PERHITUNGAN A. SHIFT D (08.00-11.

00) Dik: Absorbansi standar = 0,540

Absorbansi sampel 1 = 0, 253 Absorbansi sampel 2 = 0, 359 Absorbansi sampel 3 = 0,291 Absorbansi sampel 4 = 0,243 Kadar lar. Standar = 300 mg/dL

Dit: Kadar kolesterol total = ? Kadar kolesterol sampel 1 = = x Kadar standar x 300 mg/dL

= 140, 56 mg/dL Kadar kolesterol sampel 2 = = x Kadar standar x 300 mg/dL

= 199, 45 mg/dL Kadar kolesterol sampel 3 = = x Kadar standar x 300 mg/dL

= 161, 67 mg/dL Kadar kolesterol sampel 4 = = x Kadar standar x 300 mg/dL

= 135 mg/dL

Tabel 1. Hasil Pengamatan Kadar (x) mg/dL Blangko Standar Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 Sampel 4 300 140,56 199,45 161,67 135 0 0,540 0,253 0,359 0,291 0,243 159,17 18,61 -40,28 -2,5 24,17 | 346,33 1622,47 6,25 584,18 |2 = 2.559,23 A mg/dL - x ) | |2

Standar Deviasi (SD) = Range = SD

= 29,2

= ( - SD) mg/dL - ( + SD) mg/dL = (159,17 29,2 ) mg/dL - (159,17+29,2 ) mg/dL = 129,97 mg/dL 188,37 mg/dL

B. SHIFT E (11.00-14.00) Dik: Absorbansi standar = 0,576

Absorbansi sampel 1 = 0, 306 Absorbansi sampel 2 = 0, 279 Absorbansi sampel 3 = 0,255 Absorbansi sampel 4 = 0,298 Kadar lar. Standar = 300 mg/dL

Dit: Kadar kolesterol total = ? Kadar kolesterol sampel 1 = x Kadar standar

x 300 mg/dL

= 159, 37 mg/dL Kadar kolesterol sampel 2 = = x Kadar standar x 300 mg/dL

= 145, 31 mg/dL Kadar kolesterol sampel 3 = = x Kadar standar x 300 mg/dL

= 132, 81 mg/dL Kadar kolesterol sampel 4 = = x Kadar standar x 300 mg/dL

= 155,2 mg/dL

Tabel 1. Hasil Pengamatan Kadar (x) mg/dL Blangko Standar Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 Sampel 4 300 159,37 145,31 132,81 155,2 0 0,576 0,306 0,279 0,255 0,298 148,17 -11,2 2,86 15,36 -7,03 | 125,44 8,18 235,93 49,42 |2 = 418,97 A mg/dL - x ) | |2

 Standar Deviasi (SD) = Range = SD

= 11,82

= ( - SD) mg/dL - ( + SD) mg/dL = (148,17 11,2) mg/dL - (148,17+ 11,2 ) mg/dL = 136,97 mg/dL 159,37 mg/dL

C. SHIFT F (14.00-17.00) Dik: Absorbansi standar = 0,564

Absorbansi sampel 1 = 0, 175 Absorbansi sampel 2 = 0, 270 Absorbansi sampel 3 = 0,291 Absorbansi sampel 4 = 0,338 Kadar lar. Standar = 300 mg/dL

Dit: Kadar kolesterol total = ? Kadar kolesterol sampel 1 = = x Kadar standar x 300 mg/dL

= 93,08 , mg/dL Kadar kolesterol sampel 2 = = x Kadar standar x 300 mg/dL

= 143,62 mg/dL Kadar kolesterol sampel 3 = = x Kadar standar x 300 mg/dL

= 154,79 mg/dL Kadar kolesterol sampel 4 = = x Kadar standar x 300 mg/dL

= 179,78 mg/dL

Tabel 1. Hasil Pengamatan Kadar (x) mg/dL Blangko Standar Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 Sampel 4 300 93,08 143,62 154,79 179,78 0 0,564 0,175 0,270 0,291 0,338 142,82 49,74 -0,8 -10,97 36,96 | 2474,06 0,64 120,34 1.366,04 |2 = 3.960,5 A mg/dL - x ) | |2

Standar Deviasi (SD) = Range = SD

= 36, 3

= ( - SD) mg/dL - ( + SD) mg/dL = (142,82 36,3 ) mg/dL - (142,82+ 36,3 ) mg/dL = 106,52 mg/dL 179,12 mg/dL

Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan percobaan pemeriksaan kadar kolesterol total dalam plasma. Penentuan kadar kolesterol total ini bermanfaat untuk mempelajari ketepatan mendiagnosa penyakit, sehingga perlakuan pengobatan/terapi farmakologis maupun non-farmakologis, pencegahan, dan skrining kesehatan dapat dilakukan dengan tepat. Kolesterol adalah senyawa yang memiliki inti steroid yang tidak larut air tetapi larut dalam pelarut organik. Kolesterol membentuk lipoprotein dengan lipid lain dalam plasma sehingga dapat larut dalam plasma tersebut. Berdasarkan densitasnya Lipoprotein yang berikatan dengan kolesterol dalam tubuh terbagi menjadi 5 golongan besar yaitu Kilomikron, VLDL, IDL, LDL dan HDL. (Departemen Farmakologi dan Terapeutik. Hal 375-377). Kilomikron adalah lipoprotein yang berfungsi untuk membawa trigliserida dari makanan ke jaringan lemak dan otot rangka, juga membawa kolesterol makanan ke hati. VLDL (Very Low Density Lipoprotein) adalah lipoprotein yang disekresi oleh hati untuk mengangkut trigliserida ke jaringan perifer. IDL (Intermediate Density Lipoprotein) adalah lipoprotein yang merupakan zat perantara yang terjadi sewaktu VLDL dikatabolisme menajdi LDL. LDL (Low Density Lipoprotein) adalah lipoprotein yang merupakan pengangkut kolesterol terbesar pada manusia(70% total), LDL berfungsi untuk membawa kolesterol dari hati ke sel-sel tubuh. Sedangkan HDL (High Density Lipoprotein) adalah lipoprotein yang berfungsi untuk membawa kolesterol dari jaringan kedalam hati. (Departemen Farmakologi dan Terapeutik. Hal 375-377). Pengukuran kadar kolesterol dilakukan karena peningkatan kadar kolesterol dalam darah berarti meningkatnya resiko terakumulasinya kolesterol dalam tubuh yang dapat menin gkatkan resiko Penyakit Jantung Koroner (PJK). Kadar kolesterol dalam plasma dapat dihubungkan dengan PJK karena Hiperlipidemia merupakan salah satu penyakit yang meningkatkan resiko PJK. Ketika kadar kolesterol dalam plasma tinggi (Hiperlipidemia) maka kadar LDL (Low Density Lipoprotein) yang membawa kolesterol dari hati ke jaringan tubuh tinggi, sedangkan kadar HDL (High Density Lipoprotein) yang berfungsi untuk membawa kolesterol dari jaringan kedalam hati cukup rendah sehingga terjadi

penumpukan (akumulasi) kolesterol dalam tubuh yang tidak dapat di metabolisme. Apabila kadar kolesterol dalam darah lebih tinggi dar normal dalam jangka waktu yang lama maka akan terjadi penyumbatan pembuluh koroner (arteri koronaria) yang mengangkut oksigen kedalam jantung. Ketika arteri koronaria tersumbat oleh lemak (Plak) maka arteri menyempit dan mengurangi aliran darah ke jantung, sehingga plak yang terbentuk kemudian retak, gumpalan darah terbentuk pada daerah yang retak yang menghentikan darah ke bagian otot jantung sehingga terjadi PJK. (http://www.majalah-farmacia.com/rubrik/category_news.asp?IDCategory=25) Penentuan kadar kolesterol dapat dilakukan dengan metode kolorimetri, kromatografi dan enzimatis. Dalam percobaan ini metode yang digunakan adalah one point methode melalui reaksi enzimatis. Pemilihan metode enzimatik dikarenakan metode ini memiliki berbagai macam kelebihan dibandingkan metode kolorimetri dan kromatografi. Pada metode kolorimetri reaksinya kurang spesifik karena dapat terganggu oleh senyawa lain misalnya senyawa lain dalam darah yang menyerupai kolesterol yang dapat menganggu pembacaan absorbansi pada spektrofotometri karena dengan adanya senyawa mirip kolesterol dapat meningkatkan absorbansi yang berarti meningkatkan kadar kolesterol total. Sedangkan dengan cara kromatografi yang sering digunakan adalah kromatografi gas. Kromatografi gas digunakan untuk melarutkan dan menghitung lipid seperti triasilgliserol dan turunan-turunannya. Kromatografi gas sangat sesuai untuk memisahkan, ester kolestrol, mono-ditriacylglycerols, asam lemak bebas, kolestrol dan lipid. Pemeriksaan kadar kolesterol dilakukan secara quarto. Fungsi dilakukan secara quarto yaitu untuk mempersempit kesalahan data dengan cara membandingkan hasil pengulangan, dimana pengulangan yang satu dan yang lain hasil yang diperoleh tidak boleh berbeda signifikan. Absorban yang diukur yaitu absorbansi spesimen, standar, dan blanko. Pengujian spesimen dilakukan oleh 4 kelompok dan pengujian standar dilakukan 1 kelompok, serta blanko dibuat 1 untuk semua kelomok. Spesimen diperoleh dari darah relawan perempuan di yang diambil pukul 07.30 WIB pagi, pelarut yang digunakan aquadest, larutan standar,

