Universit Abdelmalek Essaadi Facult des Sciences de Ttouan Dpartement de Biologie

METHODES DETUDES MORPHOLOGIQUES DE LA CELLULE

Filire SVT (S1) Anne universitaire: 2012-13

Pr BENIOURI Rajaa

INTRODUCTION
Organisme : rassemble les tissus diffrents/nature des cellules et de leur substance. Tissus : groupe des cellules fonctions spcialises, relis par des systmes de communication. Cellules : petite compartiment limit par des membranes rompit d'une solution aqueuse, concentr d'une substance chimique. Il existe deux types de cellules, diffrencies par la prsence ou non de matriel gntique dans un noyau: Les Eucaryotes ont le matriel gntique dans un noyau, les cellules eucaryotes sont unis et pluricellulaires Les Procaryotes dont le matriel gntique est libre. Ce sont des organismes unicellulaires.

Cellules procaryotes (toujours unicellulaire) Cellules eucaryotes (unicellulaire ou pluricellulaire)

Structure gnrale dune cellule eucaryote:

Schmatisation des diffrences entre cellules animales et cellules vgtales

Les mthodes dtude de la cellule

1. Mthodes Morphologiques 2. Mthodes Physico-chimiques et Biochimiques 3. Mthodes Physiologiques

I. Mthodes Morphologiques
Etude de la morphologie cellulaire et tissulaire Observation Moyens optiques et physiques permettant dagrandir la taille relle de la cellule Microscopes M. Photoniques M. Electroniques

microscope optique

microscope lectronique

Echelle de taille et puissance des microscopes

1m= 1000 mm = 1000 000 m = 106 m= 1000 000 000 nm = 109 nm = 1010 A

cellule vgtale: 10 50 m cellule animale: 5 20m bactrie

membrane plasmique 5 7 nm

protine globulaire

La microscopie : Mthode dtude morphologique et dinvestigation fonctionnelle :

Rappels : La microscopie est une mthode morphologique et dinvestigation fonctionnelle. Lobservation est restreinte aux objets laissant passer : La lumire pour la microscopie photonique : Cellules vivantes (1 quelques couches), Coupes fines de tissu : 5 10 m. Les lectrons pour la microscopie lectronique transmission : Coupes ultrafines : 50 100 nm de tissu, Objet entier : virus isols, macromolcules isoles.

1- chelles de taille des tissus

X1

X10

X100

1000X

1.104 X

1.105 X

Petite Histoire de la Microscopie

Les premires donnes certaines que l'on possde sur le pouvoir grossissant des lentilles convexes, en l'occurrence les loupes, remontent au XIIe sicle. Roger BACON moine franciscain anglais, (XIIIe sicle) 1665 : Robert Hooke dcouvre des cellules dans du lige en utilisant les premiers microscopes. 1677 : Antoine van Leeuwenhoek, connu pour ses amliorations du Microscope. Zeiss: fin XIXme sicle fait voluer le microscope optique (MO) avec la lentille. 1930: Microscope interfrentiel permettant d'observer des cellules vivantes 1930: Microscope lectronique (ME) 1945: Premire description des organites cellulaires 1945: Immunofluorescence 1988: Microscope confocal

Les mthodes dtude de la cellule

1. Les techniques microscopiques I. La microscopie photonique A.Gnralits 1. Dfinition : examen dobjets agrandis en prsence de photons (UV & visible) 2. Domaines dapplication : jusqu 0.2 m

I. L es Microscopes Optiques (MO) 1. Microscope optique (MO) ou photonique Il est constitu de bas en haut: La lumire place tout en bas. Le condenseur qui condense la lumire sur la prparation La platine sur laquelle repose l'chantillon L'objectif qui permet d'agrandir l'image 4-10-40x L'occulaire qui agrandit 10 x l'image. Le grossissement va donc de 40 400x. Les contraintes sont tablies par: La qualit des lentilles de verre La capacit de la lumire traverser l'chantillon observer.

