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CAPACITACIN DEL ESPERMATOZOIDE

Proceso por el cual adquiere la capacidad de sufrir la reaccin acrosmica necesaria para la fecundacin

CARACTERSTICAS GENERALES Fenmeno reversible No sitio-especfica /No especie-especfica In vivo: en tracto genital de una en celo Tiempo de capacitacin variable Diferencias fisiolgicas entre los spz de una misma poblacin

IMPORTANCIA DEL SEGMENTO INFERIOR DEL OVIDUCTO (ISTMO)

Almacenamiento de spz en el istmo: fenmeno universal Contacto spz-mucosa oviductal: - supervivencia del spz - mantiene la capacidad fecundante y la motilidad Prevencin de la poliespermia

BASES MOLECULARES DE LA CAPACITACIN - Cambios en los iones intracelulares del spz - Cambios en el metabolismo espermtico - Alteracin bioqumica membrana plasmtica

ALTERACIN BIOQUMICA DE LA MEMBRANA Gradual eliminacin y/o alteracin de las glicoprotenas perifricas
(Eliminacin de factores de decapacitacin)

Reordenacin de glicoprotenas integrales Reduccin del colesterol de membrana Cambios en la distribucin y composicin de los fosfolpidos Disminucin de la carga negativa de la mbrana

REACCIN ACROSMICA
Fusin de la membrana plasmtica y la membrana acrosomal externa del spz y exposicin de la membrana acrosomal interna

Proceso por el cual el spz es capaz de penetrar la zona pelcida y fusionarse con la membrana plasmtica del ovocito

CARACTERSTICAS GENERALES
Fenmeno irreversible Requerimiento absoluto en la fecundacin Ocurre en la superficie de la ZP del ovocito antes de penetrarla

BASES MOLECULARES de la R. ACROSMICA - Cambios en los iones intracelulares (Influjo masivo de calcio) - Incremento del pH y AMPc intracelular - Papel de los lpidos fusignicos POSIBLES AGONISTAS NATURALES - cumulus, fluido folicular y oviductal - zona pelcida (ZP3) - progesterona

HIPERACTIVACIN DEL SPZ


Cambio en el modelo de movimiento del spz como consecuencia de la capacitacin

CARACTERSTICAS GENERALES
- incremento de la asimetra - incremento de amplitud de la curvatura flagelar - baja progresin - aumento del empuje generado por el flagelo

SIGNIFICADO BIOLGICO HIPERACTIVACIN Favorece: - la migracin desde el istmo a la mpula - la liberacin del spz del reservorio stmico - el paso a travs de las envolturas del ovocito MECANISMOS DE LA HIPERACTIVACIN - Pocos conocimientos sobre su regulacin - Calcio y AMPc

PREPARACIN DE LOS ESPERMATOZOIDES PARA FIV


LAVADO DE LOS ESPERMATOZOIDES - Sedimentacin por centrifugacin - Centrifugacin a travs de solucin Ficoll TCNICAS DE SELECCIN DE ESPERMATOZOIDES - Tcnica del swim-up - Gradientes de densidad Percoll - Filtrado a travs de columnas - Seleccin de espermatozoides segn el sexo

TCNICAS DE SELECCIN DE ESPERMATOZOIDES


Tcnica del swim-up Gradientes de densidad Percoll

SISTEMAS DE CAPACITACIN IN VITRO

- AGENTES ESTIMULANTES DE LA MOTILIDAD


Inhibidores de la fosfodiesterasa (cafena...) Antioxidantes (GSH) Activadores de la Adenil-ciclasa (bicarbonato)

- MEDIOS BSICOS USADOS COMUNMENTE


DM o defined medium (BO) m-KRB o Krebs-Ringer bicarbonato modificado Medio Tyrode modificado TALP o Tyrode/Albumin/Lactate/Pyruvate etc... - AGENTES CAPACITANTES E INDUCTORES DE LA RA

AGENTES CAPACITANTES Y/O INDUCTORES DE LA RA

Modificacin de la osmolaridad Modificacin del pH Uso de albmina srica bovina Uso de fludo folicular y oviductal Uso del ionforo de calcio Adicin de suero de en el celo

Electropermeabilizacin Liposomas de fosfatidilcolina Progesterona Heparina y glucosaminoglucanos Cultivos de clulas oviductales Papel de -aminocidos y catecolaminas (PHE)

