoluto y llevar rpidamente a ebullicin. Cuando empiece a hervir se saca del fuego y se agrega xido mercrico, mezclar por rotacin. Si se obtiene un color prpura intenso, la solucin est suficientemente madura. Si no, prolongar le ebullicin por 1 a 3 minutos ms, despus de aadir el xido mercrico. Un vez fra la absolucin, aadir cido glacial y filtrar antes del uso. g mL g g g g

2.3 Tiempo de conservacin: 6 meses a 1 ao. 3. Eosina 3.1 Eosina stock: Eosina I, soluble en agua ......................................................................................... 1,0 g Agua destilada .......................................................................................................... 100,0 mL

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3.2 Eosina-Floxina: Brindar el mayor rango de contraste, rosado a rojo brillante. El citoplasma se tie de rosado, y el colgeno y msculo se tien de rojo brillante. 3.2.1 Combinar: Eosina stock.............................................................................................................. 100,0 mL Solucin Floxina (1 g en 100 mL) ............................................................................ 10,0 mL Alcohol etlico 95%.................................................................................................. 780,0 mL Acido actico glacial .................................................................................................... 4,0 mL

4. Tincin de Papanicolaou
4.1 Hematoxilina de Harris: la solucin diluida se cambia cada 1 a 3 semana segn el nmero

de preparciones estudiadas.
4.2 Orangc c;(J (OG6): Anaranjado G (Solucin al 0,5% -1% en alcohol 95% ................................................................................... 100,000 mL Acido fosfotungstico ................................................................................................ 0,015 mL 4.3 EA 36 (o EA 50): Verde claro SF amarillento (0,14% en alcohol 95%).45,0.. mL Pardo y de Bismarck (0,5% en alcohol 95%).....10,0.. mL Amarillento de eosina (0,55% en alcohol 95%)..45,0. mL Acido fosfotungstico .0,2 g Solucin acuosa saturada de carbonato de.......l .gota

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ANEXO 3 COLORACIONES ESPECIALES

1. Giemsa 1.1 Soluciones: a) Solucin Eosina azur II Colocar semillas de vidrio estriles en botella de 1000mL mbar Agregar: Eosina Azur II.....1,3 g Glicerina...80,0 mL Calentar a 56C por 2 horas. Mezclar y enfriar. Agregar: Alcohol metlico absoluto170,0 mL Acetona170,0 mL b) Solucin May-Grunwald May-Grunwald0, 15 mL Alcohol metlico absoluto290,00 mL Acetona... ... 290,00 mL c) Solucin Giemsa stock - Combinar las dos soluciones previas (1: I vol:vol) d) Solucin de agua actica (pH 4,7) Acido actico glacial1 gota Agua destilada1000 mL e) Solucin trabajo Giemsa Solucin Giemsa stock..10 Solucin de agua actica...50 mL mL

1.2 Procedimiento: Desparafinizar e hidratar hasta agua Teir con solucin giemsa fresca por 1 hora Deshidratar en 3 cambios de alcohol absoluto Pasar por 3 cambios de xilol Montar con medio resinoso

1.3 Resultados: Citoplasma. ..........................................................................................................................rosado Ncleo ......................................................................................................................................azul Glbulos rojos ..........................................................................................................................rojo Bacterias...................................................................................................................................azul 2. Ziehl-Neelsen 2.1 Soluciones:

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a) Solucin Ziehl-Neelsen Carbol-Fucsina Cristales de fenol ......2,5 mL Alcohol etlico absoluto ........5,0 mL Fucsina bsica ......... .0,5 g Agua destilada.........50,0 mL Filtrar antes de usar b) Solucin alcohol cida 1% Acido clorhdrico ............................................................................................................. 1,0 mL Alcohol etlico corriente (70%).......99,0 mL c) Solucin Azul de Metileno stock Azul de metileno......... .1,4 g Alcohol etlico 95% ......100,0 mL d) Solucin Azul de Metileno de trabajo Azul de metileno stock10 ....... mL Agua corriente.90 ....... mL

2.2 Procedimiento: Desparafinizar e hidratar a agua. Agregar solucin de Ziehl Neelsen Carbol Fucsina a la lmina y calentar con el mechero hasta que solucin en la lmina humee. Repetir por 3 veces. Enfriar. Lavar con agua. Decolorar con solucin alcohol cido 1% hasta que las secciones estn de color rosado plido. Lavar con agua por 8 minutos. Contrastar con azul de metileno (solucin de trabajo). Las secciones deben verse azul plido. - Lavar con agua de cao. Deshidratar y aclarar. Montar con medio resinoso.