NOTIONS THEORIQUES La lumire

La lumire est une forme d'nergie qui les proprits du rayonnement lectromagntique. La lumire est dtecte par l il et peut tre galement dtecte par ses effets thermique s, chimiques et lectriques. La lumire se propage par ondes concentriques autour de la source mettrice. L'nergie lumineuse peut se propager dans le vide sous forme de vibrations dont le caractre dominant est d'tre sinusodal. Dans le vide, la vitesse de la lumire est de : 2,99792458.108m.s-1 (#300 000 km/s). Llment constituant de la lumire est le photon Longueur d'onde (): est la distance parcourue par l'onde lumineuse durant un temps (T) appel priode.

Polarisation: c'est la faon dont volue la direction du champ lectrique

au cours de la propagation. Elle peut tre linaire, circulaire ou alatoire (dans ce cas, on parle d'onde non-polarise).

Interaction dune onde lumineuse avec la matire Lors de l'interaction de la lumire avec la matire, le milieu travers peut tre dcrit par une proprit unique : l'indice de rfraction, not n. Il caractrise un milieu translucide La vitesse de la lumire dpend de l'indice n pour une longueur d'onde donne suivant la formule suivante :

n=c/v

c: vitesse de la lumire dans le vide; v: vitesse dans le milieu translucide L'indice n est toujours suprieur ou gal 1 Indices de rfraction de quelques milieux : Indice de rfraction de l'air = 1 "de l'eau = 1,33 "du glycrol = 1,47 "de l'huile immersion = 1,515 "du verre 1,4 < n < 1,9 "du Baume du Canada = 1,528

La rflection Un faisceau lumineux qui rencontre une surface polie se rflchit avec les proprits suivantes (lois de la rflexion) : 1. Le rayon incident, le rayon rflchi et la normale sont dans un mme plan. 2. L'angle de rflexion est gal l'angle d'incidence. La rfraction La rfraction apparat lors du passage de la lumire dun milieu dindice n1 dans un milieu dindice n2. Le trajet de la lumire est alors dvi dun angle qui dpend de langle dincidence et du rapport des indices de rfraction des deux milieux, suivant la formule : n1 sin(i1) = n2 sin(i2)

Lois de la rfraction: 1. Le faisceau incident, le rayon rfract et la normale au dioptre sont dans le mme plan. 2. Le sinus de l'angle d'incidence (i) est dans un rapport constant avec celui de l'angle de rfraction (r): n1.sin(i) = n2.sin(r)

Le pouvoir de rsolution = le pouvoir de sparateur

Le pouvoir de rsolution dun appareil grossissant est donn par la distance entre deux points les plus rapprochs qui peuvent encore tre distingus lun de lautre. Plus petite sera cette distance, meilleur sera le pouvoir de rsolution. Le pouvoir de rsolution de lil est de 0,2mm ( 25 cm). Pour le microscope ordinaire, il est de lordre de 0,3m, cest--dire que si 2 traits diffrents sont spars par une distance (d) avec d> 0,3m, on pourra distinguer un trait de lautre. Si d< 0;3 m, on ne peut voir quun seul trait (les deux traits sont confondus). Le M.E en transmission, le P.r. =0,1 nm

A. Le microscope fond clair

1. Description a.Partie mcanique Statif Tube binoculaire Tube porte objectif b. Partie optique Source lumineuse Systme condenseur diaphragme Objectifs 4x/10x/40x/100x Oculaires 10x/

2. Principe de formation de limage Principe du microscope Un microscope peut-tre vu comme deux lentilles convergentes: la premire produit une image relle grossie et inverse la seconde produit une image virtuelle de la premire image cette image virtuelle est focalise par l'il pour donner une image virtuelle trs agrandie l'infini

L'objectif donne de l'objet AB observ une image relle A1B1 renverse et trs agrandie qui joue pour l'oculaire le rle d'objet rel. L'oculaire donne de cet objet une image virtuelle A2B2 agrandie, vue par l'observateur : l'oculaire est utilis comme une loupe. Enfin, lil forme une image de l'objet A2B2 sur la rtine.

a. Objectif image agrandie inverse relle b. Oculaire image intermdiaire agrandie inverse virtuelle

La microscopie fond clair permet dobserver des prparations colores (sans coloration, on ne voit rien).