FACTORES QUE AFECTAN LA CAPACITACIN

TEMPERATURA PROCEDENCIA DE LOS ESPERMATOZOIDES USO DE SEMEN FRESCO O CONGELADO VARIACIONES INTER-INTRAESPECFICAS PRESENCIA DEL CUMULUS COMPOSICIN DEL MEDIO DE CAPACITACIN

Fecundacin: proceso multifactorial


El xito de la fecundacin in vitro va a depender en parte de la existencia de un nmero suficiente de espermatozoides viables morfolgicamente normales funcionalmente competentes capaces de fecundar el ovocito capaces de contribuir al desarrollo embrionario

EFICACIA DE LOS SISTEMAS DE CAPACITACIN

TCNICAS PARA EL ANLISIS DE ESPERMATOZOIDES


Objetividad/Repetibilidad/Precisin ANLISIS CLSICOS Espermiograma ANLISIS COMPUTERIZADOS CASA/ASMA/Citometra de flujo ANLISIS BIOQUMICOS TESTS DE FUNCIONALIDAD

TESTS DE FUNCIONALIDAD
Motilidad progresiva Estado de la membrana plasmtica Integridad del acrosoma Funcionalidad mitocondrial Integridad del ADN Capacidad de interaccin con el ovocito

Espermatozoide viable y frtil ????

Motilidad progresiva
Anlisis clsico de la motilidad

MI swim-up (0.26-0.30)

Anlisis computerizado de motilidad (CASA)

Estado de la membrana plasmtica


Extrema Importancia: Responsable de la interacciones celulares con las clulas del tracto genital femenino y con el ovocito y sus envolturas

Tinciones vitales Tinciones fluorescentes citmetro de flujo Test de endsmosis celular

Integridad de la membrana plasmtica

Tinciones vitales clsicas

uso de fijadores objetividad repeticiones coste

Eosina/nigrosina

Integridad de la membrana plasmtica


Tinciones vitales fluorescentes: clulas muertas:
Ioduro de propidio (PI) Hoechst 33258

clulas vivas:

Carboxifluorescena
SYBR-14 Hoechst 33342
uso de citmetro de flujo objetividad repeticiones coste

Integridad de la membrana plasmtica


Test de endsmosis (HOST)
% colas enrolladas 150 mOsm

Test de resistencia osmtica (ORT)


% alteraciones acrosoma ORT (%)= 100- ((AIM+AHM)/2)

Test de resistencia hiperosmtica (HRT)

Integridad del acrosoma


Microscopa Tinciones fluorescentes Tinciones dobles/triples

Integridad del acrosoma


Microscopio ptico, DIC o de contraste de fases

Microscopia electrnica

Integridad del acrosoma Tinciones fluorescentes


Deteccin de material intracelular asociado al acrosoma

Lectinas

Anticuerpos especficos

Marcadores de membrana (CTC)


monitoriza los desplazamientos de calcio dentro de la cabeza del spz

Integridad del acrosoma DOBLES/TRIPLES TINCIONES T.clsicas T.fluorescentes

Funcionalidad mitocondrial
Fluorocromos

JC-1

Mitotracker

Mitotracker + Hoechst 33342

Integridad del DNA


Ncleo del spz: cromatina condensada (doble cadena de DNA y proteinas) La integridad del DNA es vital para el normal desarrollo del zigoto

Integridad del ADN

TUNEL COMET ASSAY

SCSA sperm chromatin structure assay

SCD sperm chromatin dispersion test Halomax

Test funcionales in vitro


capaces de discernir la habilidad de los spz a sufrir pasos especficos en el proceso de fecundacin y desencadenantes del desarrollo del embrin temprano:
seleccin de spz via swim-up (motilidad lineal -fertilidad) habilidad a unirse a clulas epiteliales del oviducto habilidad de sufrir la reaccin acrosmica mediante estmulos exgenos Capacidad de interaccin con el ovocito

Capacidad de interaccin con el ovocito

Capacitacin/Reaccin Acrosmica/Hiperactivacin

Capacidad de interaccin con el ovocito

TESTS DE FUNCIONALIDAD ESPERMTICA BASADOS EN LA FECUNDACIN IN VITRO

Capacidad de interaccin con el ovocito


FIJACIN ESPERMATOZOIDE-OVOCITO

TEST DE PENETRACIN DE OVOCITOS Test de la hemizona (HZA)

Uso de ovocitos de hamster libres de ZP