2.

ANTECEDENTES

Durante el desarrollo de las biotecnologas reproductivas en animales domsticos, la potencialidad de seleccin del sexo de la descendencia es uno de los temas que ha presentado una larga historia de gran optimismo y tambin muchas decepciones. Los fracasos en esta rea se han debido fundamentalmente a la falta de comprensin de los principios bsicos que rigen la determinacin del sexo en mamferos. Muestra de aquello es que en la antigua Grecia, Democrito (407-402 a.C) sugiri que el testculo derecho produca machos y el izquierdo hembras (Garner y Seidel 2008). Sin embargo en la primera mitad del siglo XX se han reportado numerosos hallazgos, entre los cuales se encuentra la identificacin de los cromosomas sexuales (Garner y Seidel 2008). Esto fue el inicio de muchos descubrimientos posteriores sobre la manipulacin de los espermatozoides (Kiddy y col 1971). Las investigaciones sobre la seleccin del sexo de la descendencia en un comienzo se centraron en la bsqueda de las caractersticas fsicas que diferencien las clulas espermticas portadoras del cromosoma masculino y femenino, tales como tamao, peso, densidad, velocidad, cargas elctricas de superficie, protenas macromoleculares, efectos diferenciales de pH y presin atmosfrica (Kiddy y col 1971). Sin embargo en estos estudios iniciales no se encontr una caracterstica que sea determinante, reproducible y que permita identificar y separar espermatozoides femeninos y masculinos (Garner y Seidel 2008). En la dcada de 1950 se determin que el ADN (cido desoxirribonucleico) era un componente esencial de los cromosomas sexuales y Morruzi (1979) fue el primero en sugerir que el ADN poda ser utilizado como un factor de diferenciacin de los espermatozoides. En aquellos estudios se encontr que el cromosoma X de la mayora de los mamferos presentaba mayor cantidad de ADN que el cromosoma Y. En la especie bovina se encontr que el cromosoma Y es ms pequeo y tiene menos ADN que el cromosoma X, estableciendo as una diferencia fundamental para la separacin de las clulas espermticas (Oses y col 2009). El descubrimiento inicial de la diferencia del contenido de ADN de los cromosomas sexuales se produjo cuando uno de los laboratorios de armas ms sofisticadas del mundo, se encontraba estudiando los efectos de la radiacin sobre los seres humanos utilizando semen de ratn como modelo para indicar un dao en el ADN de la lnea germinal (Garner y Seidel 2008). Esta diferencia en el ADN de los cromosomas es caracterstica para cada especie siendo de un 3,8% mayor en el cromosoma X de los bovinos (Oses y col 2009). Al establecer esta diferencia fue posible separar y seleccionar los espermatozoides