2.3 Resultados: Bacilos alcohol cido resistentes.rojo brillante Glbulos rojosnaranja amarillo Otros elementos tisulares......azul 3. Gram 3.1 Soluciones a) Solucin cristal violeta 1% Cristal Violeta .. 1,0 g Agua destilada................100,0 mL b) Solucin Fucsina bsica 1 %: Fucsina bsica1,0 g

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Agua destilada........100,0 mL c) Solucin yodo de Gram: yodo1,0 g Yoduro de Potasio..2,0 g Agua destilada .. 300,0 mL

d) Solucin de diferenciacin de Gallego: Formol 37%..2,0 mL Acido actico glacial.1,0 mL Agua destilada100.0mL e) Solucin cido pcrico-Acetona: Acido pcrico..1,0g Acetona...100,0 mL

t) Solucin Acetona-Xilol Partes iguales de acetona y xilol.

3.2 Procedimiento: Desparafinizar e hidratar hasta agua. Colocar en cristal Violeta 1% por 1 minuto. Lavar con agua de cao. Colocar en solucin yodo de Gram por 1 minuto. Lavar con agua de cao. Decolorar en acetona hasta que el background sea claro. Lavar con agua de cao. Colocar en solucin de Fucsina bsica 1% por 5 minutos. Lavar con agua de cao. Colocar en solucin de diferenciacin Gallego por 2 cambios, 1 minuto cada uno. Lavar. Transferir a plato de tincin. Tratar con acetona por 30 segundos. Colocar en solucin de Acido pcrico-acetona por 2 a 3 minutos. Colocar en solucin acetona-xilol por 2 veces. Aclarar en xilol por 2 veces. Montar.

3.3 Resultados Bacterias Gram (+) .............................................................................................................. azul Bacterias Gram (-) ................................................................................................................rojo Background....................................................................................................................amarillo 4. Plata Metenamina de Grocott 4. I Soluciones a) Acido crmico 4%: Acido crmico .4,0 g

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Agua destilada.100,0 mL b) Nitrato de plata 5%: Nitrato de plata5,0 g Agua destilada.100,0 mL e) Tiosulfato de sodio 5%; Tiosulfato de sodio..5,0 g Agua destilada.100,0 mL d) Metenamina 3%: Metenamina.3,0 g Agua destilada.100,0 mL e) Borax 5% Borax...5,0 g Agua destilada.100,0 mL f) Solucin stock Nitrato Plata-Metenamina: Nitrato de Plata 5%.5,0 Metenamina 3%..100,0 g) Solucin de trabajo Nitrato plata-metenamina: Solucin stock Nitrato de Plata-Metenamina...25,0 mL Borax 5%2,0 mL Agua destilada...25,0 mL Preparar fresco previo al uso. No usar si est turbio. h) Bisulfito de Sodio 1 %: Bisulfito sodio....... ..1,0 g Agua destilada.100,0 mL i) Cloruro de Oro 0,1%: Solucin Cloruro de Oro 1% .............................................................................................. 10,0 mL Agua destilada .................................................................................................................... 90,0 mL j) Verde claro 0,2% stock: Verde claro SF ..........................................................................................................................0,2 g Agua destilada ................................................................................................................... 100,0mL Acido actico glacial.............................................................................................................. 0,2mL k) Verde claro solucin de trabajo Verde claro stock ................................................................................................................... 10 mL Agua destilada ....................................................................................................................... 50 mL 4.2 Procedimiento Desparafinizar e hidratar a agua. mL mL

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*-

Colocar en cido crmico 4% por l hora. Lavar con agua de cao. Colocar en solucin bisulfito de sodio por l minuto. Lavar con agua de cao 5 a 10 minutos. Luego 3 a 4 veces por agua destilada. Colocar en solucin de trabajo Nitrato Plata-Metenamina en horno a 60 por 60 minutos. Lavar por 6 en agua destilada. Colocar en solucin cloruro de oro por 2 a 5 minutos. Lavar en agua destilada. Colocar en solucin tiosulfato sodio por 2 a 5 minutos. Lavar en agua de cao. Contrastar con solucin de trabajo de verde claro por 30 a 45 segundos. Deshidratar y aclarar. Montar.

