BIOLOGA DE LAS CLULAS TRONCALES

Como se mencion anteriormente, las clulas troncales no poseen caractersticas morfolgicas que puedan utilizarse para su identificacin; por lo tanto, actualmente la forma de reconocer a estas clulas incluye tanto el anlisis inmu- nofenotpico (es decir, la expresin de molculas de membrana antgenos o molculas intracelulares), como el anlisis de la expresin de ciertos genes que pueden actuar como marcadores. Sin embargo, son los ensayos funcionales tanto in vivo como in vitro los que determinan, sin lugar a dudas, la identidad de toda clula troncal. Para ilustrar estos conceptos, tomaremos como ejemplo a las clulas troncales de algunos tejidos. En el sistema hematopoytico humano, la mayora de las clulas troncales hematopoyticas (HSC, del ingls Hematopoietic Stem Cellsj expresan los antgenos CD34, CD90 y CD133, as como bajos niveles de c-kt (CD117); por otra parte, no expresan los antgenos CD38, HLA-DR, CD45RA, CD71 o-cualquier otro antgeno especfico de algn linaje celular (por lo tanto, son clulas linaje negativas). Las HSC de ratn expresan un alto nivel de Sca-1, H-2K y altos niveles de c-kit y CD90, siendo tambin clulas linaje negativas (5). Funcionalmente, las HSC se identifican por su capacidad para repoblar in vivo el sistema hematopoytico de animales mielosuprimidos, es decir, animales cuyo sistema hematopoytico se encuentra disminuido. En ratones, estos estudios se realizan transplantando HSC en ratones irradiados; en el caso de las HSC humanas, se pueden realizar estudios similares introduciendo estas clulas a ratones inmunodoficientes SCID. In vitro, las HSC tanto de humano como de ratn se identifican por su capacidad para generar clulas hematopoyticas por largos periodos de tiempo (varios meses) en cultivos lquidos, los cuales son establecidos en presencia de una capa de clulas adherentes (clulas estromales), que sirven para proporcionar a las HSC un microambiente que las alimenta y regula. La identificacin de las clulas troncales del sistema nervioso central, o clulas troncales neurales (NSC, del ingls Neural Stem Cellsj aquellas que dan origen a las neuronas, los astrocitos y los oligodendrocitos depende tambin del uso de distintos marcadores. Entre los marcadores que se han descrito para las clulas troncales neurales, la nestina, protena del filamento intermedio, es uno de los ms utilizados. Otros marcadores, como las protenas GFAP, vimentina, A2B5 y la protena Sox2, se han utilizado tambin para la identificacin de NSC (6). La actividad de las NSC se ha probado tanto in vivo como in vitro. Dichas clulas pueden ser trasplantadas en el cerebro de ratas adultas, donde son capaces de producir neuronas y gla. Las neuronas generadas in vivo, despus del trasplante, tienen actividad elctrica y establecen conexiones funcionales, exhiben eventos postsinpticos espontneos e inducidos y responden a la aplicacin local de reguladores como el glutamato. In vitro, las NSC son capaces de crecer en cultivos lquidos, como monocapas adherentes o como agrega

dos flotantes conocidos como neuroesferas. Cuando estas ltimas estructuras se cultivan en condiciones apropiadas, pueden dar lugar a neuronas y a gla. En otros tejidos, el empleo de marcadores tambin ha ayudado a la identificacin y aislamiento de clulas troncales. Por ejemplo, en ratones, las clulas troncales de hgado fetal expresan el inmunofenotipo CD29+ CD49f+ c-Met+ c-kit CD45 Terl 19, mientras que las clulas troncales de msculo expresan el fenotipo c-Met+ n-caderina" CD34+ Myf-5+ MyoD; por su parte, las de la epidermis expresan altos niveles de las integrinas pl y a6 y niveles intermedios de la molcula p63 (7-9).

Frecuencia y localizacin espacial de las clulas troncales

En general, la frecuencia de las clulas troncales presentes en los distintos tejidos es muy baja. Esto hace que su identificacin y su estudio representen retos importantes para todos aquellos dedicados a la investigacin de dichas clulas. Por ejemplo, veamos el caso de las HSC. En la vida postnatal de los mamferos, la mdula sea (es decir, el tejido localizado en el interior de los huesos) constituye el sitio principal de produccin de clulas sanguneas y la mayora de las HSC se localizan en este tejido. Aqu, la proporcin de HSC es de 1 por cada 20,000 clulas de mdula sea (es decir, conforman el 0.005% del total de clulas de mdula sea). Se estima que en el ser humano hay aproximadamente 50 millones de HSC, cada una de las cuales puede producir hasta 1013 clulas sanguneas maduras en un periodo de vida normal. La mayora de estas clulas se localiza dentro de la regin endosteal, esto es, en la zona ms cercana al hueso. Conforme las HSC producen clulas con mayor grado de maduracin, stas se localizarn en regiones cada vez ms alejadas del hueso, hasta que las clulas maduras se distribuyen predominantemente en la regin central de la mdula sea, cerca de los vasos sanguneos, listas para entrar a la circulacin (10). Las NSC tambin parecen estar localizadas en reas especficas del SNC. Varias regiones del cerebro de roedores adultos se han identificado como fuentes ricas de dichas clulas, entre ellas, la zona subventricular y la zona subgranular del giro dentado del hipocampo. Tambin existe evidencia de que un nmero significativo de clulas troncales neurales se localiza en la zona subependimal. Recientemente se aislaron NSC del bulbo olfatorio de humanos adultos y se estableci que aproximadamente 1% del total de clulas de este tejido son clulas troncales capaces de autorreplicarse y de producir neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (11). En la capa epidrmica de la piel, las clulas troncales se localizan en la capa basal, esto es, la capa ms profunda de la epidermis. Es interesante mencionar que la frecuencia de clulas troncales en este tejido parece ser mayor que la frecuencia de clulas troncales en mdula sea y cerebro. De hecho, se ha sugerido que aproximadamente 10% de la poblacin de clulas de la capa basal son clulas troncales (12). Cmo se regulan las funciones de las clulas troncales? La viabilidad, autorreplicacin, proliferacin y diferenciacin de las clulas troncales son