3. Caractristiques essentielles du microscope a.Ouverture numrique : ON = n . sin a b.Limite de sparation :

Pouvoir de rsolution : 1/d a.Grossissement: G = g1 X g2

d= 0,61 *
/ n sin
On peut donc amliorer la rsolution de deux manires : En augmentant l'indice de rfraction. en utilisant un objectif immersion dans un liquide dont l'indice de rfraction est proche du maximum de 1,5 - celui du verre. Vide = 1 Air = 1,00029 Eau = 1,33 Glycrol = 1,47 Verre = 1,5 Huile = 1,512 En diminuant la longueur d'onde. Toutefois, si on reste dans la lumire visible, il n'est pas possible de descendre en dessous de 400nm. (le microscope lectronique utilise des e- de trs faible
) La limite de rsolution d'un microscope photonique classique
0,2 m.

Limage que reoit lobservateur travers le microscope fond clair est forme par les rayons lumineux qui ont travers lobjet aprs avoir t mis par la source. Il est bien vident que, pour ce faire, lobjet doit tre trs transparent, et donc trs mince.

4.Applications a. Histologie b. Hmatologie c. Parasitologie d. Bactriologie (frottis)

La microscopie fond clair ncessite souvent une coloration

Coloration lhmatoxiline / osine des tubes collecteurs du rein

L'ensemble de ces systmes ont une limite: la rsolution qui est limit par: la longueur d'onde de la lumire du systme optique de l'indice de rfraction du milieu entre la prparation et l'objectif (Note: les Objectifs Immersion sont baigns dans l'huile et permettent un agrandissement x100). le cne de lumire entre l'objet et la lentille (donn par la moiti de l'angle, soit ~70) La rsolution maximale thorique est de 0,2 microns, or les organites ont une taille infrieure 0,2 microns.

5 CONDITIONS DOBSERVATION
-objets transparents la lumire
Faible paisseur: coupes semi-fines (5-10) ou fines (2- 5
); - Prsentant des contrastes ou des colorations naturelles, sinon, recours des moyens chimiques (colorations) ou physiques (M. contraste de phase ). La prparation doit donc tre fine: Dans le cas d'un talement cellulaire (frotti sanguin): on dpose la goutte de sang sur une lame, et l'aide d'une lamelle on tale la goutte jusqu' obtenir une monocouche de 1-2 microns d'paisseur. Pour une culture cellulaire: les cellules se multiplient et le cytoplasme est assez fin.

 En cas de prlvement de tissus, celui ci doit tre coup une fois durci, et cela peut se faire de deux manire: * Conglation du tissu qui pourra ensuite tre coup l'aide d'un Cryostat. * Enrobage dans une inclusion de Paraffine, ce qui est plus long et peut dtruire les cellules si on ne les fixe pas au Formaldhyde ou Formol qui va stabiliser les protines en formant des liens entre elles. Les Lipides eux ne seront pas conservs. La paraffine est solide temprature ambiante, mais est liquide 55C, insoluble dans l'eau. Ainsi, le prlvement doit tre d'abord baign dans des solutions d'thanol concentrations de plus en plus levs. L'alcool se substituera l'eau. Cependant, la paraffine n'est pas totalement miscible avec l'thanol. L'chantillon sera alors baign dans du Tolune, aprs quoi il sera baign dans de la paraffine qui va elle mme se substituer au tolune.

6 PREPARATION DECHANTILLONS BIOLOGIQUES

a)Etude de cellules ou de tissus vivants b) Etude de cellules ou de tissus tus Plusieurs tapes: -Fixation; -Dshydratation; - inclusion; -coupes; - coloration - montage

a) Observation de cellules vivantes - Risque de desschement des cellules: utilisation de liquides physiologiques et/ou boite de cultures cellulaires. - Si les structures ne sont pas naturellement colores: utilisation de procds chimiques (colorants vitaux) ou physiques (M. contraste de phase) pour les visualiser.

