Arquivos da Faculdade de Veterinria. UFRGS. 29(2):123-129, 2001.

ISSN 0101-5230 Recebido/Received: junho 2001

VIABILIDADE DO SMEN SUNO CONGELADO SUBMETIDO A UM PERODO DE EQUILBRIO PR-CONGELAMENTO COM OU SEM A PRESENA DE PLASMA SEMINAL
VIABILITY OF FROZEN SWINE SEMEN SUBMITTED TO A PRE-FREEZING EQUILIBRIUM TIME IN THE PRESENCE OR ABSENCE OF PLASMA SEMINAL
P.M. OHATA1 , I. WENTZ 2 , M.L. BERNARDI3 , C. CASTAGNA4 & F.P. BORTOLOZZO 2

RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a influncia de diferentes perodos de equilbrio, pr-congelamento, a 22-26C, e da remoo do plasma seminal na qualidade espermtica do smen suno ps-descongelamento. Foram utilizados 3 machos sunos adultos, sendo coletada a frao total de 15 ejaculados, os quais foram fracionados e submetidos aos seguintes tratamentos: equilbrio de 1,5h (T1); equilbrio de 20h (T2) e equilbrio de 20h com remoo do plasma seminal (T3). O congelamento foi realizado pelo mtodo modificado de Westendorf, com 2% de glicerol e envase em palhetas mdias (0,5 mL). O descongelamento foi realizado em banho-maria a 37C por 20 segundos e o contedo da palheta foi diludo (1:6) em BTS. Como parmetros de qualidade espermtica foram utilizados os percentuais de motilidade (Mot), acrossomas normais (Nar) e de membranas ntegras (MI), avaliados aps o descongelamento (PD) e aps teste de termoresistncia a 37C, por 2h (ps-TTR). A integridade das membranas foi analisada atravs dos corantes fluorescentes diacetato de carboxifluorescena e iodeto de propdio. Para as amostras equilibradas na presena de plasma seminal, houve uma diminuio de 13% na MIPD (P<0,05) utilizando 20h de equilbrio em relao a 1,5h, mas no houve diferenas (P>0,05) na Mot e Nar, tanto PD como ps-TTR. O equilbrio de 20h, associado remoo do plasma seminal, resultou em uma diminuio (P<0,05) na Mot e na MI, tanto PD como ps-TTR, em relao ao perodo de equilbrio de 1,5h. Para as amostras equilibradas por 20h, a remoo do plasma seminal resultou em diminuio (P<0,05) da motilidade e MI, somente aps TTR. Na temperatura utilizada (22-26C), um perodo longo de equilbrio (20h) e a ausncia de plasma seminal durante este equilbrio afetaram negativamente a viabilidade dos espermatozides sunos submetidos ao congelamento.
Descritores: congelamento, plasma seminal, smen, suno.

ABSTRACT The aim of this work was to evaluate the influence of different pre-freezing equilibrium periods and the removal of seminal plasma on spermatic viability of swine semen after thawing. From 3 adult boars, 15 whole ejaculates were collected which were fractionated and submitted to the following treatments: equilibrium for 1.5h (T1); equilibrium for 20h (T2) and removal of plasma seminal with equilibrium for 20h (T3). Freezing method was that of Westendorf, with 2% glycerol and storage in 0.5 mL straws. The straws content, thawed at 37oC for 20 seconds, was diluted (1:6) in BTS. The parameters of spermatic quality evaluated after thawing (PD) and after a thermoresistance test, at 37oC, for 2h (TTR), were motility (Mot), normal acrosomes (Nar) and membrane integrity (MI). MI was evaluated by fluorescence with propidium iodide and carboxyfluorescein diacetate staining. In the presence of plasma seminal, there was a decrease (P<0.05) of 13% in MI PD using 20h equilibrium as compared to 1.5h, but there was no differences (P>0.05) in Mot and Nar, both after thawing and TTR. Equilibrium time of 20h associated to the removal of seminal plasma resulted in a decrease (P<0.05) of Mot and MI, after PD and TTR, as compared to 1.5h. When plasma seminal was removed in the samples equilibrated for 20h, there was a decrease (P<0.05) in Mot and MI, only after TTR. A long equilibrium time (20h) and the absence of seminal plasma during this equilibrium, at 22-26C, had negative effects on the viability of swine spermatozoa submitted to freezing.