mediante la nica tecnologa comprobada para realizar aquella funcin, el citmetro de flujo (Garner y Seidel 2008). Esta tecnologa de rpido crecimiento y desarrollo permite medir y analizar clulas en base a sus caractersticas fsicas (tamao, complejidad celular) o en base a la fluorescencia que emiten tras ser marcadas con un fluorocromo (Laguado 2007). En el caso de las clulas espermticas el proceso se basa en diferenciar los espermatozoides teidos con un fluorocromo que se une al ADN, emitiendo mayor o menor fluorescencia de acuerdo a su contenido de ADN (Parrilla 2005). Inicialmente los estudios sobre la estabilidad del ADN en espermatozoides de ratn y en otros mamferos proporcionaron resultados que no fueron interpretables. Esto debido a que la forma aplanada de la cabeza del espermatozoide (Garner y Seidel 2008), emite una fluorescencia diferente en funcin de la posicin en la que reciben el impacto del laser en el citmetro de flujo (Parrilla 2005). Por lo tanto, es necesario realizar en primera instancia un anlisis de posicin del espermatozoide para que simultneamente y slo en aquellos espermatozoides que pasan en una posicin determinada a travs de la cmara de flujo, sea posible analizar la cantidad de ADN y de este modo poder diferenciar clulas X e Y (Parrilla 2005). El citmetro de flujo fue inicialmente diseado por Daniel Pinkel el ao 1977 y previamente en 1976 por el Dr. Larry Johnson del USDA (United States Department of Agriculture) desarroll la tcnica de sexaje de semen (Garner y Seidel 2008). Esta tecnologa es la nica que ha sido utilizada con xito para la comercializacin de semen sexado en la especie bovina (Rath y col 2009). Adems se demostr que este mtodo de citometra de flujo es capaz de determinar con precisin las diferencias de contenido de ADN entre espermatozoides X e Y de ganado vacuno, ovejas, cerdos y conejos (Oses y col 2009). Por lo dems, esta tcnica presenta una precisin que bordea el 90% de obtencin del cromosoma deseado (De Vries 2010). En los inicios del uso de esta tcnica, los espermatozoides moran como consecuencia del proceso de permeabilizacin a la sonda 40-6diamindino-2-phenylindole (DAPI). Estudios posteriores establecieron que el proceso de tincin utilizando la sonda fluorescente bisbenzimidazole Hoechst 33342 mejoraba la precisin e inocuidad de la tcnica (Garner y Seidel 2008). La produccin de las primeras cras vivas mediante el proceso de sexaje se efectu con espermatozoides de conejo (Garner y Seidel 2008). Este fue el primer informe donde el sexo de la cra fue predeterminado en la concepcin mediante seleccin de espermatozoides vivos en la respectiva poblacin portadora del cromosoma X e Y (Oses y col 2009). En este proceso de sexaje los resultados de la inseminacin con semen portador del cromosoma Y resultaron en 81% machos (17/21), mientras que con espermatozoides

portadores de cromosoma X gener un 94% hembras (15/16) (Garner y Seidel 2008). La inseminacin artificial puede definirse como una biotecnologa que consiste en el depsito de semen en el tracto genital de una hembra en el momento efectivo y preciso para la fecundacin. El origen de la inseminacin artificial, data de historias indocumentadas que establecen que los rabes obtenan semen a partir de sementales pertenecientes a grupos rivales y realizaban una eventual inseminacin en sus propias yeguas (Giraldo 2007). La primera inseminacin artificial la realiz en 1780 el fisilogo italiano Lazaro Spallazani en una hembra canina. Desde entonces esta tcnica ha sido utilizada como el principal mtodo para dispersar rpidamente genes de valor dentro de la poblacin, con el fin de mejorar la calidad gentica de los rebaos (Giraldo 2007). En produccin bovina, la inseminacin artificial es de vital importancia para la utilizacin y comercializacin de espermatozoides sexados por citometra de flujo. Esta tcnica permite el mejoramiento gentico del rebao mediante un aumento del progreso anual y en predios dedicados a la produccin de leche, es de importancia para lograr una mayor generacin de hembras, garantizando la reposicin de futuras vacas lecheras en el rebao (Oses y col 2009). Los citmetros de flujo han evolucionado, sobre todo en trminos de velocidad de separacin de espermatozoides para el uso de semen sexado en forma comercial (Garner y Seidel 2008). A pesar de que el Reino Unido fue el primer pas en comercializar de forma eficaz el semen sexado, este es actualmente producido y usado en mayor escala en Estados Unidos. Esto debido a razones comerciales y productivas como es la mayor demanda de vaquillas de reemplazo en comparacin con Europa (Rath y col 2009). El sexaje de semen por citometra de flujo es una tecnologa bastante costosa para un centro de inseminacin, ya que el costo anual de funcionamiento de una instalacin puede exceder los 2 millones de dlares (DeJarnette y col 2010). Esto resulta en que el costo de la dosis de semen sexado es de 30 a 40 dlares en comparacin a los 10 dlares de una pajuela convencional considerando adems que posee, una menor fertilidad (Cabrera 2009). Debido a esta reduccin en la fertilidad, la aplicacin del semen sexado se recomienda sea especfica en vaquillas para aprovechar su mayor fertilidad y por lo tanto obtener un aumento en la rentabilidad de la inversin (en comparacin con las vacas) (DeJarnette y col 2011). La tecnologa de sexado en primera instancia consta de un proceso de separacin y seleccin espermtica en donde el semen es diluido a una concentracin muy baja. Luego los espermatozoides son sometidos a un proceso de tincin de clulas mediante incubacin por 1