Quantification de spermatozodes dans le sperme frais (test de Williams) Colorants : osinenigrosine

Clomocytes de ver de terre (observation vitale, objectif immersion x 1000)

microscopie en champ clair

microscopie en contraste interfrentiel (Nomarski)

microscopie en contraste de phase

microscopie en champ noir

b) Etude de cellules ou de tissus tus

1- Fixation La fixation a pour but de tuer les cellules et de les conserver dans un tat aussi proche que possible de ltat vivant. On ralise donc avant de les observer des frottis ou des coupes histologiques. La fixation peut tre : - une fixation physique (conglation, fixation la chaleur) - une fixation chimique (fixation lalcool 98%) A la fixation sajoute, pour les prparations histologiques des tapes de dshydratation puis dinclusion. Linclusion consiste enrober lchantillon pour pouvoir raliser des coupes les plus fines possibles. On inclue en gnral les tissus dans de la paraffine ou de la rsine.

- Les fixateurs prservent la structure des cellules mortes en crant des liaisons chimiques trs stables entre les molcules.

La fixation se fait par le formaldhyde et le glutaraldhyde, qui sont des aldhydes trs ractifs. Malheureusement la fixation tue les cellules mais permet leur immobilisation et leur conservation. Elle se fait avec un mlange dacide thanol (dnaturation et prcipitation des protines) et daldhyde (fixation) Microscopie optique : Acide actique + Formaldhyde

2- Dshydratation: La dshydratation permet llimination de leau en la remplaant par des solvants de types xylne et tolune. leau est retire de la cellule au cours de passages successifs dans des bains dalcool de plus en plus concentr. 3- Inclusion: Lobjectif est de solidifier le tissu fix pour raliser des coupes fines et rgulires. Pour la microscopie optique, linclusion se fait dans la paraffine. Or, la paraffine est hydrophobe, non miscible lalcool Ncessit de passage par un milieu intermdiaire: Eau
Alcools (50-70-90-100)
Tolune
Paraffine

Ces produits sont hydrophobes (miscibles dans les hydrocarbures). Il est donc ncessaire de faire une dshydratation pralable avec de lthanol qui a cet avantage dtre miscible dans leau mais aussi dans les hydrocarbures. Milieu aqueux " Ethanol 70% " Ethanol 95% " Ethanol 100% " Xylne ou Tolune = hydrocarbures (2 bains) Puis : de la paraffine 65C (liquide) Durcissement temprature ambiante

4- Confection des coupes :

Pour la microscopie optique, on utilise un microtome (rasoir) pour obtenir des coupes sries de 5 10 m que lon rcupre laide dun pinceau.
Spcimen lame du microtome coupes de tissus

coupes de tissus dposes sur lame de verre

COLORATION

- Coupe du spcimen

A. Blocs de paraffine; B. Microtome (le bloc est dbit en coupes fines); C. Etalement des coupes sur les lames de verre sur une plaque chauffante.

5- Coloration et montage

-Avant la coloration: il faut dabord dparaffiner les cellules (bains de tolune), puis les rhydrater dans des bains dalcools de moins en moins concentrs. Tolune
Alcools 100-95-70)
Eau
Coloration -Aprs la coloration: les coupes seront de nouveau dshydrates (bains dalcool de degr croissant). Coloration
Alcools (70-95-100)
Tolune
Montage Montage dans une rsine ayant mme indice de rfraction que le verre (Baume de Canada ou Eukitt)

Pour la microscopie optique, on utilise la coloration. Absorption de certaines longueurs donde de la lumire par un groupement chromophore (phore = qui gnre). Le chromophore est un groupement molculaire constitu de doubles liaisons conjugues, de composs aromatiques. Colorants basiques (cations), comme le bleu de toluidine ou lhmatoxyline, qui se fixent sur les molcules du tissu charges ngativement. Colorants acides (anions), comme losine, qui se fixent sur les molcules du tissu charges positivement. Autres colorants : molcules hydrophobes (comme les lipides) ou intercalant de lADN.