dan reagen warna yang digunakan 4-aminiantipirin, serta menggunakan enzim kolesterol esterase, kolesterol oksidase dan hidrogen peroksidase. Pada percobaan ini enzim beserta reagen yang telah disiapkan. Kemudian disiapkan blanko yang terdiri dari 1 ml larutan reagen yang ditambah dengan 10 L aquadest. Penambahan aquadest bertujuan untuk menyamakan volume dengan larutan uji dan larutan standar karena pada saat pengujian perlakuan yang diberikan harus sama. Pembuatan larutan blanko bertujuan untuk kalibrasi atau sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri. Larutan blanko tidak berisi larutan yang dianalisis hanya saja berisi pelarut dan reagen yang dilakukan untuk mengkalibrasi spektrofotometri. setelah pembuatan larutan blanko maka dibuat larutan standar dan larutan uji. Larutan standar dibuat dengan mencampurkan 1 ml reagen dengan 10 L larutan standar. Sedangkan larutan uji terdiri dari 1 ml reagen yang dicampurkan dengan 10 L serum. Pembuatan larutan standar ini diperlukan untuk menentukan kadar asam urat dalam darah dengan

membandingkan absorbansi antara larutan uji dan larutan standar. Pengambilan sampel pada praktikum ini menggunakan mikropipet dengan kapasitas 10-100 L dan mikropipet kapasitas 100 1000 L. Sampel sampel pada praktikum kimia klinik ini menggunakan sampel yang sangat sedikit dengan ukuran mikro sehingga sangat kuantifikasi dalam pengerjaannya sehingga diperoleh data yang akurat. Teknik pengambilan campuran ini harus dilakukan dengan teliti untuk menghindari kesalahan data atau variasi analitik. Cairan yang dimasukan kedalam tabung harus melalui dinding tabung dan sedekat mungkin dengan dasar tabung untuk menghindari cipratan yang dapat menyebabkan

berkurangnya volume cairan yang sudah ditentukan, dengan begitu hal ini dapat mencegah volume yang hilang. Suhu dan waktu inkubasi merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kesetimbangan reaksi oleh karena itu campuran harus dikocok dan di tunggu 20 menit pada suhu kamar (20-250C), pengocokan (pengocokan yang dilakukan menggunakan pengocokan manual) berguna untuk menghomogenitas campuran larutan sehingga reaksi yang terjadi dapat berjalan merata hingga diperoleh kesetimbangan reaksinya dan 20 menit merupakan waktu inkubasi agar tercapainya kesetimbangan reaksi. Warna campuran yang diperoleh

berwarna pink muda (bening), warna merupakan salah satu indikasi dari suatu reaksi, semakin pekat maka semakin banyak konsentrasi zat yang bereaksi, selama warna larutan masih berubah berarti dapat dikatakan reaksi masih berjalan untuk mencapai kesetimbangan. Kemudian setelah 20 menit di ukur absorbansinya, semakin tinggi absorbansi maka semakin banyak kolesterol yang terkandung dalam darah. Dalam serum yang diperoleh dari relawan, terdapat kolesterol dalam bentuk kolesterol ester yang diperoleh baik dari makanan yang dikonsumsi ataupun yang dibentuk oleh tubuh. Ketika serum yang mengandung kolesterol, maka terjadi reaksi enzimatik yang terdiri dari reaksi utama dan reaksi indikasi, dimana reaksi utamanya dapat digambarkan seperti di bawah ini:

Pada reaksi diatas, enzim kolesterol esterase akan mengubah kolesterol ester yang terdapat dalam tubuh menjadi kolesterol dalam bentuk bebas dan asam lemak, karena yang diukur dengan metode ini adalah kadar kolesterol bebas. Kemudian kolesterol bebas yang terbentuk akan dioksidasi dengan katalis enzim koletserol oksidase membentuk Kolesterol-3-one dengan hasil samping Hidrogen Peroksida (H2O2). Hasil samping dari reaksi ini yaitu Hidrogen peroksida (H2O2) yang akan menjadi dasar reaksi indikasi, dimana hidrogen peroksida akan bereaksi dengan 4 aminoantipirin dan fenol menghasilkan Quinoneimina denganwarna merah muda (pink) yang kemudian intensitas warnanya dapat diukur dengan spektrofotometer Uv-Vis. Enzim kolesterol esterase pada reaksi berperan dalam mempercepat reaksi kolesterol ester menjadi kolesterol bebas, enzim koletserol oksidase berperan sebagai katalis dalam oksidasi kolesterol bebas menjadi Kolesterol-3-one dengan hasil samping Hidrogen Peroksida

(H2O2), sedangkan enzim hidrogen peroksidase berperan dalam mengkatalisis reaksi pembentukan quinoneimina dari hidrogen peroksida. Enzim memiliki energi aktifasi yang lebih rendah dibandingkan reaksi kimia dan reaksinya berlangsung cepat, serta spesifik terhadap substratnya karena substrat dalam jumlah sedikit masih dapat dideteksi oleh enzim dan karena enzim mengkatalisasi pada reaksi pertama lalu mengecek apakah produk reaksinya benar pada langkah kedua, sehingga cara kerja enzim sangat spesifik. 4 aminoantipirin berperan sebagai reagen warna yang membentuk warna merah muda pada reaksi sehingga dapat terbaca absorbansinya. Sedangkan fenol akan membuat 4aminoantipirin lebih reaktif yang akan membantu pembentukan konjugat sehingga kromogen yang dihasilkan lebih berwarna dan intensitas warnanya dapat dibaca oleh spektrofotometri Uv-vis. Setelah didiamkan selama 20 menit dalam suhu ruangan, maka larutan uji, blanko dan standar dimasukkan kedalam spektrofotometri. Ketika larutan uji dimasukkan dalam spektrofotometri, maka terjadi penyerapan gelombang elektromagnetik pada daerah visible (380-780 nm) yaitu pada panjang gelombang 492-546 nm oleh senyawa yang memiliki gugus kromofor yang terdapat dalam larutan uji (Quinineimina). Karena cahaya yang ditembakkan mengandung energi (E= h. c/) menyebabkan terjadinya eksitasi elektron molekul tersebut dari

keadaan dasar (ground state) ke tingkat energi yang lebih tinggi. Ketika elektronelektron tersebut tereksitasi, maka spektrofotometer menghasilkan nilai

absorbansi, dimana absorbansi ini setara dengan jumlah energi yang dioabsorpsi oleh molekul untuk mengeksitasi elektron dari keadaan dasar ke tingkat energi yang kebih tinggi, dimana perpindahan tersebut dapat digambarkan seperti dibawah ini:

Gambar 3 Proses eksitasi elektron dari ground state ke tingkat energi yang lebih tinggi

Terdapat berbagai persyaratan yang harus dipenuhi dalam suatu pengujian baik secara kualitatif ataupun kuantitatif. Syarat tersebut terdiri dari spesifisitas, sensitivitas, presisi dan akurasi. Akurasi adalah kemampuan metode untuk mengukur dan mendeteksi nilai aktual atau nilai sebenarnya dari dalam sampel, akurasi merupakan ukuran ketepatan atau kedekatan hasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya. Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil pengujian individual dengan hasil rata-rata pengujian berulang pada sampel yang homogen dengan kondisi pengujian yang sama. Sensitifitas atau kepekaan adalah kemampuan metode untuk mendeteksi atau mengukur sampel dalam jumlah sekecil mungkin. Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk meendeteksi atau mengukur sampel tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya bahan atau matriks lain. (Ibrahim, 2010). Keempat persyaratan tersebut diusahakan dapat dipenuhi dalam percobaan ini walaupun tidak dapat dilakukan dengan sempurna. Hal tersebut dikarenakan keterbatasan alat, personal, kondisi ruangan, dan lain-lain. Alat yang digunakan yaitu spektrofotometri yang mempunyai spesifitas dan sensitifitas yang tinggi, untuk memenuhi akurasi dan presi, pengujian juga diulang sebanyak empat kali walupun orang yang mengerjakannya tidak sama.

