Chilling Injury Danos pelo frio Dano por congelamento A reduo da temperatura ambiente abaixo do ponto de congelamento do tecido

o pode resultar em dano por congelamento, uma disfuno com sintomas que incluem reas embebidas em gua no tecido, colapso e, ainda, ruptura da epiderme. Baixas temperaturas podem ocorrer no campo ou em situaes em que as temperaturas ambientais de armazenamento caem (em virtude de falha em termostatos de refrigerao) ou temperaturas extremamente baixas durante o transporte. A presena de slidos dissolvidos na clula reduz o ponto de congelamento do tecido vegetal abaixo do da gua pura. Essa depresso no ponto de congelamento, que funo da osmolaridade da soluo celular, de poucos C, sendo em geral, menor que 1C. Conhecer o modo pelo qual o congelamento ocorre em tecidos vegetais importante para o entendimento dos sintomas que ele pode desenvolver. Quando a temperatura dos tecidos cai abaixo do ponto de congelamento, os cristais de gelo no so imediatamente formados, pois existe uma capacidade substancial de super-resfriamento nos tecidos vegetais; por algum tempo, a soluo celular permanece lquida, mesmo que esteja abaixo do seu ponto de congelamento. Em muitas situaes, curtos perodos de exposio a condies de congelamento no danificao os tecidos, pois ele resfriar e reaquecer sem que se forme gelo. Em alguns casos, entretanto, o super-resfriamento pode ser devastador devido rapidez com que o gelo se forma quando a soluo superresfriada finalmente congela, tanto por exposio prolongada a baixa temperatura como por nucleao por vibrao. Se a nucleao ocorre antes que um super-resfriamento excessivo tenha ocorrido, cristais de gelo extracelulares sero formados no lquido da parede celular e em espaos livres. Nesta situao mais tpica, o crescimento de cristais de gelo na parede celular aumenta a diferena de presso de vapor atravs da membrana celular, e os cristais de gelo continuam a crescer custa do lquido das clulas, que pode tornarse plasmolisada. Esse tipo de congelamento nem sempre letal, dependendo dos efeitos da desidratao sobre a membrana plasmtica e do risco de perfurao das membranas quando os cristais de gelo crescem no espao deixado dentro da parede pelo citoplasma plasmolisado. Nesse processo ocorre secagem por congelamento natural, processo reduzindo o ponto de congelamento da soluo celular pelo aumento de sua osmolaridade, tornando, assim, o tecido mais resistente ao congelamento intracelular. Em tecidos com espaos intercelulares abundantes, cristais de gelo extracelulares podem ser formados ao se perturbar as clulas. No descongelamento, esses tecidos parecero, no incio, empapados em gua devido ao aumento do lquido nos espaos intercelulares, mas podem reabsorver gua, pois a membrana plasmtica ainda estar intacta. Dano por resfriamento A vida til de muitos frutos e vegetais pode ser estendida com a armazenagem a baixas temperaturas. A refrigerao ainda o mtodo mais econmico para o armazenamento prolongado de frutas e hortalias frescas. O armazenamento refrigerado visa minimizar a intensidade do processo vital dos vegetais, atravs da utilizao de condies adequadas que permitam reduo em seu metabolismo normal, sem alterar seus processos fisiolgicos. De uma forma geral, a cada 10C na reduo da temperatura tem-se uma atividade respiratria de duas a trs vezes menor, e consequentemente um aumento da longevidade do produto sob estocagem. Contudo, a maioria das espcies vegetais de origem tropical ou subtropical e, ainda, algumas de origem temperada, mostram sintomas de uma disfuno chamada dano pelo frio (DF) ou chilling injury, se forem expostas a temperaturas abaixo de um valor crtico, mas ainda bem acima de seus pontos de congelamento. A extenso do DF depende da temperatura e do tempo de exposio, mas a exposio de um produto a uma temperatura inferior ao valor crtico por mais do que curtos perodos causa dano e diminuio da qualidade e vida til. O DF pode ocorrer no campo, durante o transporte, na comercializao, ou em casa; seu efeito prejudicial aditivo e acumulativo. A recuperao possvel a partir de exposies curtas a temperaturas potencialmente prejudiciais. Em alguns casos, o aquecimento intermitente durante o armazenamento pode ajudar a prevenir sintomas do DF, talvez por permitir a metabolizao ou a destoxificao de compostos txicos.

