PROCEDIMIENTO RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS NORMA ISO 7954 Seccin Microbiologa Alimentos 1. OBJETIVO PRT- 712.

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Conocer el nmero de Mohos y Levaduras que contiene un alimento. 2. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

Este procedimiento se aplica a todos los alimentos de consumos humano o animal en los cuales el ambiente es menos favorable para el crecimiento bacteriano por ej pH <5, baja humedad, aw (0.75), alto contenido en sal o azcar, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibiticos o exposiciones a irradiacin. 3. FUNDAMENTO

Los hongos son generalmente aerobios estrictos, en cambio las levaduras pueden crecer con o sin oxgeno; en presencia de ste crecen mejor. Las levaduras crecen ms rpido que los hongos. Existen varios medios de cultivo recomendados para alimentos, para reducir el crecimiento bacteriano, algunos utilizan valores de pH bajos (4), otros la adicin de antibiticos como por ejemplo penicilina + estreptomicina, cloramfenicol, clortetraciclina, oxytetraciclina o gentamicina. 4. 4.1 REFERENCIAS Norma ISO 7954. Microbiology- General Guidance for enumeration of yeasts and moulds- Colony count technique al 25C. First edition 1987.

PROCEDIMIENTO RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS NORMA ISO 7954 Seccin Microbiologa Alimentos 5. 5.1 6. 6.1 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.2 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.3 6.3.1 6.3.2 6.3.3 6.3.4 7. 7.1 7.1.1 7.1.2 7.1.3 TERMINOLOGA No Aplica MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS MATERIALES Tubos 16x160 mm. Placas de Petri Pipetas bacteriolgicas de 1 mL EQUIPOS PRT- 712.02-031

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Bao de agua termorregulado a 47C 2 C para mantener el agar fundido. Estufa de incubacin regulada entre el rango de 22C a 25 C (24C 1C). Cuenta colonias modelo Quebec MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVOS Agar Cloranfenicol- dextrosa- extracto de levadura (cloranfenicol puede ser reemplazado por oxitetraciclina). Solucin de Cloranfenicol u Oxitetraciclina al 0,1%. Agua de dilucin: Solucin de agua peptonada al 0,1 % o Agua buffer fosfato. Reactivos Tincin de Gram o Reactivos para Tincin Simple. DESARROLLO SIEMBRA Preparar la muestra por uno de los mtodos recomendados en el PRT-712.01-002. Pipetear por duplicado a placas Petri estriles alcuotas de 1 mL de la muestra si es producto lquido o 1 mL de la dilucin 10-1 en el caso de otros productos. Sembrar por lo menos dos diluciones consecutivas por duplicado.

PROCEDIMIENTO RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS NORMA ISO 7954 Seccin Microbiologa Alimentos 7.1.4 7.1.5 7.1.6 7.1.7 7.1.7.1 7.1.7.2 7.1.7.3 7.1.7.4 7.1.8 7.1.9 PRT- 712.02-031

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Se recomienda esta serie de diluciones cuando no se conoce el rango aproximado de microorganismos. Agregar 15 mL de agar fundido y temperado a 47C 2C. El tiempo transcurrido entre la preparacin de la suspensin inicial y el momento de agregar el agar no debe exceder de los 15 min. Mezclar el inculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operacin sera la siguiente: Mover la placa con movimientos de vaivn 5 veces en una direccin, hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj, mover con movimientos de vaivn en una direccin que forme ngulo recto con la primera y hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj. Una vez solidificado el agar, NO INVERTIR las placas. Incubar a 22 - 25C durante 3 a 5 das.

7.1.10 Realizar controles de ambiente, medio de cultivo y diluyente. Anotar resultados en registros cdigo RG-712.00-010. 7.2 7.2.1 LECTURA Tomar todas las precauciones necesarias al manipular las placas Petri, para evitar la contaminacin del rea de trabajo. Las esporas de los mohos se dispersan con gran facilidad. Usar un cuenta colonias y contar las placas que contengan menos de 150 colonias. Si parte de la placa presenta desarrollo excesivo de hongos, o si es difcil contar colonias aisladas en menos tiempo, registrar los recuentos obtenidos y registrar el perodo de incubacin, ya sea tres o cuatro das e incluirlo en el informe final. No contar las placas antes de 3 das de incubacin, la manipulacin podra provocar colonias secundarias por dispersin de esporas. 7.2.4 Contar las colonias de mohos las que se presentan bajo una forma filamentosa caracterstica (micelio) de color variable. Estas se desarrollan ms tardamente que las levaduras. Anotar resultados en RG-712.00-023.