hora a 35C con la sonda fluorescente Hoechst 33342. Esta tincin tiene la capacidad de atravesar las membranas espermticas unindose sin intercalarse a la doble hlice de ADN (Oses y col 2009). Luego los espermatozoides son expuestos a un lser de onda corta, en donde las clulas teidas emitirn fluorescencia de acuerdo a su contenido de ADN. Posteriormente la emisin de fluorescencia ser detectada y cuantificada por un tubo fotomultiplicador (De Vries, 2010). A medida que el flujo de clulas sale por la boquilla del clasificador este es vibrado a alta frecuencia produciendo la formacin de gotas individuales con un espermatozoide en su interior a una tasa que flucta entre 70.00090.000 gotas/seg (Sharpe y Evans 2009). A pesar que no todas las gotas contienen espermatozoides, aquellas que s presentan se les da una carga negativa o positiva de acuerdo a su contenido de ADN. Las gotas que transportan un espermatozoide X sern cargadas positivamente y desviadas hacia el polo negativo de las placas deflectoras. En tanto las gotas portadoras de un espermatozoide Y sern cargadas negativamente y desviadas hacia el polo positivo. No se aplica carga a las gotas que contienen ms de una clula, ni a los espermatozoides muertos o a los que no se les ha detectado precisamente su contenido de ADN permitiendo que estas clulas se eliminen como desecho (Garner y Seidel 2008). Luego los espermatozoides sexados son colocados en tubos de recoleccin que incluyen un medio llamado Testyolk (solucin de Test Tris Glucosa a la que se le aade un porcentaje variable de yema de huevo), que estabiliza las membranas espermticas y amortigua el impacto de los espermatozoides contra el fondo del tubo. Esto es necesario ya que las microgotas impactan sobre la superficie del tubo a ms de 100 Km/h (Parrilla 2005). La orientacin de los espermatozoides con respecto al laser en la cmara de flujo ha sido un factor fundamental para la mejor deteccin de la fluorescencia y las diferencias existentes entre los espermatozoides. Es por esto que Rens y col (1998), desarrollaron un sistema destinado a mejorar el nmero de espermatozoides orientados con el objetivo final de aumentar la eficiencia del proceso de separacin. Este sistema modific una cmara de flujo de las llamadas de chorro en el aire (jet in air) dndole una forma elptica a los extremos (de entrada y de salida) de la misma, generando la orientacin correcta de los espermatozoides, pudiendo llegar a incrementar el porcentaje de clulas orientadas hasta en un 70% (Rens y col 1998). Este incremento trajo consigo la obtencin de 800.000 espermatozoides separados por hora en lugar de los 350.000 obtenidos en las primeras aplicaciones de la tcnica. Sin embargo, el paso definitivo hacia la optimizacin de los equipos lleg con el uso de los citmetros de flujo de alta velocidad (Sharpe y Evans 2009). Estos presentan una tasa de clasificacin aproximadamente 10 veces mayor que los citmetros de flujo de velocidad estndar.

En Chile el uso de esta tecnologa es ms bien reciente, siendo la empresa ABS la primera en comercializar el semen sexado en el pas (Muhlenbrock 2007). En las primeras experiencias de sexaje descritas se ha utilizado semen de toros de carne y leche criados por el productor Ricardo Hevia y toros Holstein del productor Heinz Held. El uso de este semen se ha destinado posteriormente solo a vaquillas y solo en la primera inseminacin 1. En el ao 2005 Goyaike, se asocia con la firma Chilena Lo Valledor y crearon la empresa Cyagra Chile Agropecuaria Ltda, para dedicarse a biotecnologas como la transferencia de embriones y semen sexado2. El primer estudio en el pas fue realizado por Caballero y col (2006), donde se determin la eficiencia de sexaje y la tasa de concepcin en vaquillas inseminadas. La tasa obtenida con semen convencional fue de 77% con respecto al 66% obtenido con semen sexado.