Setelah diukur dengan spektrofotometri, pada shift pertama pada larutan standar didapat absorbansi sebesar 0,540. Pada larutan uji dari kelompok pertama diperoleh absorbansi sebesar 0253, pada kelompok kedua diperoleh absorbansi 0,359, pada kelompok ketiga diperoleh absorbansi sebesar 0,291 dan pada kelompok empat sebesar 0,243. Dilihat dari nilai absorbansi yang diperoleh dari keempat kelompok, nilainya memenuhi persyaratan dimana nilai yang didapat berada pada rentang 0,2 sampai 0,8. Pada shift ke 2 pada larutan standar didapat absorbansi sebesar 0,576. Pada larutan uji dari kelompok pertama diperoleh absorbansi sebesar 0,306 pada kelompok kedua diperoleh absorbansi 0,279, pada kelompok ketiga diperoleh absorbansi sebesar 0,255 dan pada kelompok empat sebesar 0,298. Dilihat dari nilai absorbansi yang diperoleh dari keempat kelompok, nilainya memenuhi persyaratan dimana nilai yang didapat berada pada rentang 0,2 sampai 0,8. Pada shift ke 3 pada larutan standar didapat absorbansi sebesar 0,564. Pada larutan uji dari kelompok pertama diperoleh absorbansi sebesar 0,175 pada kelompok kedua diperoleh absorbansi 0,270 pada kelompok ketiga diperoleh absorbansi sebesar 0,291 dan pada kelompok empat sebesar 0,338. Dilihat dari nilai absorbansi yang diperoleh dari keempat kelompok, nilainya memenuhi persyaratan dimana nilai yang didapat berada pada rentang 0,2 sampai 0,8. Pada shift 1 berdasarkan hasil percobaan dan setelah dibandingkannya absorbansi larutan uji dan larutan standar, didapatkan kadar kolesterol dari ratarata seluruh kelompok adalah 159,17 mg/dL, standar deviasinya 29,2 mg/dL dan range hasil percobaan adalah 129,97 mg/dL sampai 188,37 mg/dL. Standar deviasi merupakan salah satu teknik statistik yg digunakan untuk menjelaskan homogenitas kelompok. Standar Deviasi merupakan variasi sebaran data, semakin kecil nilai standar deviasi maka semakin homogen data yang didapatkan dan semakin besar nilai standar deviasi, maka data yang dihasilkan kurang homogen atau bervariasi. Dilihat dari kadar yang didapat, kadar kolesterol dari relawan tersebut merupakan kadar normal yaitu 159,17 mg/dL, berada pada rentang kadar normal yaitu 140 250 mg/dL. Akan tetapi standar deviasi yang didapat cukup tinggi yaitu 29,2 mg/dL yang menunjukkan bahwa tingkat presisi dari percobaan

ini cukup rendah dengan diperolehnya hasil percobaan yang kurang homogen. Dari data-data pada perhitungan, didapat range dari hasil percobaan adalah 129,97 mg/dL sampai 188,37 mg/dL. Dari data masing-masing kelompok, terdapat 1 kelompok dimana kadarnya tidak berada pada range tersebut, sehingga kesalahankesalahan yang dilakukan menyebabkan data yang didapat memiliki homogenitas yang rendah. Pada shift 2 berdasarkan hasil percobaan dan setelah dibandingkannya absorbansi larutan uji dan larutan standar, didapatkan kadar kolesterol dari ratarata seluruh kelompok adalah 148,12 mg/dL, standar deviasinya 11,2 mg/dL dan range hasil percobaan adalah 136,97 mg/dL sampai 159,37 mg/dL. Standar deviasi merupakan salah satu teknik statistik yg digunakan untuk menjelaskan homogenitas kelompok. Standar Deviasi merupakan variasi sebaran data, semakin kecil nilai standar deviasi maka semakin homogen data yang didapatkan dan semakin besar nilai standar deviasi, maka data yang dihasilkan kurang homogen atau bervariasi. Dilihat dari kadar yang didapat, kadar kolesterol dari relawan tersebut merupakan kadar normal yaitu 148,12 mg/dL, berada pada rentang kadar normal yaitu 140 250 mg/dL. Akan tetapi standar deviasi yang didapat cukup tinggi yaitu 11,82 mg/dL yang menunjukkan bahwa tingkat presisi dari percobaan ini cukup rendah dengan diperolehnya hasil percobaan yang kurang homogen. Dari data-data pada perhitungan, didapat range dari hasil percobaan adalah 136,97 mg/dL sampai 159,37 mg/dL. Dari data masing-masing kelompok, kadar kolesterol pada m asing-masing kelompok berada pada rentang tersebut sehingga kesalahan-kesalahan pada shift ke 2 dapat lebih ditoleransi dibandingkan pada shift 1. Pada shift 3 berdasarkan hasil percobaan dan setelah dibandingkannya absorbansi larutan uji dan larutan standar, didapatkan kadar kolesterol dari ratarata seluruh kelompok adalah 142,82 mg/dL, standar deviasinya 36,3 mg/dL dan range hasil percobaan adalah 106,52 mg/dL sampai 179,12 mg/dL. Standar deviasi merupakan salah satu teknik statistik yg digunakan untuk menjelaskan homogenitas kelompok. Standar Deviasi merupakan variasi sebaran data, semakin kecil nilai standar deviasi maka semakin homogen data yang didapatkan dan