Essa disfuno, que se caracteriza pelo aumento da suscetibilidade a ataques por fungos, colapso e necrose de tecidos, encharque e morte, particularmente importante em produtos de origens tropical e subtropical. Outros sintomas do DF incluem descolorao da polpa, na ruptura de mas e peras em baixas temperaturas; descolorao vascular em abacates e bananas; depresses na superfcie e manchas escuras na epiderme em frutas ctricas, pepinos, pimentas e tomates; necrose de semente, em pimentas e tomates; falha no amadurecimento ou inibio do amadurecimento; colapso dos tecidos; acelerao da senescncia, aumentando a susceptibilidade a entrada de microrganismos; aumento da deteriorao por causa da diminuio da resistncia normal e qualidade reduzida (sabor e aparncia). A temperatura-limite para o DF caracterstica do produto, sendo essa a temperatura acima da qual no se observam danos, independentemente da extenso do perodo de armazenamento. As temperaturas-limite costumam estar na faixa entre 10 e 15C, mas podem variar entre temperaturas mais baixas e mais altas. No se sabe se existe um mecanismo bioqumico universal para o DF. O desenvolvimento dos seus sintomas costuma ser atribudo ao desequilbrio em reaes metablicas, resultando da subproduo de alguns metablitos essenciais e da superproduo de alguns metablitos que se tornam txicos ao tecido. Por exemplo, o acmulo de etanol, acetaldedo e cido oxaloactico est associado ao DF em algumas frutas. Logo que as temperaturas de resfriamento so sentidas pela clula, ocorre uma mudana drstica na estrutura citoplasmtica, sendo que a circulao citoplasmtica interrompida. A exposio prolongada a temperaturas reduzidas causa deslocamento profundo de fluxo dos filamentos citoplasmticos, quando os tecidos so reaquecidos. Esses eventos podem, ainda, ser de importncia crucial para os sintomas do DF. A incapacidade das clulas de transportar substratos, metablitos e molculas de controle poderia, facilmente, resultar em desequilbrio metablico e acmulo de intermedirios metablicos txicos. Dois grupos de conceitos foram elaborados para explicar o mecanismo da desordem pelo frio, o primeiro acredita que todas as espcies sensveis apresentam um nico tipo de resposta primria responsvel pelo desenvolvimento de eventos secundrios incluindo alteraes fisiolgicas e bioqumicas. O segundo acredita que a desordem pelo frio originada a partir de respostas mltiplas a baixa temperatura numa larga variedade de condies. O efeito primrio da temperatura s membranas das clulas vegetais sobre a fluidez de seus lipdeos. Esses so mais ou menos fluidos ou mveis sob temperaturas elevadas. Sob temperatura abaixo da crtica passam para um estado tipo gel e tornam-se imveis. Esse evento afeta as propriedades das membranas, particularmente das enzimas a elas associadas, e envolvidas na produo de energia e sntese protica. Na atualidade acredita-se que uma discreta poro lipdica sofre mudanas fsicas durante a exposio a baixas temperaturas, mas isso pode causar um desequilbrio fisiolgico. Essa alterao na membrana celular de lquida-cristalina para gel-slida causada pelo estresse por frio pode ser reversvel se o tempo de exposio ao frio for curto e pode ser irreversvel se o tempo de exposio for longo. Aps um perodo prolongado de exposio das espcies vegetais ao frio essa causa primria promoveria a perda de integridade das membranas, vazamento de solutos, perda de compartimentalizao, diminuio na taxa oxidativa da mitocndria, aumento na energia de ativao das enzimas associadas s membranas, paralisao do fluxo protoplasmtico, reduo no suprimento e utilizao de energia, diminuio na taxa fotossinttica, desorganizao da estrutura celular, disfuno do metabolismo, acmulo de substncias txicas e manifestao de uma grande variedade dos sintomas peculiares do tecido danificado. Os distrbios fsicos, por baixas temperaturas, s membranas, influenciam a atividades das enzimas ligadas a elas e a habilidade de manter o gradiente de clcio, que tem papel de mensageiro secundrio em vrios processos fisiolgicos e bioqumicos. Baixas temperaturas tambm estimulam a produo de etileno, promovem o aumento ou decrscimo na respirao e induzem modificao marcante no metabolismo de poliaminas e na produo de oxignio reativo. Os danos produzidos por congelamento so diferentes dos produzidos por injuria por frio. Enquanto que no congelamento ocorre a formao de cristais de gelo, que causam danos fsicos s clulas, a injria por frio danifica inicialmente a epiderme da casca e ento uma srie de reaes so iniciadas, incluindo a produo de etileno, o acumulo de compostos txicos, reduo da fotossntese aumento da respirao e alteraes das estruturas celulares. Estes sintomas, no so somente devido injria por frio, mas tambm dependem da maturidade das frutas colhidas, da durao da exposio dos produtos s temperaturas baixas,