Key words: freezing, semen, seminal plasma, swine.

1 Mdica Veterinria - MSc em Cincias Veterinrias - Faculdade de Veterinria/UFRGS. e-mail: pmohata@hotmail.com 2 Dr. Prof. Adjunto, Faculdade de Veterinria/UFRGS - Porto Alegre/RS. 3 Dra. Prof. Adjunto, Dept de Zootecnia, FAGRO - UFRGS. 4 MSc, Doutorando em Cincias Veterinrias - FAVET-UFRGS.

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INTRODUO A inseminao artificial em sunos tem crescido amplamente na ltima dcada. Atualmente, estima-se que sejam realizadas em torno de 19 milhes de inseminaes no mundo, sendo que destas, menos de 1% envolvem o uso de smen congelado (Johnson et al., 2000). A maioria das inseminaes conduzida com smen resfriado a 15-18C, proporcionando resultados de fertilidade similares aos da monta natural. Apesar disto, o smen resfriado possui limitaes na sua viabilidade temporal, restringindo o uso das doses inseminantes por perodos mdios de dois a trs dias aps a coleta. Este problema poderia facilmente ser superado com o emprego de smen congelado. No incio da dcada de 60 j eram desenvolvidos trabalhos no intuito de otimizar o protocolo de congelamento de smen suno (Hess et al., 1960). Apesar dos avanos efetuados, no entanto, o uso de smen congelado ainda est associado a ndices reprodutivos insatisfatrios, quando comparados aos obtidos com o emprego de smen resfriado (Almlid & Hofmo, 1996; Mileham et al., 1997; Woelders, 1997). Johnson (1998) cita uma variao de 50 a 70% na taxa de pario e de 7 a 10 leites no tamanho de leitegada. Deste modo, o emprego do smen congelado ainda est restrito ao melhoramento gentico, intercmbio de material gentico entre os pases, repovoamento de granjas, formao de bancos genticos e pesquisas cientficas (Reed, 1985; Scheid et al., 1990). Durante o perodo de equilbrio, a influncia do plasma seminal, na qualidade espermtica ps-descongelamento, tem causado controvrsias. Em alguns casos, a retirada do plasma seminal teve um efeito negativo (Butler & Roberts, 1975), mas em outros a viabilidade espermtica psdescongelamento no foi afetada (Salamon, 1973; Fazano, 1986; KotziasBandeira, 1997).

Pelo acima exposto, evidencia-se a necessidade de mais estudos para aperfeioar o protocolo de congelamento, de modo a obterse maior viabilidade espermtica psdescongelamento e, assim, maiores ndices de fertilidade in vivo, viabilizando economicamente o emprego desta biotecnologia. O presente trabalho teve como objetivo verificar se diferentes tempos (1,5h e 20h) de equilbrio prcongelamento e a presena do plasma seminal, durante o perodo de equilbrio, influenciam na qualidade espermtica aps o congelamento.

MATERIAIS E MTODOS Foram coletados cinco ejaculados de cada um dos trs machos adultos hbridos. A coleta do smen foi realizada com intervalos de trs a quatro dias pelo mtodo da estimulao com a mo enluvada (Hancock & Hovell, 1959) e auxlio de um manequim fixo ao piso. O ejaculado total foi coletado em saco plstico descartvel protegido por um recipiente trmico, previamente aquecido a 38C, com dupla camada de gaze para a separao da frao gelatinosa. O smen foi mantido em banhomaria, a 32C, para avaliao da cor, aspecto, volume e odor, sendo tambm avaliadas a motilidade, a concentrao e a morfologia espermtica. Os critrios utilizados para a escolha dos ejaculados a serem congelados foram os de motilidade superior a 75% e alteraes morfolgicas inferiores a 20%. O congelamento foi realizado segundo a tcnica modificada de Westendorf et al. (1975), com concentrao final de 2% de glicerol e envase em palhetas mdias (0,5 mL). Os ejaculados foram fracionados e submetidos aos seguintes tratamentos: Tratamento 1 (T1) - Perodo Curto (1,5h) de equilbrio a 22-26C. O ejaculado foi diludo 1:1 em BTS, a 32C, e mantido temperatura ambiente (2226C) por 90 minutos. Posteriormente, foi