Fuente: http://intranet.uach.cl/dw/canales/repositorio/archivos/1186.pdf Consultado el 28/11/2011 2 Entrevista personal Martin Paranace MV, responsable proyecto Cyagra Chile Agropecuaria Ltda, 2010.

3. OBJETIVOS La presente revisin bibliogrfica y recopilacin de antecedentes tiene como objetivo aportar conocimiento sobre la situacin actual de la utilizacin de semen sexado en la especie bovina, especficamente:

1. Establecer los avances en citometra de flujo para la separacin de

espermatozoides portadores del cromosoma X e Y. 2. Analizar la fertilidad y tasas de concepcin obtenidas con semen sexado.
3. Determinar el dao generado por la citometra de flujo a los

espermatozoides durante su separacin. 4. Analizar los aspectos econmicos del uso de semen sexado bovino. 5. Conocer la situacin del semen sexado en Chile.

4. MATERIALES Y MTODOS

4.1 MATERIALES 4.1.1 Fuentes de informacin 4.1.1.1 Bibliogrfica. El universo de estudio abarcar aquellas publicaciones de artculos cientficos nacionales e internacionales de inters para esta revisin, publicadas en la base de datos online que se seleccionarn entre fechas requeridas. Adems se utilizarn reportes de investigaciones publicadas en libros y revistas cientficas que se obtendrn desde la base de datos de la Universidad Austral de Chile. 4.1.1.2 Entrevista. Las comunicaciones personales sern obtenidas del gerente de empresas ABS Chile para la venta de semen sexado en Chile y del Acadmico Responsable de GOYAIKE S.A.A.C.I Y F Biotecnologa Animal. 4.1.2 Material de registros Se utilizar un PC notebook de uso personal Compact

4.2 MTODOS 4.2.1 Recopilacin de la informacin Esta investigacin estar basada en un formato de tesis terica, en la que se recopilar material bibliogrfico proveniente de publicaciones cientficas empleando el mtodo descriptivo para la confeccin de una revisin bibliogrfica de diseo no experimental La metodologa para la bsqueda del material bibliogrfico se llevar a cabo a travs de la lectura de artculos cientficos relacionados con el semen sexado en bovinos, para luego realizar la recopilacin y seleccin del material que se incluir en esta revisin bibliogrfica. Los criterios de seleccin, inclusin y exclusin para considerar evaluables las publicaciones sern:

Antecedentes generales: Todos aquellos artculos que aportarn informacin para la elaboracin de la introduccin, antecedentes histricos y antecedentes generales del semen sexado. Tema principal del trabajo: Aquellas publicaciones referentes a la fertilidad, dosis, tasa de concepcin del semen sexado en la especie bovina, como tambin el uso de este tipo de semen en el rea de lechera, los aspectos econmicos del uso del semen sexado, la normalidad de las cras resultantes al uso de este

recurso, la situacin actual del semen sexado en Chile y la revisin de un mtodo inmunolgico para el sexaje de los espermatozoides.

Idioma: Se incluirn artculos publicados en idiomas Ingls y Espaol. Exclusin: No sern incluidos en la revisin del material bibliogrfico aquellos artculos considerados irrelevantes respecto al tema principal de este trabajo.

Para la obtencin de los artculos en las bases de datos se utilizarn palabras claves en ingls y espaol. Las combinaciones de palabras sern separadas por los operadores AND y OR para evitar la exclusin de aquellos artculos relevantes para esta revisin. A continuacin se detallan las palabras claves que sern usadas para la bsqueda de la informacin en las bases de datos online. Semen, semen Fertilidad, Fertility Sexaje, Sexing Clasificacion, Espermatozoides, Sorting Spermatozoa Vaca, Cow Citometria, Cytometry Bovino, Bovine Sexado, Sexsorted Magnetico, Magnetic