semakin besar nilai standar deviasi, maka data yang dihasilkan kurang homogen atau bervariasi. Dilihat dari kadar yang didapat, kadar kolesterol dari relawan tersebut merupakan kadar normal yaitu 142 ,82 mg/dL, berada pada rentang kadar normal yaitu 140 250 mg/dL. Akan tetapi standar deviasi yang didapat cukup tinggi yaitu 36,3 mg/dL yang menunjukkan bahwa tingkat presisi dari percobaan ini cukup rendah dengan diperolehnya hasil percobaan yang kurang homogen. Dari data-data pada perhitungan, didapat range dari hasil percobaan adalah 106,52 mg/dL sampai 179,12 mg/dL. Dari data masing-masing kelompok, terdapat 1 kelompok dimana kadarnya tidak berada pada range tersebut, sehingga kesalahankesalahan yang dilakukan menyebabkan data yang didapat memiliki homogenitas yang rendah. Terdapat beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi kadar kolesterol pada tiap-tiap kelompok pada masing-masing shift, ataupun variasi kadar kolesterol antara tiap shift. Semua kelompok dan semua shift padahal menggunakan sampel yang sama, sehingga seharusnya memiliki data yang homogen karena sampel yang digunakan sama dan perlakuan yang diberikan juga sama. Faktor pertama yang mempengaruhi adalah variasi pengocokan.

Pengocokan dengan cara manual antara praktikan yang satu dengan yang lain berbeda sehingga hasil warna campuran yang diperoleh antara kelompok atau antar shift yang satu dengan yang lain, kepekatan warna pink mudanya berbeda pula sedangkan pengocokan seharusnya dilakukan seoptimal mungkin agar reaksi yang terjadi berjalan dengan baik. Untuk memperoleh pengocokan yang optimal seharusnya tidak dengan cara manual, paling tidak salah satu caranya dapat menggunakan sentrifugal, karena pengerjaan quarto tidak dilakukan pada orang yang sama, sehingga cara pengocokan manual antara praktikan yang satu dengan yang lain sangat besar kemungkinan berbedanya sehingga mengakibatkan campuran didalam tabung kurang bercampur dengan baik dan juga berdampak pada lamanya waktu yang diperlukan untuk mencapai kesetimbangan reaksi. Kesetimbangan reaksi sangat penting karena kesetimbangan reaksi menandakan reaksi yang sempurna, sehingga nilai absorbansi yang diperoleh akan dapat

menunjukan semua kadar asam urat yang ada pada sampel standar dan sampel test, sedangkan apabila sampel diukur absorbansinya sebelum tercapainya kesetimbangan reaksi maka nilai absorban tidak menunjukan kadar asam urat yang tepat karena kolesterol dalam larutan belum bereaksi seluruhnya. Jadi variasi pengocokan merupakan salah satu faktor penyebab kemungkinan

