REACCIN DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA TRYPANOSOMA CRUZI

PREPARACIN DE IMPRONTAS - Portaobjetos con 12 divisiones lavados y desengrasados (detergente no inico-agua-agua destilada-alcohol acetona) - Suspensin de Trypanosoma cruzi: Antgeno procedente del Instituto Nacional de Diagnstico e Investigacin de la Enfermedad de Chagas Dr. Mario Fatala Chaben. Resuspender en vortex hasta homogeinizacin total - Preparar una suspensin diluyendo el antgeno con agua destilada estril segn indicacin del rtulo (Ttulo de la suspensin) - Resuspender en vortex hasta homogeinizacin total - Prueba control: Tomar 10 l de la suspensin antignica, depositar en una divisin del portaobjeto, dejar reposar unos minutos. Observar microscpicamente a 400x aumentos con luz directa. Controlar la concentracin de epimastigotes: no se deben observar grumos y tener un buen nmero de parsitos por campo microscpico - Agitar peridicamente en vortex mientras se realizan las improntas - Preparacin: Colocar 10 l de suspensin en cada divisin del retculo - Secar al aire caliente -Fijar flameando suavemente a la llama - Lavar por inmersin con agua destilada estril - Envolver con papel absorbente y papel de aluminio. - Guardar en freezer a 20C ...............................................................................................................................................................

TCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Efectuar una dilucin 1/30de los sueros control (negativo) y desconocidos en el buffer Efectuar diluciones 1/30, 1/60, 1/120 y 1/240 del suero control positivo Homogeneizar las diluciones en vortex Cubrir cada divisin del retculo con los sueros controles y desconocidos de la siguiente manera

Inmunofluorescencia para Chagas Testigo (+) 1/30 Testigo (+) 1/60 Testigo (+) 1/120 Testigo (+) 1/240 Buffer Testigo negativo

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Incubar 30 minutos a 37C en cmara hmeda

Efectuar 3 lavados de 5 minutos cada uno, por inmersin en buffer Pasaje rpido por agua destilada Escurrir en papel de filtro y secar por corriente de aire caliente Cubrir cada casillero con inmunoglobulina anti G/A/M marcada, diluda segn ttulo Incubar 30 minutos a 37C en cmara hmeda Efectuar 3 lavados de 5 minutos cada uno, por inmersin en buffer (al abrigo de la luz) Cubrir durante 10 minutos con 2 ml de una solucin de Azul de Evans diluda de acuerdo al ttulo Lavar con agua destilada Escurrir sobre papel de filtro cuidadosamente y secar con aire caliente Montar cubriendo con lquido de montaje y cubreobjeto CRITERIOS DE LECTURA Previamente a la lectura de los sueros problemas se procede a la lectura de los controles. Testigo de fluorescencia inespecfica: Est constitudo por la suspensin antignica con buffer. Al microscopio los parsitos deben presentar una coloracin rojiza y no deben mostrar fluorescencia. Testigo negativo: El suero control negativo debe presentar un aspecto similar al testigo anterior Testigo positivo: El suero control positivo debe presentar los parsitos teidos con el fluorocromo, los parsitos deben observarse de color verdoso fluorescente. La fluorescencia es particularmente intensa sobre la membrana y el flagelo.

Las lecturas positivas deben ser las observables hasta la dilucin reactiva del suero control positivo que se utiliza. Se informa positivo o negativo

Buffer: Solucin salina estabilizada (SSE) pH 7.1 7.3 Diluir la solucin madre 1/10 en el momento de utilizar. Se toman 100 ml de la solucin madre y se lleva con agua destilada a un volumen final de 1000 ml. Solucin Salina Estabilizada (SSE): Solucin madre: Na2 HPO4 12H2O (p.a.)26,5 gr Na H2PO4 2H2O (p.a.)..3,6 gr NaCl (p.a.)...81,7 gr Agua destilada c.s.p.1000 ml Colorante de contraste: Preparar una solucin de Azul de Evans al 1% en buffer PBS Para su uso se harn diluciones con SSE de la misma hasta encontrar la dilucin que d coloracin de contraste a los testigos negativo y al inespecfico y no enmascare la fluorescencia del control positivo. Antigammaglobulina conjugada: Diluida en buffer segn ttulo. Agitar en vortex, centrifugar 10min a 250 rpm y guardar al abrigo de la luz hasta su uso. Tomar del sobrenadante. Lquido de montaje: Buffer-glicerina Buffer PBS.2 partes (4 ml) Glicerina.3 partes (6 ml) Llevar a pH 8 com Na (OH) 4M (aprox. 3) Controlar el pH uma vez por mes