Vaquilla, Heifer Sonda, Staining Hoechst 33324 Toro, Bull

Los artculos obtenidos sern clasificados y archivados en carpetas con nombres que representarn un tema principal (por ejemplo, dosis comercial del semen sexado bovino), elaborando de este modo una base de datos computacional personal. Se realizarn entrevistas al Gerente de ventas de la empresa ABS Chile con el fin de poder obtener informacin actualizada sobre el uso del semen sexado en la especie bovina y la introduccin de ste al sistema pecuario chileno. Adems va e-mail se solicitar informacin con respecto al uso de semen sexado a la Empresa Goyaike Argentina. 5. PROYECCIONES DEL ESTUDIO 5.1 Mediante los mtodos descritos anteriormente generar bibliografa actualizada del uso de semen sexado bovino.

5.2 Servir de gua para los productores de acuerdo a las ventajas y desventajas del uso de semen sexado bovino.

6. REFERENCIAS

Caballero M., M Recabal, V Montenegro, M Castillo, M Marmolejo, C Pacheco, S Barrientos, M Calvi , M Malcom, M Logercio, M Panarace, F Hermida. 2006. Porcentajes de preez y eficiencia del sexaje en vaquillas inseminadas con semen sexado en Chile, Primeros resultados nacionales. Congreso anual de la sociedad chilena de produccin animal a.g. (Sochipa), Temuco, Chile, Pp 2. Cabrera V. 2009. When to use sexed semen on heifers. Dairy Cattle Reproduction Conference, Minneapolis, EE.UU, Pp 1-10. DeJarnette JM, CR MacCleary, MA Leach, JF Moreno, RL Nebel, CE Marshall. 2010. Effects of 2.1 and 3.5 x 106 sex-sorted sperm dosages on conception rates of Holsteins cow and heifers. J Dairy Sci 93, 4079-4085. DeJarnette JM, MA Leach, RL Nebel, CE Marshall, CR MacCleary, JF Moreno. 2011. Effects of sex-sorting and sperm dosage on conception rates of Holsteins heifers: is comparable fertility of sexed sorted and conventional semen plausible?. J Dairy Sci 94, 3477-3483. De Vries A. 2010. The economics of using sexed semen. Adv in dairy technology 22, 357-370. Garner DL, GE Seidel Jr. 2008. History of commercializing sexed semen for cattle. Theriogenology 69, 886-895.

Giraldo J. 2007. Una Mirada al uso de la inseminacin artificial en bovinos. Revista Lasallista de investigacin 4, 51-57. Kiddy CA. 1971. Sex ratio at birth Prospects for control. En: Hafs HD (ed). American Society of Animal Science, Savoy, IL. Laguado J. 2007. Aplicaciones de la citometria de flujo en microbiologa, veterinaria y agricultura. Rev MVZ Cordova 12, 1077-1095. Moruzzi JF. 1979. Selecting a mammalian species for the determination of X and Y chromosome bearing sperm. J Reprod Fertil 57, 319-323. Muhlenbrock H. 2007. Semen sexado ABS. Minuta anlisis y conclusiones Seminario biotecnologas Reproductivas para el mejoramiento gentico, Valdivia, Chile, Pp 4. Oses MV, MT Teruel, JA Cabodevila. 2009. Utilizacin de semen sexado bovino en inseminacin artificial, transferencia embrionaria y fertilizacin in vitro. Rev vet 20, 138-145. Parrilla I, JM Vazquez, EA Martinez. 2005. Evaluacin de la inocuidad del proceso de separacin espermtica por citometra de flujo en el ganado porcino. An Vet 21, 87-99. Rath D, G Moench-Tegeder, U Taylor, LA Johnson. 2009. Improved quality of sex-sorted sperm: A prerequisite for wider commercial application. Theriogenology 71, 22-29. Rens W, G Welch , LA Johnson. 1998. A novel nozzle for more efficient sperm orientation to improve sorting efficiency of X and Y chromosome bearing sperm. Cytometry 33, 476-81. Sharpe JC, KM Evans. 2009. Advances in flow citometry for sperm sexing. Theriogenology 71, 4-10.