bem como do uso ou no de embalagens protetoras nas frutas quando armazenadas em temperaturas abaixo da crtica. Por outro lado, acredita-se que o escurecimento dos vegetais submetidos baixas temperaturas deve estar relacionado com a ao da enzima polifenoloxidase sobre os compostos fenlicos liberados do vacolo, por ocasio da ocorrncia da injuria e o amolecimento est relacionado com as enzimas que degradam as substncias pcticas da parede celular. Diferenas de sensibilidade trmica de importantes enzimas reguladoras, como a fosfofrutoquinase podem estar relacionadas ao DF. Devido ao papel crtico que a regulao dessas enzimas exerce no ajuste do metabolismo geral, pode-se inferir que seu funcionamento inadequado tambm seria uma causa dos sintomas do DF. As plantas previnem e/ou dissipam continuamente a formao de espcies reativas de oxignio, incluindo nions superxido (O2-), ons hidroxil (OH), oxignio singlete (O2) e perxido de hidrognio (H2O2). As espcies reativas de oxignio podem danificar alvos celulares fundamentais, como DNA, lipdeos e protenas. A peroxidao de lipdeos da membrana, que costuma ser observada em plantas expostas ao estresse de resfriamento, tambm podem estar envolvidas no desenvolvimento do DF. Plantas sensveis ao frio podem ser incapazes de mobilizar defesas antioxidantes ou sistemas de reparo enzimtico quando expostas a temperaturas inferiores ao limite crtico. Para reduzir os danos causados pelo frio, tcnicas alternativas vem sendo utilizadas. Essas tcnicas reduzem os danos por meio do retardamento do desenvolvimento dos sintomas ou pelo aumento da tolerncia do produto ao frio. O tratamento trmico aplicado antes da refrigerao, na forma de condicionamento, ou durante o armazenamento refrigerado, na forma de aquecimento trmico, e atmosfera controlada podem ser utilizados, porm altas temperaturas geralmente na faixa de 35C a 45C podem prejudicar o amadurecimento, reduzir a vida til e a qualidade de frutas e hortalias. O condicionamento trmico consiste em expor as frutas a temperaturas moderadas (15 a 25C) ou elevadas (37 a 53C), por curtos perodos, antes de refriger-los. Esse tratamento tem reduzido os danos causados pelas baixas temperaturas e diminudo a incidncia de podrides em frutas ctricas. A resistncia ao DF induzida por alta temperatura pode ser relacionada ao redirecionamento da sntese protica, no sentido da sntese de protenas de choque trmico, podendo proteger as frutas do DF pela reduo da sntese de outras protenas induzidas por estresse. Em seu papel como chaperonas moleculares, as protenas de choque trmico tambm podem ajudar a proteger outras protenas da ruptura do dobramento, desdobramento, aglomerao ou desarranjo, induzido-os pelo frio. J o aquecimento intermitente consiste na interrupo da baixa temperatura de armazenamento por um ou mais perodos, nos quais o produto submetido a temperaturas altas (> 25C) ou moderada temperatura (15 a 25C), retornando posteriormente temperatura baixa de estocagem. Esse tratamento deve ser realizado antes de os danos tornarem irreversveis, variando de acordo com o alimento. As respostas dos frutos submetidos ao aquecimento intermitente podem ser: o aumento da atividade metablica durante o aquecimento, que permite ao tecido do fruto metabolizar o excesso de substncias txicas acumulada durante o resfriamento; a restaurao de possveis danos ocorridos nas membranas, organelas ou rotas metablicas durante o resfriamento; o restabelecimento de alguma substncia que foi esgotada ou impedida de ser sintetizada durante o resfriamento; e o aumento da sntese de cidos graxos polinsaturados, que protegem as membranas dos danos devidos ao resfriamento. Assim, o dano pelo frio pode ser evitado em muitos tecidos se eles retornarem para uma temperatura elevada antes que ocorram mudanas degenerativas no produto. Outras tcnicas usadas para a reduo do DF incluem o armazenamento em atmosfera controlada (AC), em especial com CO2 elevado, e a infiltrao da fruta com Ca2+, a vcuo, ambos os mtodos reduzem de modo significativo o desenvolvimento de DF. Aparentemente, essas tcnicas tratam os sintomas do DF mais do que a causa primria, uma vez que o CO2 inibe a ao do etileno e tanto AC como Ca2+ tendem a diminuir a deteriorao metablica, que, por esse motivo, os incluiria naqueles envolvidos no desenvolvimento de disfunes por DF. A atividade da peroxidase, invertase e celulase na casca da fruta aumentam, e a atividade da amilase diminui durante o desenvolvimento do sintoma de injuria por frio. A atmosfera controlada e de inibidores de senescncia so alternativas para manter a qualidade de produtos vegetais sensveis ao chilling.