7.2.2 7.2.3

PROCEDIMIENTO RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS NORMA ISO 7954 Seccin Microbiologa Alimentos 7.2.5 PRT- 712.02-031

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Contar las colonias de levadura por separado. Las colonias de levaduras se presentan en forma de colonias opacas, blancas o amarillas. Anotar resultados en RG-712.00-023.

7.2.6

Realizar Tincin de Gram segn IT-712.00-066 o microscopa al fresco (IT-712.00081) a las colonias sospechosas de levaduras para confirmar su presencia. Anotar el resultado en el registro cdigo RG-712.00-023 CALCULO El nmero de Mohos y Levaduras por gramo o mL de alimento se determina segn la siguiente frmula :

7.3 7.3.1

N=

C [ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d

donde : N = nmero de colonias por ml o g de producto C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas n1 = nmero de placas contadas de la menor dilucin. n2 = nmero de placas contadas de la dilucin consecutiva. d = dilucin de la cul fue obtenido el primer recuento

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7.4 7.4.1 7.4.2

EXPRESION DE RESULTADOS Se informa Recuento de Mohos por gramo o mL de alimento y Recuento de Levaduras por gramo o mL de alimento. Aproximar el resultado a dos cifras significativas. Si el tercer dgito es 6, 7, 8 o 9 adicionar una unidad al segundo dgito. Si el tercer dgito es 1, 2, 3 o 4 considerar solamente los dos primeros dgitos. Cuando el tercer dgito es 5, agregar una unidad al segundo dgito si este es impar y mantener el segundo dgito si este es par. Usar ceros para los dems dgitos hacia la derecha. i todas las placas de ambas diluciones no presentan crecimiento o desarrollo, informar como menor de uno por el valor recproco de la dilucin menor por g o mL. < 1 x 1/ dm , donde dm = menor dilucin

7.4.3

8.

REGISTROS Almacenamiento Proteccin Recuperacin Tiempo retencin y disposicin Acceso Papel 5 aos y restringido a disposicin en personal basura normal Seccin partidos en trozos. Microbiologa. 5 aos y disposicin en basura normal partidos en trozos. 5 aos y disposicin en basura normal partidos en trozos.

Identificacin del registro Registro control de ambiente, RG712.00-009.

Archivador verde Registros Laboratorio N346 Seccin Microbiologa Alimentos y Agua. Registro control de Archivador verde Acceso Papel esterilidad de medios Registros restringido a de cultivo utilizados Laboratorio N346 personal en el anlisis Seccin Seccin Laboratorio 346, Microbiologa Microbiologa. RG-712.00-010. Alimentos y Agua. Registro anlisis de Archivador azul Acceso Papel muestras de Registros de restringido a alimentos y agua Lecturas e informes personal Laboratorio de de resultados Seccin

PROCEDIMIENTO RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS NORMA ISO 7954 Seccin Microbiologa Alimentos Identificacin del registro Recuentos RG712.00-023. Almacenamiento PRT- 712.02-031

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Proteccin

Recuperacin Tiempo retencin y disposicin

Laboratorio Microbiologa. Recuento aerobios mesfilos, S.aureus, Mohos y levaduras Seccin Microbiologa Alimentos y Agua.

9.

TABLA DE MODIFICACIONES Motivo del cambio Se elimina pgina 1 por cambio en formato documento institucional. Se cambi formato del encabezado de pgina en todo el documento. Se corrige PRT-702.02-031 por PRT712.02-031. Se cambi nmero de revisin por 1 por revisin N 2 y el total de pginas. Fecha Aprobacin

Revisin N Pg. Modificada 1 1 1 1

1 1 1 1

2 2 2 2

En el punto 2.0 se elimin el ltimo prrafo. Se deja pie de pgina slo en pgina 1 y se actualizan los cargos. Se elimin el ltimo prrafo del punto 3.0 Se cambia referencia 4.1 Standard Methods for examination of Dairy products por: Norma ISO 7954 Microbiology- General guidance for enumeration of yeasts and mouldsColony count technique al 25C. First

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Motivo del cambio edition 1987.