4.3 Resultados: Hongos ........................................................................................................Bien marcados en negro Mucina .............................................................................................................................. gris negro Micelios e hiras ............................................................................................................... gris rosado Background ............................................................................................................................. Verde 5. Acido Perydico Schiff (PAS) 5.1 Soluciones a) Solucin Acido perydico 0.5%: Acido peridico......................................................................................................................... 0,5 g Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL b) Solucin Acido clorhdrico 1 N: Acido clorhdrico P.A. 37% .................................................................................................83,5 mL Agua destilada....................................................................................................................916,5 mL c) Reactivo de Coleman Schiff: Fucsina bsica ........................................................................................................................... 1,0 g Agua destilada a 60C........................................................................................................200,0 mL - Llevar a ebullicin. - Enfriar y agregar: Acido clorhdrico 1N .........................................................................................................10,0 mL - Dejar 24 horas y agregar: Carbn activado ...................................................................................................................... 0,5 g Agitar por l minuto, filtrar hasta que la solucin sea incolora. Guardar en refrigeradora. 5.2 Procedimiento Desparafinizar e hidratar hasta agua. Agregar Solucin Acido perydico por 5 minutos. Lavar con agua destilada. Colocar el reactivo de Coleman Schiff por 15 minutos. Lavar en agua de cao tibia por 10 minutos. Contrastar con Hematoxilina Mayer por 15 minutos o Harris por 6 minutos. Lavar en agua de cao por 15 minutos. Deshidratar y aclarar. Montar.

5.3 Resultados:

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Glicgeno, mucina, algunas membranas basales...rojo a prpura Hongos..rojo a prpura Ncleo..Azul 6. Tricrmica de Masson 6.1 Soluciones a) Solucin de trabajo Hematoxilina frrica (Weigert): Solucin A stock: Hematoxilina............................................................................................................................. 1,0 g Alcohol etlico 95% ...........................................................................................................100,0 mL Solucin B stock: Cloruro frrico 29% .................................................................................................................. 4,0 g Agua destilada......................................................................................................................95,0 mL Acido clorhdrico concentrado...........................................................................................100,0 mL Es reusable por 2 semanas. b) Solucin Biebrich Escarlata-Fucsina Acida: Biebrich escarlata 1% acuosa...............................................................................................90,0 mL Fucsina cida 1% acuosa......................................................................................................10,0 mL Acido actico glacial..............................................................................................................1,0 mL c) Solucin Fosfomolbdico-Acido fosfotngstico: Acido fosfomolbdico ............................................................................................................... 5,0 g Acido fosfotngstico ................................................................................................................. 5,0 g Agua destilada....................................................................................................................200,0 mL

d) SOlllcill a:1I1 allililla: Al.u I ani li na ........................................................................................................................... 2,5 g Acido actico glacial..............................................................................................................2,0 mL Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL e) Solucin Acido actico 1 %: Acido actico glacial..............................................................................................................1,0 mL Agua destilada......................................................................................................................99,0 mL 6.2 Procedimiento Desparatinizar e hidratar a agua destilada. Teir con solucin Hematoxilina frrica por 10 minutos. Lavar en agua de cao por 10 minutos. Enjuagar en agua destilada. Teir con solucin fucsina cida-Biebrich escarlata por 15 minutos. Guardar la solucin. Enjuagar en agua destilada. Diferenciar con solucin Acido fosfomolbdico-fosfotngstico por 15 minutos. Contrastar con solucin azul anilina por 5 a 10 minutos o solucin verde claro por l minuto. Guardar la solucin. Enjuagar en agua destilada. Si se usa azul anilina, diferenciar con agua actica 1 % por 3 a 5 minutos. Si se usa verde claro, diferenciar con solucin de cido fosfotngstico 5% por 15 minutos. Deshidratar y aclarar. Montar.