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resfriado a 15C por 150 minutos e, ao final deste perodo, foi centrifugado (800g por 10 minutos), a 15C, sendo o sobrenadante desprezado e o sedimento (pellet) ressuspendido com diluente de resfriamento (DR - 80 mL de soluo de lactose 11%; 20 mL de gema de ovo). A concentrao de espermatozides no pellet foi estimada utilizando a cmara de Neubauer Improved e, com isso, foi determinado o volume de ressuspenso do DR necessrio para a diluio atingir a concentrao de 1,5 x 109 espermatozides. O pellet ressuspendido foi mantido a 5C por 90 minutos (1,5h) e, aps esse perodo, foi adicionado o diluente de congelamento (DC - 72,5 mL de lactose 11%; 20 mL de gema de ovo; 6 mL de glicerol; 1,5 mL de Orvus-es-Paste - Equex-Paste, Ref.13560/ 0030, Minitb Afll-und Labortechnik GmbH & Co.KG) at atingir uma concentrao final de 1 x 109 espermatozides. Imediatamente aps ter sido acrescentado o DC, foi realizado o envase em palhetas mdias (0,5mL), as quais foram mantidas em vapor de nitrognio (-120C), por 20 minutos e, posteriormente, mergulhadas em nitrognio lquido a -196C. Tratamento 2 (T2) - Perodo Longo (20h) de equilbrio a 22-26C. Imediatamente aps a coleta, o ejaculado foi diludo (1:1) em BTS, a 32C, e mantido temperatura ambiente (22-26C) por 20h. Aps este perodo, o ejaculado diludo foi resfriado a 15C por 150 minutos. As etapas seguintes, envolvendo a centrifugao, at o armazenamento das palhetas em nitrognio lquido, foram similares s descritas para o T1. Tratamento 3 (T3) - Perodo Longo (20h) de equilbrio a 22-26C, na ausncia de plasma seminal. Aps a diluio do ejaculado na proporo 1:1 em diluente BTS, a 32C, foi realizada a centrifugao (800 g por 10 minutos), para a retirada do plasma seminal e a reposio de BTS, no mesmo volume do plasma retirado. Esta ressuspenso foi mantida em temperatura ambiente (22-26C) durante 20h e, posteriormente, resfriada a

15C por 150 minutos (2,5 h). Aps esta etapa, foi novamente centrifugada a 800g, a 15C, por 10 minutos e, ao final deste processamento, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento (pellet) ressuspendido com o diluente de resfriamento. Os procedimentos restantes foram efetuados da mesma forma que os descritos para o T1. Descongelamento do smen e avaliao da qualidade espermtica O descongelamento foi realizado atravs da agitao da palheta com uma pina, em banho-maria a 37C, por 20 segundos (Maxwell & Johnson, 1997). Posteriormente, a palheta foi seca com papel toalha, as extremidades cortadas com uma tesoura e seu contedo ressuspendido com 3mL de diluente BTS, a 37C. O teste de termoresistncia (TTR) foi realizado pela incubao do smen diludo por 2h, em banho-maria a 37C (Almlid & Johnson, 1988). A qualidade espermtica foi verificada pela anlise da motilidade, do percentual de acrossomas normais e do percentual de membranas ntegras, aps o descongelamento e aps o TTR. A anlise da motilidade foi realizada pelo mtodo subjetivo de microscopia (100x), entre lmina e lamnula. Foram avaliadas trs amostras de cada palheta descongelada e diluda com BTS, mantida a 37C por 10 minutos ou por 2 h (TTR). A morfologia do acrossoma foi avaliada a partir da mistura de uma alquota de 40l de smen descongelado em 1mL de formol citrato 2,94%. A amostra, depositada entre lmina e lamnula, foi avaliada pela contagem de 200 clulas espermticas em microscpio ptico de contraste de fase (1000x). A integridade das membranas espermticas foi avaliada pelo mtodo de Harrison & Vickers (1990), no qual uma soluo contendo 950l da dose descongelada e diluda em BTS, 20l de diacetato de carboxifluorescena (20mM), 10l de iodeto de propdio