procesos extremadamente complejos, que dependen de diversos factores, tanto intrnsecos como extrnsecos. Los primeros involucran a una gran variedad de molculas reguladoras, las cuales estn presentes en la clula de acuerdo con el tejido o linaje al que sta pertenece; los segundos, incluyen a todos los tipos celulares y sus productos, que forman parte del microambiente en el que la clula se desarrolla. En otras palabras, la funcin de las clulas troncales depende de factores reguladores intrnsecos que son modulados por seales externas. Elementos intrnsecos. Los factores intrnsecos reguladores de la funcin de las clulas troncales incluyen a protenas responsables de inducir divisiones celulares, tanto simtricas como asimtricas; factores de transcripcin (FT) nuclear que controlan de manera positiva y negativa la expresin de los genes- molculas reguladoras del ciclo celular y molculas que actan como relojes mitticos y que establecen el nmero de ciclos de divisin posibles dentro de las poblaciones de clulas progenitoras/precursoras. A continuacin, analizaremos brevemente cada uno de los elementos mencionados. Cuando una clula troncal se divide puede dar origen a dos clulas troncales o a una clula troncal y a una clula progenitora (Figura 3). En el primer caso, se trata de una divisin simtrica, pues ambas clulas resultantes son iguales entre s; en el segundo caso se trata de una divisin asimtrica, ya que las dos clulas son diferentes entre ellas. El tipo de divisin que llevan a cabo las clulas troncales parece estar influenciado por ciertas protenas citoplasmticas o membranales, heredadas por cada clula hija durante la divisin mittica. Es decir, las divisiones simtricas y asimtricas de las clulas troncales pueden depender de una distribucin homognea o heterognea de algunas protenas localizadas en la superficie membranal o en ciertas regiones del citoplasma (13,14).

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Figura 3. Divisiones simtricas y asimtricas. Cuando una clula troncal se divide puede dar lugar a dos clulas troncales (a) o a una clula troncal y a una clula progenitora (b). En el primer caso, se trata de una divisin simtrica, pues ambas clulas resultantes son guales entre s; en el segundo caso se trata de una divisin asimtrica, ya que las dos clulas son diferentes entre ellas. A travs de divisiones simtricas se incrementa el nmero de clulas troncales, mientras que con las divisiones asimtricas dicho nmero se mantiene. El nmero de clulas troncales puede disminuir, si al dividirse generan dos clulas progenitoras (c). Esto ltimo llega a ocurrir en ciertas condiciones de stress fisiolgico.

Existe abundante evidencia de que diversos FT (protenas que se unen a regiones promotoras del DNA, activando o bloqueando la expresin de genes especficos) controlan el destino de las clulas troncales. Por ejemplo, dentro del sistema hematopoytico, la expresin coordinada de los genes que determinan un linaje especfico est mediada, por lo menos en parte, por la activacin/supresin programada de FT especficos para determinados linajes o estadios celulares (15). De hecho, cada linaje hematopoytico parece estar controlado por combinaciones nicas de FT, cada uno de los cuales puede ser expresado individualmente en varios linajes. La lista de estas protenas nucleares es bastante amplia e incluye factores como SCL, ,PU.l, GATA-1, GATA-2, CBFp, NFKB y la familia de genes ho- meticos, entre otros. Los cambios en algunos de estos factores pueden causar cambios significativos en el balance celular y de linajes dentro del sistema hematopoytico. Se ha establecido claramente que algunos de estos factores son

absolutamente necesarios para que se realice la hematopoyesis. Por ejemplo, se demostrado que la generacin de clulas hematopoyticas durante el desarrollo totalmente dependiente de la presencia de SCL; sin esta molcula, no hay produccin clulas sanguneas y los animales mueren; por lo tanto dicho FT debe estar presente las HSC embrionarias y fetales.