Fecha Aprobacin

Se eliminan las referencias 4.2 al 4.6. Se cambian los puntos 6.1.1 y 6.1.2 por: Tubos 16x160 mm y por Placas de Petri respectivamente. En el punto 6.2.1 se cambia:...50C ...por: ... 47C 2 C... En el punto 6.2.2 se agrega: ... entre el rango de 22C a 25 C ( 24C 1C). El punto 6.1.1 se cambi Agar Oxitetraciclina Extracto de levadura Glucosa-Agar (OGY) (ICMSF) por: Agar Cloranfenicol- dextrosa- extracto de levadura (cloranfenicol puede ser reemplazado por oxitetraciclina). En el punto 6.3.2 se remplaz la frase por: Solucin de Cloranfenicol u Oxitetraciclina al 0,1%. En el punto 6.3.3 se reemplaz la frase por: Agua de dilucin: Solucin de agua peptonada al 0,1 % o Agua buffer fosfato. Se agreg el punto 6.3.4 se incluy: ... o Reactivos para Tincin Simple. En el punto 7.1.1 se cambi 702.00-004 por: PRT-712.01-002. En el punto 7.1.2 se agreg: ...de la muestra si es producto lquido o 1 mL de -1 la dilucin 10 en el caso de otros productos. Se cambi punto 7.1.3 por: Sembrar por lo menos de diluciones consecutivas por duplicado.

1 1 1

3 3 3

1 1

3 3

1 1

3 3

PROCEDIMIENTO RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS NORMA ISO 7954 Seccin Microbiologa Alimentos Revisin N Pg. Modificada 1 1 1 1 1 3 3 4 4 4 PRT- 712.02-031

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Motivo del cambio Se trasladan de posicin los nmeros correlativos. En el punto 7.1.3 se cambi ....10 mL por 15 mL y 50C 1C por 47C 2C En el punto 7.1.4 se cambi las vietas de letras a,b,c,d por los nmeros: 7.1.7.1 al 7.1.7.4 . Se incluy el punto 7.1.6 al 7.1.10 En el punto 7.2.2 se cambi entre 10 -150 por: ...menos de 150. Se agreg un punto, cambiando el punto 7.2.3 por: Si parte de la placa presenta desarrollo excesivo de hongos, o si es difcil contar colonias aisladas en menos tiempo, registrar los recuentos obtenidos y registrar el perodo de incubacin , ya sea tres o cuatro das e incluirlo en el informe final. Se cambian de posicin los nmeros correlativos. En el punto 7.2.3 se cambi RG-702-00023, por: RG-712.00-023 En el punto 7.2.4 en el prrafo despus del punto a parte, se cambi RG-702-00023 por : RG-712.00-023 En el punto 7.2.5 se cambi IT-702.00066 por: IT-712.00-066 , RG-702-00023 por : RG-712.00-023 Se asigna el punto 7.4.1 y se agregaron los puntos 7.4.2 y 7.4.3. En el punto 8.0 RESPONSABLES se cambi por REGISTROS y sus temes. Se incluy tabla de registros. Se eliminaron los temes de responsables.

Fecha Aprobacin

1 1 1 1 1

4 4 4 5 5

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Motivo del cambio El punto 9.0 Distribucin se cambi por: TABLA DE MODIFICCAIONES. Se agreg el punto 10. ANEXOS y sus temes. Al ttulo se le agreg la palabra CLORANFENICOL A la frmula se le agreg la explicacin del asterisco( *) Se agregaron 2 puntos en la preparacin del medio.

Fecha Aprobacin

10. ANEXOS 10.1 Anexo N 1 Recuento Mohos y levaduras, Tcnica recuento en placa por siembra en profundidad. 10.2 Anexo N 2 Generalidades. 10.3 Anexo N 3 Agar cloranfenicol (oxitetraciclina)-Extracto de Levadura- Dextrosa. 10.4 Anexo N 4 Hoja registro de resultados de anlisis RAM, S.aureus, Mohos y Levaduras en muestras de alimentos y agua.

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ANEXO N 1 RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS TECNICA RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
1 mL HOMOGENEIZADO:

9 mL AP 10 g muestra

90 mL Agua peptonada 0.1% Dil 10 -1 10 -2 SIEMBRA : 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

10 -3

1 mL

1 mL

Agar OGY INCUBACION: LECTURA PLACAS : 22-25 C placas no invertidas por 5 das Lectura de placas que contengan entre 10 a 150 ufc

Colonias levaduras

Colonia mohos , (micelio)

CONFIRMACION :

Tincin de Gram

Formas alargadas o cocceas Gram positivas

CLCULO RTO LEVADURAS: CALCULO RTO MOHOS: INFORME

Hacer el clculo segn N de colonias confirmadas por Gram, por la dilucin Hacer el clculo segn N de colonias contadas por la dilucin Informar como N de UFC mohos/g o mL de producto Informar como N de UFC levaduras/g o mL de producto