Colorations signaltiques Hmatoxyline- Eosine (foie)

Coloration au PAS (glandes duodnales, scrtion du mucus)

Coloration de Perls Hmisidrose intrahpatocytaire (mise en vidence du fer ferrique)

MESSAGE En cas de prlvement de tissus, celui ci doit tre coup une fois durci, et cela peut se faire de deux manire: Conglation du tissu qui pourra ensuite tre coup l'aide d'un Cryostat. Enrobage dans une inclusion de Paraffine, ce qui est plus long et peut dtruire les cellules si on ne les fixe pas au Formaldhyde ou Formol qui va stabiliser les protines en formant des liens entre elles. Les Lipides eux ne seront pas conservs. La paraffine est solide temprature ambiante, mais est liquide 55C, insoluble dans l'eau. Ainsi, le prlvement doit tre d'abord baign dans des solutions d'thanol concentrations de plus en plus levs. L'alcool se substituera l'eau. Cependant, la paraffine n'est pas totalement miscible avec l'thanol. L'chantillon sera alors baign dans du Tolune, aprs quoi il sera baign dans de la paraffine qui va elle mme se substituer au tolune.

Le bloc sera coup l'aide d'un Microtome qui est un appareil constitu d'un support sur lequel repose l'chantillon sur lequel passe la lame d'un couteau. L'paisseur de la coupe est d'environ 4-8 microns. Ces coupes seront transfres sur une lame. Cependant, cette coupe est tellement fine qu'il y a trop peu de contraste, il faudra alors la colorer l'hmatoxyline-osine (hmatoxyline pour le noyau, osine pour le cytoplasme)par exemple. Mais on ne peut pas colorer la lame puisqu'enrobe par la paraffine. On suit alors le procd inverse: dparaffination et rhydratation. On va alors protger cette coupe en la mettant dans un milieu de montage qui doit tre transparent, et qui sera soit acqueux soit non miscible l'eau mais avec les solvants (et donc refaire la dshydratation). Ces cellules sont figes/mortes: aucune activit ne pourra tre releve.

Prparation des chantillons en microscopie optique

Les diffrents types de microscopes photoniques

A. Le microscope fond clair B. Le microscope fond noir C . Le microscope polarisant D. Le microscope contraste de phase E. Le microscope interfrentiel diffrentiel (DIC) F. Le microscope en fluorescence G. Le microscope confocal

Les diffrents types de microscopes photoniques

B. Le microscope fond noir
Dans cette microscopie, limage est cre par la diffraction de la lumire. La lumire difracte par la prparation permet la formation de limage. Sans prparation, la lumire narrive pas lobjectif do le fond noir. La prparation donne donc une image sur fond noir.

1. Principe a.Eclairage par un condenseur fond noir b.Aucune lumire ne pntre dans lobjectif c.Observations des contours de la cellule par diffraction 2. Applications: Bactriologie

Avec le microscope fond noir, seuls les rayons lumineux diffracts par lobjet concourent la formation de limage.

Globules rouges et blanc Obj. 40x - fond noir lger

C. Le microscope polarisant
1.Principe La lumire polarise, contrairement la lumire naturelle, est une lumire qui vibre dans une seule direction. Pour obtenir une polarisation de la lumire, la lumire normale est filtre par des dispositifs qui ne laissent passer qu'une seule catgorie de vibrations parmi toutes celles qui la composent. Deux lentilles sont places sur le trajet de la lumire, l'une sur le condenseur (polariseur), l'autre sur l'oculaire (analyseur). 2. Applications Observation des rgions birfringentes (structures cristalines et semi-cristalines).

La thorie ondulatoire de la lumire prtend que celle-ci, ltat naturel, vibre de faon alatoire dans toutes les directions qui sont perpendiculaires son axe de propagation. Le microscope polarisant offre la possibilit de slectionner le plan de vibration des rayons lumineux, et dorienter lobjet volont par rapport ce plan.

Lutilisation la plus gnrale du microscope polarisant est dordre minralogique. Il permet en effet, par tude des proprits optiques dune lame mince de roche, den dterminer les divers constituants, qui, suivant leur nature et le plan de vibration des rayons lumineux, prennent une couleur dtermine.