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Otros ejemplos de la participacin de FT en la regulacin de la funcin de las clulas troncales incluyen a las clulas neurales y epiteliales. La familia de genes bHLH, particularmente las neurogeninas, parecen jugar un papel esencial en la promocin de la neurognesis durante el desarrollo (16). Por otra parte, el FT Mathl, participa en la generacin de los cuatro tipos diferentes de clulas del epitelio intestinal (enterocitos, clulas "goblet, clulas enteroendcrinas y clulas de Paneth) a partir de una clula troncal multipotencial (17). Las etapas del ciclo celular estn fuertemente asociadas con la funcin de las clulas en cada paso de la hematopoyesis. Por ejemplo, para la autorrepli- cacin de las HSC es necesario un ciclo celular lento; para la expansin efectiva de la poblacin de clulas progenitoras se requiere un ciclo celular rpido, mientras que para la expresin de varias funciones de las clulas totalmente diferenciadas, la suspensin del ciclo celular es apropiada y en algunas ocasiones necesaria (18). No se conocen completamente los mecanismos de regulacin del ciclo celular de las HSC, sin embargo, algunas de las molculas estn siendo identificadas. Para mencionar un ejemplo, recientemente se demostr que la quiescencia se mantiene gracias a la molcula p21. De hecho, los estudios realizados n vivo en ratones demuestran que p21 es el interruptor que gobierna la entrada de las clulas troncales al ciclo celular, y que en su ausencia, la permanencia de las clulas en el ciclo celular conduce al agotamiento de la reserva de clulas troncales (19). Existe una fuerte evidencia sobre el papel de la longitud de los telmeros como reloj mittico en clulas somticas. Durante el desarrollo de los tejidos, los telmeros (las regiones distales de los cromosomas) se acortan progresivamente conforme las clulas se dividen; una vez que estas estructuras cromosmicas alcanzan una longitud crtica, la clula es incapaz de dividirse y envejece. En estudios con clulas del sistema hematopoytico se ha observado que las HSC humanas que poseen telmeros largos como las clulas derivadas de hgado fetal o de la sangre de cordn umbilical (SCU) tienen potenciales de proliferacin significativamente mayores a los potenciales de las HSC con telmeros cortos -como las que provienen de la mdula sea de adultos (20). Elementos extrnsecos. Las clulas troncales se desarrollan dentro de rmicroambientes especficos constituidos por distintos tipos celulares y sus productos. En conjunto, estos elementos externos proporcionan seales que controlan la conducta de las clulas troncales, modulando la expresin y actividad de los elementos intrnsecos presentes en la clula. El captulo VII de este libro est dedicado en forma exclusiva a analizar dichos microambientes, por lo que aqu trataremos este tema solo de manera introductoria.

Empezaremos por mencionar que el microambiente en el que se desarrollan las clulas troncales generalmente se compone de diversos tipos celulares, cada uno de los cuales lleva a cabo una funcin especfica. Este hecho es muy importante, pues deja ver que los microambientes son complejos, estructural y funcionalmente. Las interacciones y la comunicacin entre las clulas del microambiente y las clulas troncales pueden llevarse a cabo de muy diversas maneras. Por un lado, puede existir un contacto fsico directo entre ambas, a travs de molculas de adhesin y/o interacciones ligando-receptor. Dicho contacto ha sido demostrado a travs de estudios de microscopa electrnica. Por otra parte, la interaccin entre ambos tipos celulares puede darse de manera indirecta, a travs de sus respectivos productos; es decir, a travs de molculas producidas y secretadas por ellas (21). Por ejemplo, las clulas microam- bientales secretan molculas como la colgena, la fibronectina, la laminina, ios proteoglicanos y otras ms que forman una intrincada red molecular conocida como matriz extracelular. Las clulas troncales expresan en su superficie una serie de molculas (las integrinas) que interactan con dicha matriz. Otro tipo de interaccin es a travs de protenas secretadas por ambos tipos celulares y que se presentan de manera soluble. Una amplia gama de molculas, como los factores de crecimiento, las interleucinas, los interferones, las quimiocinas, etc., son producidas por las clulas del microambiente y llegan hasta la clula troncal, para inducir, o inhibir, su proliferacin, su diferenciacin o su migracin. Dependiendo de la distancia que viajen, dichas molculas llevarn a cabo acciones de tipo endocrino (cuando viajan a travs del torrente sanguneo para alcanzar su clula blanco; este es el caso de la eritropoyetina), parcrino (cuando viajan distancias muy cortas, para actuar sobre clulas vecinas), o autcrino (cuando actan sobre la misma clula que las produjo). En el sistema hematopoytico se han descrito ms de 50 molculas reguladoras, las cuales son producidas por el microambiente de la mdula sea.

Cambios en la funcin de las clulas troncales durante el desarrollo

Cambia la funcin de las clulas troncales somticas durante la ontogenia? La respuesta a esta pregunta parece ser afirmativa, al menos para las HSC. La observacin de que las HSC pueden encontrarse en el saco vitelino, el hgado fetal y en varios tejidos hematopoyticos de mamferos adultos contribuy al concepto clsico de que las clulas troncales representan un tipo nico de clulas inmortales, presentes en nmeros variables en los tejidos en distintos estados de desarrollo. Sin embargo, estudios recientes, tanto in vivo como in vitro, han demostrado que las HSC muestran cambios funcionales muy significativos durante la ontogenia,