ketidakhomogenan data yang diperoleh. Faktor kedua yang mempengaruhi hasil percobaan adalah waktu inkubasi. Waktu inkubasi bertujuan untuk memperoleh kesetimbangan reaksi. Waktu inkubasi dalam prosedur 20 menit tetapi saat pengujian setiap kelompok tidak tepat 20 menit semua karena spektrofotometer visibel yang digunakan hanya satu dan dilakukan bergantian. Waktu inkubasi juga dipengaruhi pengocokan sampel, seperti yang sudah diulas diatas apabila pengocokan kurang optimal maka waktu inkubasi akan bertambah lama. Waktu inkubasi dipengaruhi pula oleh suhu. Jadi waktu inkubasi menjadi salah satu satu faktor penyebab kemungkinan ketidakhomogenan data yang diperoleh. Faktor ketiga yang mempengaruhi hasil percobaan adalah suhu. Semakin tinggi suhu maka reaksi semakin cepat berlangsung, tetapi suhu yang terlalu tinggi dapat mengakibatkan protein didalam darah terdenaturasi sehingga suhu disesuaikan dengan suhu optimal sampel yaitu disuhu tubuh 370C namun, suhu inkubasi yang digunakan praktikan berada disuhu ruangan antara 20-250C sehingga waktu inkubasi menjadi 20 menit. Prosedur pengerjaan pada tiap kelompok berbeda-beda, dimana suhu mungkin mempengaruhi, misalnya ada beberapa kelompok yang menyentuh atau tidak menyentuh tabung dibagian bawah yang berisi larutan, sehingga suhu tubuh praktikan mempengaruhi suhu inkubasi sampel. Jadi faktor suhu menjadi salah satu satu faktor penyebab kemungkinan ketidakhomogenan data yang diperoleh. Faktor keempat yang mempengaruhi hasil percobaan adalah lama penyimpanan spesimen. Spesimen yang digunakan merupakan spesimen yang diperoleh dari jam 07.30 pagi dan baru digunakan untuk diuji oleh praktikan pada jam 08.00 (Shift D), 11.00 (Shift E) dan 14.00 (Shift F), sehingga lama penyimpanan sampel ini sangat mempengaruhi kualitas dan kestabilan spesimen.

Pada penyimpanan spesimen yang benar spesimen dapat tahan beberapa hari. Spesimen disimpan dalam kulkas, tetapi ketika siang spesimen digunakan secara bergantian oleh 3 kelompok sehingga spesimen yang tidak segar berada terlalu lama di suhu kamar dan dapat terkontaminasi oleh lingkungan sekitar. Suhu penyimpanan yang baik untuk spesimen yaitu 2-80C sedangkan ketika preparasi sampel spesimen berada lama di suhu ruang yaitu 20-250C sehingga kemungkinan spesimen dapat terkontaminasi oleh kuman atau bahan kimia, terjadi metabolisme oleh sel-sel hidup pada spesimen, terjadi penguapan, terkena paparan sinar matahari sehingga kualitas spesimen menurun. Suhu mempengaruhi aktifitas enzim yang berada didalam spesimen, karena enzim adalah protein maka enzim memperlihatkan sifat yang sama dengan protein yang salah satunya enzim akan kehilangan aktifitasnya oleh apa saja yang menyebabkan denaturasi protein seperti; panas, asam-basa kuat, logam-logam kuat, pelarut organik, dan sebagainya. Adanya kesalahan pada penyimpanan spesimen dapat terlihat dimana kadar kolesterol dari shift 1 sampai shift ke tiga terus mengalami penurunan, hal tersebut terjadi karena karena lama penyimpanan membuat kolesterol berkurang.

KESIMPULAN Pada shift D (08.00-11.00) berdasarkan hasil percobaan dan setelah dibandingkannya absorbansi larutan uji dan larutan standar, didapatkan kadar kolesterol dari rata-rata seluruh kelompok adalah 159,17 mg/dL, standar deviasinya 29,2 mg/dL dan range hasil percobaan adalah 129,97 mg/dL sampai 188,37 mg/dL. Pada shift E (11.00-14.00) berdasarkan hasil percobaan dan setelah dibandingkannya absorbansi larutan uji dan larutan standar, didapatkan kadar kolesterol dari rata-rata seluruh kelompok adalah 148,12 mg/dL, standar deviasinya 11,2 mg/dL dan range hasil percobaan adalah 136,97 mg/dL sampai 159,37 mg/dL. Pada shift F (14.00-17.00) berdasarkan hasil percobaan dan setelah dibandingkannya absorbansi larutan uji dan larutan standar, didapatkan kadar kolesterol dari rata-rata seluruh kelompok adalah 142,82 mg/dL,

standar deviasinya 36,3 mg/dL dan range hasil percobaan adalah 106,52 mg/dL sampai 179,12 mg/dL.