Des grains d'amidon observs au microscope polarisant prsentent le phnomne de la croix noire. Cela montre que les molcules d'amidon sont orientes de manire rayonnante partir d'un point central, le hile.

Contraste de phase. Pour obtenir de bons rsultats en fond clair, les objets doivent tre contrasts. Pourtant, la plupart dentre eux, ltat naturel, le sont peu, et cest pourquoi on a recours une multitude de processus de coloration. Mais la plupart des substances colorantes sont toxiques et tuent les cellules, ce qui exclut lobservation de leur volution au cours du temps. Cest ce qui a motiv la mise au point des microscopes contraste de phase, qui permettent dtudier les cellules les plus transparentes tout en les conservant vivantes. Dune manire gnrale, on peut distinguer, en microscopie, deux catgories dobjets: les objets damplitude et les objets de phase. Les corps plus ou moins colors ou noirtres, que ce soit naturellement ou aprs un traitement spcifique, constituent la catgorie des objets damplitude. Ce sont ceux que lon tudie laide du microscope fond clair. Au contraire, les objets transparents, difficilement observables en fond clair, font partie des objets de phase. Ce sont ceux quon observe par

D. Le microscope contraste de phase

Il utilise le fait que lorsque la lumire traverse la cellule, elle rencontre des structures qui vont dvier ses ondes, donc celles-ci vont sortir soit en phase, soit dphases. Cette diffrence sera l'origine d'un lger contraste qui fera apparatre les diffrentes structures intracellulaires qui possdent des indices de rfraction diffrents. La microscopie contraste permet lobservation vitale de cellule en culture (monocouche) 1.Principe a.Objectif avec anneau de phase intgr b.Modification de la phase des rayons lumineux en variation dintensit lumineuse 2.Applications a.Observation de cellules vivantes

Microscopie contraste de phase

Il y a un phnomne de halo, c'est--dire quon voit une ligne blanche autour des reliefs mme si limage reste plate. Il ny pas de rel relief mais une impression de relief d au contraste de limage. Le contraste de phase donne du contraste des objets/lments qui nen ont pas.

Exemple : cellules en culture dans une boite.

Cette technique Contraste de phase permet de transformer une diffrence dindice de rfraction dans lchantillon en une diffrence dintensit. Le principe consiste clairer lchantillon avec un anneau lumineux (obtenu en plaant une plaque perce dun anneau dans le condenseur) et rcuprer la lumire avec un objectif spcial comportant une plaque de phase, cest--dire une plaque avec un anneau entrainant un dphasage de la lumire le traversant. Seule la lumire non-dvie par lchantillon passera par cet anneau et sera ainsi en opposition de phase avec la lumire diffracte (qui passe dans le reste de la plaque de phase). Il sensuit des interfrences destructrices au plan image ce qui permet dobserver des variations damplitude correspondantes des variations de lindice de rfraction de lchantillon. Lalignement de la plaque de phase et de lanneau du condenseur est particulirement important pour obtenir cet effet.

E. Microscopie contraste interfrentiel diffrentiel (DIC) Appele aussi technique Nomarski.

Le contraste interfrentiel diffrentiel utilise de la lumire polarise. Qu'est-ce que la lumire polarise ? La lumire polarise, contrairement la lumire naturelle, est une lumire qui vibre dans une seule direction. Pour obtenir une polarisation de la lumire, la lumire normale est filtre par des dispositifs qui ne laissent passer qu'une seule catgorie de vibrations parmi toutes celles qui la composent. Deux lentilles sont places sur le trajet de la lumire, l'une sur le condenseur, l'autre sur l'oculaire. Cette technique donne une vision en trois dimensions dun objet translucide. Grce lutilisation de la lumire polarise et dun jeu de filtres spciaux, les images sont observes avec un relief ombr.

1.Principe utilise de la lumire polarise avec un jeux de filtres spciaux. donne une vision en trois dimensions dun objet translucide. les images sont observes avec un relief ombr. 2. Applications Observation de cellules vivantes et pour suivre le mouvement

On claire lchantillon avec une lumire spare en deux polarisations laide dun prisme de Wollaston. Ces deux rayons vont traverser lchantillon en passant par des chemins qui peuvent tre un peu diffrents, puis ils seront combins nouveau par un deuxime prisme pour former des interfrences. Ces interfrences destructives et constructives rvlent les structures intracellulaires, en particulier les membranes (qui prsentent souvent une forte variation dindice de rfraction).