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6.3 Resultados: Ncleo...................................................................................................................................... negro Msculo, citoplasma, queratina...................................................................................................rojo Colgeno ........................................................................................................................azul o verde 7. Coloracin de Van Gieson para fibras colgenas 7.1 Soluciones a) Hematoxilina Frrica de Weigert (Ver 6.1) h) Solucin de Picrofitcsin{{ de \;(11/ Gicso/l Fucsina cida (C.I. 42685) solucin acuosa 1%................................................................................................................2,5 mL Solucin acuosa saturada de cido pcrico (C.I. 10305) ................................................................................................... 97.5 mL

7.2 Procedimiento Desparafinar, hidratar y enjuagar con agua destilada. Colorear en solucin de hematoxilina de Weigerth por 10 minutos. Lavar con agua destilada. Contracolorear en solucin de Van Gieson por I a 3 minutos. Deshidratar y aclarar. Montar en Permount o balsamo. Aadir 3 gotas de solucin alcohlica saturada con cido pcrico para cada 50mL de xilol usado como aclarador. Montar en xilol acidificado. Esto intensifica el fondo y evita que las secciones se decoloren.

7.3 Resultados Colgeno .....................................................................................................................................rojo Msculo, epitelio cornificado...............................................................................................amarillo Ncleo........................................................................................................................... azul o negro 8. Coloracin de Gomori para reticulina 8.1 Soluciones a) Solucin de plata amoniacal: Para 10 mL de solucin de nitrato de plata al 10% y 2,0 a 2,5 mL de una solucin acuosa de hidrxido de potasio al 10%, aadir agua amoniacal al 26 al 28%, gota a gota, hasta que el precipitado resultante desaparezca sin dificultad al agitar la solucin. Llevar la solucin con agua destilada hasta dos veces su volumen. Usar vidrio limpio de cido. b) Solucin de Permanganato de Potasio: Solucin de permanganato de Potasio....................................................................................... 0,5 g Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL c) Solucin de Metabisulfito de Potasio: Metabisulfito de Potasio............................................................................................................ 2,0 g Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL

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d) Solucin de sulfato de amonio frrico: Sulfato de amonio frrico.......................................................................................................... 2,0 g Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL e) Solucin de formol: Solucin de formaldehdo ....................................................................................................20,0 mL Agua destilada......................................................................................................................80,0 mL t) Solucin de Cloruro de Oro: Solucin stock de Cloruro de Oro........................................................................................20,0 mL Agua destilada......................................................................................................................80,0 mL g) Solucin de tiosulfito de sodio: Tiosulfito de sodio .................................................................................................................... 2,0 g Agua destilada....................................................................................................................100,0 mL 8.2 Procedimiento Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. Oxidar en solucin acuosa de permanganato de potasio al 0,5% por l minuto. Lavar en agua corriente por 2 minutos. Diferenciar con solucin acuosa de metabisulfito de potasio por l minuto. Lavar en agua corriente por 2 minutos. Sensibilizar en solucin de sulfato de amonio frrico al 2% por un minuto. Lavar cn agua corriente por 2 minutos; seguido con 2 cambios de agua destilada por 30 segundos cada vez. Impregnar en la solucin de plata por un minuto. Enjuagar en agua destilada por 20 segundos. Reducir por 3 minutos en formol al 20%. Lavar en agua corriente por 3 minutos. Tonificar en solucin de cloruro de oro al 0,2% por 10 minutos. Usar vaso de Coplin. Enjuagar en agua destilada. Reducir la tonificacin en una solucin de metabisulfito de Potasio al 2% por 1minuto. Fijar en solucin de tiosulfato de sodio al 2% por 1 minuto. Lavar en agua corriente por 2 minutos. Deshidratar y montar en Permount.

8.3 Resultados: Fibras reticulares ...................................................................................................................... negro

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ANEXO 4 SOLUCIONES EN INMUNOHISTOQUIMICA

1. Perxido de Hidrgeno 3% en Metanol: Solucin perxido hidrgeno 30%.........................................................................................3,0 mL Metanol absoluto..................................................................................................................97,0 mL Preparar solucin diariamente. 2. Buffer PBS (Fosfato Buffer Salino) pH 7,3 - 7,4 Fosfato de potasio di bsico en cristales ................................................................................. 8,50 g Cloruro de Sodio ..................................................................................................................... 7,20 g Fosfato de Sodio monobsico ................................................................................................. 1,32 g Agua destilada................................................................................................................1000,00 mL 3. Diaminobencidina (DAB) 3' 3 Diaminobencidina .............................................................................................................. 0,1 g PBS ....................................................................................................................................200,0 mL Perxido de Hidrgeno 30% ..................................................................................................0,2 mL

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Esta publicacin se trmino de imprimir en Diciembre de 1997 en los Talleres Grficos de Art. Lautrec S.R.Ltda. Av. Paseo de la Repblica 731 - Lima 13 Tel/Fax: 423-7616

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