PRCTICA 1 DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICRO-KJELDAHL I. OBJETIVO. Determinar indirectamente el contenido de protenas totales en una muestra desconocida. II.

FUNDAMENTO. MTODO MICRO KJELDAHL La materia orgnica es digerida por la accin del H2SO4 concentrado, convirtindose en CO2 y H2O; adems reduce el nitrgeno a amonio, el cual pasa a ser fijado por el cido como sulfato de amonio, una sal de gran estabilidad. La reduccin del material nitrogenado hasta amonio, se debe a que parte del H2SO4 es simultneamente reducido a SO2, que se comporta como un fuerte reductor. La digestin de la muestra es la parte mas difcil de la determinacin, esta se acelera mediante la adicin de catalizadores como el mercurio metlico, el xido rojo de mercurio (HgO), el sulfato cprico (CuSO4), el selenio, el permanganato de potasio (KmO 4) o una mezcla de estos. El sulfato de sodio o de potasio se adicionan a la mezcla con la finalidad de aumentar el punto de ebullicin y disminuir entonces el tiempo de digestin. Cuando la totalidad de la materia orgnica ha sido digerida, se libera el amonaco por descomposicin del sulfato de amonio con un lcali fuerte (NaOH) y luego se separa por destilacin y recoleccin en un volumen de cido brico, como borato de amonio. El amonio se determina por titulacin con solucin valorada de HCl 0,02 N en presencia de un indicador mixto compuesto por una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno, el cual en medio cido se presenta de color morado y en medio alcalino de color verde.

Luego se aplica la relacin siguiente: %N = ml.N.fc.meq.100 peso de muestra donde: ml.N.fc.meq = peso de nitrgeno en la muestra ml = gasto de cido sulfrico en la titulacin (ml) N. normalidad del cido Fc. Factor de correccin del cido meq.= peso del miliequivalente del nitrgeno Suponiendo que la muestra solo contiene protenas simples con 16% de N, el porcentaje de protenas ser: Protena = 6.25xN

III. PROCEDIMIENTO El proceso de determinacin se hace en tres etapas: DIGESTIN. Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es slido) y colocar en el matraz de digestin Agregar 4 ml de cido sulfrico concentrado al matraz Verificar que el control automtico del digestor este en 440C y que haya succin en la columna de fraccionamiento. Digerir la muestra por 4 min despus de haber alcanzado la temperatura indicada. Aadir 10 ml de peroxido de hidrgeno al 50% a la muestra a travs de un embudo de la columna de fraccionamiento. Si el digesto no se torna incoloro, aadir porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se aclare. Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar la columna de fraccionamiento, y colocar el matraz sobre un bloque y tapar hasta que se haya enfriado. Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada. DESTILACIN El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un baln de destilacin. Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de cido borrico al 4% ( en volumen) adicionndole indicador azul de metileno y rojo de metilo, dando una coloracin violeta. El baln de destilacin que contiene el digesto se aade 13 a 15 ml de hidrxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3 granallas de zinc. Conectar el equipo de destilacin y destilar el digesto durante unos 10 a 20 min (hasta que el vaso receptor tenga una coloracin verdusca y su volumen sea mas o menos 3 veces del volumen inicial) TITILACIN. Preparar una solucin de cido sulfrico 0.1 N y valorizarla. Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de verde a violeta

IV.

CUESTIONARIO a. Explique la diferencia entre protenas simples y conjugadas. Protenas simples: es la formada exclusivamente por alfa-aminocidos. Son aquellos que por hidrlisis producen solamente aa sin algn otro producto principal, orgnico o inorgnico contienen habitualmente 50% de C, 7% de H2 , 23% O2 , 16% N2 , etc. Proteinas conjugadas: son aquellas que por hidrlisis no solamente forman aminocidos, sino tambin otros componentes orgnicos o inorgnicos. La porcin no amino acida de una protena conjugada se denomina grupo prosttico.

b. Indique ejemplos y estructuras primarias de dos protenas simples y dos protenas conjugadas.

Estructuras simples Insulina.

Estructuras complejas Hemoglobina

Queratina Ribonucleasa

c. Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas durante el proceso de determinacin del nitrgeno. Digestin: C6H12O6 + 3O2 6CO2 + 6H2O Norg + H2SO4 SO4(NH4) Destilacin: SO4(NH4) + NaOH Na+ + NH3+ + H2O NH3+ + H3BO3 NH4 + H2BO3Titulacin: NH4 + H2BO3- + HCl NH4Cl + H3BO3 d. Efectu los clculos y determine el contenido de protenas en la muestra. %N = ml.N.fc.meq.100 peso de muestra

%N=33.6*1.1217*0.014*100 0.25 %N=2.11 Protena = 6.25xN Protena = 6.25*2.11 Protena = 13.18 % e. Indique que tipo de enlaces de una protena se rompen durante la etapa de digestin. Por el ataque de acido a la protena sufre una desnaturalizacin, perdiendo la estructura cuaternaria, terciaria y secundaria, sufre a la vez un reordenamiento rompiendo as las uniones entre los aminocidos, por ello rompen enlaces peptidicos entre los aminocidos, enlaces de hidrogeno o puente de hidrogeno, las interacciones inicas.

f.

Explique el objetivo de la etapa de destilacin. Es necesario aadir suficiente NaOH para neutralizar el exceso de acido sulfrico resultante de la digestin. Provocar que haiga un mayor desprendimiento de amoniaco y as poder cuantificarlo en mayor cantidad.

g. Explique por qu la titilacin se hace con cido sulfrico y no con un lcali. Porque lo que se quiere es neutralizar la base que se ha formado, aunque se presente en la reaccin el acido H2BO3- lo que ms hay en exceso es la base de amonio, por ende neutralizamos con acido fuerte que en este caso fue el HCl.

V.

OBSERVACIONES en nuestra prctica la destilacin se desarrollaba muy lentamente, esto debido a que se nos olvido agregar los 12ml de ac. brico, una vez agregado se obtuvo con mayor normalidad amoniaco que para nuestro caso se tena que alcanzar 40 ml de solucin saturada de amoniaco.

VI. CONCLUSIONES El mtodo de micro kjeldahl nos ayuda a poder determinar la cantidad de protenas que se encuentra en gran parte de los seres vivos que para nuestro caso fue de una alga.

VII. BIBLIOGRAFA Conferencia para el Laboratorio de Bioqumica, Biologa y Farmacia. Universidad Nacional de Colombia, facultad de Ciencias, Departamento de Qumica. Santaf de Bogot, 1998. Bernal de Ramrez, I. Anlisis de alimentos. Academia Colombiana de Ciencias Exactas, Fsicas y naturales, Coleccin Julio Carrizosa Valenzuela No 2.. Santaf de Bogot D.C. 1993.