Contraste de phase

Contraste interfrentiel

F. Le microscope en fluorescence
1. Principe de la fluorescence 1. Cest lmission de lumire suite labsorption de photons:
Les molcules fluorescentes (endognes, exognes) absorbent la lumire dune longueur donde spcifique (
dabsorption) et mettent une lumire diffrente (
dmission) 2. Diffrents types de fluorescence 1. Primaire : produite naturellement par certaines substances biologiques (ex : chlorophylle) 2.Secondaire : obtenue artificiellement en liant un compos non fluorescent avec un compos fluorescent (fluorochromes)

2. Les microscopes fluorescence

a. A lumire transmise b.A lumire rflchie (pifluorescence)

Acquisition dimages photos classiques

Ou photos numriques

oculaires

condenseur et sa tourelle

Objectifs sur le revolver platine orientable condenseur et sa tourelle

lampe halogne tungstne

3. Applications : - observation de cellules vivantes
Etude de la physiologie cellulaire. - Bactriologie (cytomtrie sur filtre) - Immunofluorescence (diagnostic clinique: pathologie)

M. en fluorescence

M. en pi-fluorescence

G. Le microscope confocal : rsulte des progrs rcents

1. Principe Ce microscope permet de collecter limage rflchie au niveau dun plan focal et dliminer les images du dessus (dessous) de ce plan par balayage laser 2. Applications Neurobiologie, biologie molculaire. - Source lumineuse: un laser qui balaye rapidement lchantillon (color avec des fluochromes) dans toute son paisseur et sa longueur. -Les images produites sont enregistres par un ordinateur. - Forme une image composite de lensemble de la cellule. - Visualisation de laspect tridimensionnel de la cellule, et examen de lintrieur des cellules -On peut tudier la physiologie cellulaire (exple: la concentration de lATP et les ions calcium)

G. Le microscope confocal -Le microscope confocale ne recueille que la lumire mise au point sur lequel on s'est focalis. - La lumire mise va traverser l'ouverture d'un diaphragme (ouverture confocale) qui ne laissera traverser que la lumire venant d'un point prcis. - Le laser va balayer l'objet point par point sur un plan, puis par plan successif. - Un ordinateur va recrer l'image finale. En chaque point, l'image sera nette.

Type

principe

ncessite

Cellules vivantes non

Cellule s fixes oui

Champs clair

Absorption de la lumire visible Emission de lumire par molcules fluorescentes Variation dpaisseur et dindex de rfraction Gradient dindex de rfraction dans le spcimen

Coloration absorbant la lumire sur chantillon mince Marquage des cellules par molcules fluorescente Cellules plates Aucune limitation

Fluorescence

oui

Oui

Contraste de phase microscopie en contraste interfrentiel (Nomarski Champs noir Polarisation

Oui oui

oui Oui

Dispersion de la lumire Diffrence dindex de rfraction pour des faisceaux pependiculaires de lumire polarise

Spcimen mince, simple lments birfringents (ordonns le long dun axe linaire

Oui Oui

Oui oui

3. Microscope fluorescence Utilis pour dtecter des molcules fluorescentes qui absorbent la lumire a une certaine longueur d'onde et mettent une longueur d'onde plus leve. Des filtres vont permettre d'observer des molcules luminescente sur fond noir. Il faut donc un microscope qui soit dot de 2 filtres: le premier qui ne laisse passer que la longueur d'onde d'absorption le deuxime qui ne laisse que la longueur d'onde d'mission. La fluorescence peut-etre: Naturelle, mise par certains constituants de la cellule Rapporte par des molcules fluorescentes fixes, ou molcule utilis comme detecteur: Immunofluorescence. On peut utiliser deux enzymes: Fluoriscine: qui absorbe le Bleu et met dans le Vert. Rhodamine: absorbe Vert et donne du Rouge.