Alm das tcnicas citadas acima, temos tambm como tratamentos que reduzem os danos causados pelo frio o pr-armazenamento, o tratamento com clcio e etileno, o armazenamento hipobrico, a aplicao de cera, as diferentes embalagens, e a manipulao gentica. Os produtos minimamente processados aparentam ter uma maior tolerncia para o chilling injury. Uma possvel explicao para este fato que a sua maior perecibilidade reduz a vida de prateleira, por causa da ocorrncia de doenas e da senescncia dos tecidos antes do surgimento dos sintomas tpicos do dano pelo frio. Alm disso, frutas e hortalias minimamente processadas so quase totalmente manuseadas em condies de atmosfera modificada. Existem vrios relatos na literatura demonstrando que o armazenamento sob atmosfera modificada e controlada pode aliviar os sintomas de dano pelo frio em produtos intactos. O aumento da suscetibilidade de produtos minimamente processados proliferao microbiana usualmente associado exposio dos tecidos internos, uma vez que o processamento remove a cutcula que atua como barreira para a entrada dos microorganismos, tornando os nutrientes presentes nos tecidos disponveis para suportar o crescimento microbiano.

Mecanismos da disfuno dos lipdeos da membrana e de espcies reativas de oxignio O dano de frio pode ser definido como um conjunto de mudanas de ordem fsica e/ou fisiolgica que ocorrem num dado tecido vegetal e que so induzidas pela baixa temperatura. O dano primrio, em nvel de ultra-estrutura semelhante entre os tecidos vegetais, sejam eles folhas ou frutos, e inclui a reduo da corrente citoplasmtica, desorganizao e mudana na estrutura e funcionalidade do aparato mitocondrial, dos cloroplastos e do ncleo celular. Dependendo do tempo de exposio dos tecidos baixa temperatura este processo pode ser reversvel mediante a remoo da refrigerao. Caso contrrio, podem ocorrer danos secundrios ao metabolismo celular, os quais so irreversveis e conseqentes das injrias primrias. De modo geral, quanto mais baixa a temperatura a qual o tecido est exposto, menor o tempo de exposio necessrio para desencadear o desenvolvimento dos sintomas. A exteriorao visual dos sintomas tambm varivel dependendo da espcie submetida ao frio, do tipo de tecido, do estdio de desenvolvimento e do ponto de maturao, no caso de frutos e tambm de fatores climticos. Em nvel molecular, acredita-se que a alterao na conformao e estrutura dos lipdios que compes as membranas biolgicas, seja o evento inicial que desencadeia as injrias de frio nos tecidos vegetais. Ao longo do tempo, o dano nas membranas decorrente da ao do frio pode causar acrscimos no vazamento de ons, transio de fase de lipdios de membrana a uma dada temperatura crtica, alm de alteraes no ndice de saturao dos cidos graxos. Alm do efeito da temperatura, as membranas celulares tambm podem ser desestabilizadas por meio da peroxidao lipdica mediada por enzimas, como a lipoxigenase (LOX) ou pela ao direta de radicais livres. Em espcies sensveis ao frio, tem sido sugerido que a baixa temperatura intensifica o estresse oxidativo dos tecidos por alterar o equilbrio entre a gerao e remoo de radicais livres, como o radical superxido e o perxido de hidrognio. Quando produzidas em excesso, essas espcies reativas de oxignio podem ser potencialmente danosas ao metabolismo celular, pois agravam o estresse oxidativo promovendo a desestabilizao das membranas biolgicas e a inativao de enzimas associadas ao metabolismo energtico, entre vrias outras enzimas relacionadas a importantes funes metablicas. Durante o processo de peroxidao lipdica, a degradao de cidos graxos poliinsaturados como o linolico e o linolnico, tem como subprodutos principais os ons perxido e o malonaldedo (MDA), os quais podem ser mensurados com relativa facilidade no tecido vegetal por meio da reao com o cido tiobarbitrico (TBA). O acmulo dessas substncias reativas ao cido tiobarbitrico (TBARS), tem sido amplamente utilizado como indicativo de estresse oxidativo e da integridade estrutural das membranas celulares de tecidos vegetais expostos a situaes de estresse, a exemplo do chilling. Devido temperatura influenciar diretamente a fluidez e a funcionalidade das membranas biolgicas e dos complexos enzimticos associados a ela, possvel afirmar que a manuteno da integridade e estabilidade das membranas crucial do ponto de vista energtico e organizacional e