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ANEXO N 2
GENERALIDADES Los hongos y levaduras son fcilmente encontrados en alimentos en los cuales el ambiente es menos favorable para el crecimiento bacteriano por ej bajo pH 5 o <5, baja humedad, aw (0.75), alto contenido en sal o azcar, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de de antibiticos o exposiciones a irradiacin. Causan deterioro de estos alimentos si son almacenados en condiciones deficientes, como por ejemplo (frutas frescas, jugos de fruta, vegetales, quesos, cereales, picles y alimentos deshidratados o congelados, decoloracin de las superficies de los alimentos, olores y sabores extraos. Habra que sumar al deterioro, el peligro potencial de produccin de micotoxinas, producidas por algunas especies de hongos. Si estas sustancias son ingeridas causan intoxicacin alimentaria. Para eliminar o reducir tales problemas en los alimentos susceptibles se debera: a) Reducir la carga de esporas con buenas prcticas de higiene. b) Consumo rpido de los alimentos preparados c) Guardar los alimentos congelados a-12 C d) Eliminar o reducir el contacto con el aire e) Calentar los alimentos antes de envasarlos para destruir clulas vegetativas y esporas. f) Agregar cidos que eviten el crecimiento. g) Agregar preservantes qumicos, tales como sorbatos o benzoatos. Ningn ser humano ni animal puede consumir alimentos que estn visiblemente contaminados por hongos, excepto los alimentos fabricados con algunas especies de hongos que le dan su sabor caracterstico, como por ejemplo queso roquefort, cammembert o ciertos salames. Las levaduras crecen ms rpido que los hongos, pero generalmente crecen en conjunto. Los hongos son generalmente aerobios estrictos, en cambio las levaduras pueden crecer con o sin oxgeno; en presencia de ste crecen mejor. En alimentos frescos y congelados, el encontrar un nmero bajo de esporas de hongos y levaduras es poco significativo; pero si el alimento est altamente contaminado su consumo puede resultar peligroso.

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Existen varios medios de cultivo recomendados para alimentos, para reducir el crecimiento bacteriano, algunos utilizan valores de pH bajos (4), otros la adicin de antibiticos como por ejemplo penicilina + estreptomicina, cloramfenicol, clortetraciclina, oxytetraciclina o gentamicina. La Gentamicina se recomienda para controlar el crecimiento de bacterias Gram negativas y es bastante efectiva en productos crneos enfriados. El agar Rosa de Bengala retarda el crecimiento de hongos que normalmente forman abundante micelio areo, tales como Neurospora y Rhizopus y es inhibitorio para algunas levaduras. Se recomienda usar preferentemente el agar con antibitico ya que su selectividad y especificidad son superiores a las del agar acidificado. En cuanto a la temperatura de incubacin la recomendada por dar mejor resultado es de 22C por 5 das.

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ANEXO N 3 AGAR CLORANFENICOL (OXITETRACICLINA)-EXTRACTO DE LEVADURA-GLUCOSA Frmula Extracto de levadura Glucosa Cloranfenicol Agar Agua destilada 5 20 0,1 20 g g g* g

1000 ml

* obtener una concentracin final de 100g / mL de medio.

Pesar segn lo indica el fabricante y adicionar 1 L de agua destilada. Calentar ligeramente para su completa disolucin Enfriar y medir el pH del, medio de cultivo 6,6 0,2 con electrodo de contacto. Dispensar 100 ml en frasco con tapa rosca. Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 minutos. Si reemplaza el cloranfenicol por oxitetraciclina, debe preparar el medio como se indica arriba, pero omita el cloranfenicol. Dispensar en cantidades de 100 mL y esterilice. Preparar a parte la oxitetraciclina al 0,1 % (m/m) en agua destilada y esterilice por filtracin. Justo antes de usar el medio aada 10 mL de la solucin a 100 mL del medio base el que ha sido mantenido fundido a 47C 2C. Despus de la adicin del antibitico, no debe someterse el medio a altas temperaturas.

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SOLUCION DE OXITETRACICLINA

Disolver 0,1 g de oxitetraciclina en 100 ml de agua destilada. Esterilizar por filtracin. Esta solucin se puede refrigerar hasta 5 das. En el momento de usar, aadir 10 ml de solucin de oxitetraciclina al 0,1% por 100 ml de agar previamente licuado y enfriado a 50C.