pode ser considerada fundamental para a aquisio de resistncia das plantas e frutos ao frio. A homeostase celular alcanada por meio de um delicado balano entre inmeras rotas bioqumicas interdependentes e que ocorrem simultaneamente em diferentes organelas. Esse equilbrio pode vir a ser severamente afetado durante uma situao de estresse por temperatura, pois os vrios sistemas enzimticos que compe as rotas bioqumicas possuem diferentes temperaturas timas para seu funcionamento. medida que o equilbrio metablico perdido ou alterado, diferentes rotas podem ser afetadas e acumular intermedirios txicos, ou ainda serem desacopladas e, nesse caso, os eltrons de alta energia que fluam por um dado caminho podem vir a ser transferidos diretamente ao oxignio molecular, intensificando a gerao de espcies reativas de oxignio (EROs) e de uma srie de reaes em cascata que culminam com a morte celular. As reaes de reduo do oxignio molecular requerem uma inicializao, enquanto as demais reaes subseqentes so espontneas, catalisadas ou no. A completa reduo do oxignio requer 4 eltrons e tem como produto final a gua, no entanto quando a reduo segue passos independentes so formados intermedirios reativos como o superxido (O2-); o perxido de hidrognio (H2O2) e o radical hidroxila (OH-). O oxignio singleto (1O2), embora tambm seja um potente radical, gerado exclusivamente por meio da excitao fsica do oxignio molecular. De modo geral, as espcies reativas de oxignio so consideradas como subprodutos do metabolismo celular, especialmente em organelas cuja atividade metablica oxidante elevada, como no caso das mitocndrias, cloroplastos e peroxissomos.

O radical superxido pode ser tambm produzido na cadeia de transporte de eltrons e em reaes catalisadas por enzimas como lipoxigenase, a xantina e a aldedo oxidases. Embora o superxido no seja to altamente txico comparado ao oxignio singleto e ao radical hidroxila, ele pode atacar diretamente os lipdios das membranas. Alm disso, o superxido pode reagir no enzimaticamente com o perxido de hidrognio na presena de metais de transio, gerando o radical hidroxila. O perxido de hidrognio, por sua vez, pode ser gerado durante a reao de dismutao do superxido catalisada pelas superxido dismutases, -oxidao de cidos graxos, durante as reaes de fotorrespirao envolvendo a oxidao do glicolato e tambm durante a formao da lignina catalisada por peroxidases ligadas parede celular. Os principais locais de gerao de 1O2 so a cadeia de transporte de eltrons entre compostos fotooxidados, como a clorofila e tambm como subproduto da atividade da lipoxigenase. O radical hidroxila, produto da reduo do perxido de hidrognio, conhecido como um dos mais potentes agentes oxidantes encontrados no metabolismo celular. O processo de reduo, conhecido como reao de Haber-Weiss, envolve a interao entre H2O2 e o O2-, a qual catalisada por metais de transio, como o cobre ou ferro. A clivagem do H2O2 pelo metal (Fe2+) gera o OH- e denominada reao de Fenton. Em funo de sua elevada reatividade e inespecificidade, o radical hidroxila altamente nocivo s protenas, cidos nuclicos e lipdios. Mesmo em plantas submetidas a condies timas de crescimento verifica-se a gerao de EROs em nveis baixos. Todavia, em situaes de estresse h uma abrupta elevao na taxa de produo de radicais livres; isto , a gerao excede a capacidade do tecido ou organismo em manter a homeostase celular, ocorrendo assim o estresse oxidativo. Apesar da natureza destrutiva e dos efeitos nocivos ocasionados pelas EROs durante uma situao de estresse, co no caso da baixa temperatura, alguns estudos tm sugerido que as EROs podem desempenhar importante papel como molculas trasdutoras de sinal, mediando variadas respostas, relacionadas infeco por patgenos, estresses ambientais, alm da morte celular programada. De um modo geral, ento, o estresse imposto aos tecidos vegetais, quando submetidos condio de chilling, favorece a intensificao do estresse oxidativo na clula vegetal devido a intensificao da gerao de EROs, as quais podem atacar diretamente a poro lipdica das membranas, inativar enzimas e danificar os cidos nuclicos. A natureza reativa das EROs as torna potencialmente danosas a todas as organelas celulares, podendo desencadear uma srie de reaes em cascata que culminam com a ocorrncia de distrbios metablicos que podem, em ltima instncia, ocasionar a morte celular.