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(7,3mM) e 20l de paraformaldedo (1,7mM) foi incubada por 8 minutos, a 30C, em banho-maria. Aps esse perodo, uma alquota de 4L foi examinada, entre lmina e lamnula, em microscpio de epifluorescncia (filtro EX/DM/ BF=450-490/510/ 520nm) em aumento de 1000x. Foram examinadas 400 clulas para cada amostra de smen descongelada. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, e a influncia dos tratamentos, dos machos doadores e da sua interao, sobre a motilidade, percentual de acrossomas normais e integridade das membranas, aps o descongelamento e aps o TTR, foi analisada atravs de anlise de varincia utilizando o procedimento GLM (SAS, 1998). As mdias foram calculadas pela opo LSMeans e o teste de Tukey foi utilizado para a comparao das mdias.

RESULTADOS E DISCUSSO Os resultados mdios de motilidade (54%) e Nar (69%), obtidos aps o descongelamento do smen, no presente estudo, encontram-se dentro das variaes observadas em outros trabalhos realizados na rea de criopreservao de smen suno. Com o uso de palhetas mdias, Fazano (1986) e Berger & Fischerleitner (1992) obtiveram, respectivamente, valores de 19% e 30% de motilidade, e de 34% e 50% de Nar. No presente estudo, a avaliao da integridade das membranas espermticas (MI), atravs de colorao fluorescente, resultou em valores mdios de 36% e de 26%, aps o descongelamento e aps o teste de termoresistncia, respectivamente. Com o uso de macrotubos, Almlid & Johnson (1988) obtiveram ndices de MI de 38%, aps o descongelamento, e de 33%, aps o teste de termoresistncia. A MI tambm foi avaliada, aps o descongelamento de smen congelado em bolsas plsticas, sendo obtidas mdias de 23% (Ortman & Rodriguez-

Martinez, 1994) e 41% (Rodriguez-Martinez et al., 1996). A reduo lenta da temperatura do smen suno, aps a coleta e antes de submetlo a temperaturas inferiores a 15C, tem como objetivo diminuir os efeitos deletrios do choque trmico sobre os espermatozides, aumentando a sua viabilidade aps o descongelamento. No presente estudo, o tempo de equilbrio no influenciou (P>0,05) a motilidade e o Nar, tanto aps o descongelamento como aps o TTR (Tabela 1). No tratamento com perodo longo (20h) de equilbrio, entretanto, foi observada uma diminuio (P<0,05) de 13% na MI, aps o descongelamento, e uma reduo de 12% na motilidade ps-TTR (P<0,08), em relao ao perodo curto (1,5h). Contrariamente aos dados do presente estudo, ao analisar a influncia do tempo de equilbrio a 18C sobre a motilidade ps-descongelamento, Kotzias-Bandeira (1997) verificou um aumento significativo de 13%, quando o tempo de equilbrio passou de 1,5h para 20h. A reduo da viabilidade, expressa no presente estudo pela reduo da integridade das membranas e da motilidade, pode ter sido causada pelo fato de que o smen diludo foi exposto a temperaturas entre 22-26C, acima dos 18C (Kotzias-Bandeira, 1997) e 17C (Eriksson & Rodriguez-Martinez, 2000), utilizados em outros estudos. possvel que a temperatura elevada e o longo tempo de exposio, durante o perodo de equilbrio, no presente estudo, tenham sido prejudiciais aos espermatozides, devido a alteraes metablicas ou mesmo a alteraes nas caractersticas das membranas espermticas. Os ndices de motilidade e membranas ntegras, aps o descongelamento e ps-TTR, alm dos ndices de Nar ps-TTR, observados no tempo de equilbrio de 1,5h (T1), foram superiores (P<0,05) aos observados no tempo de 20h, quando este ltimo foi associado remoo do plasma seminal (T3). No houve efeito negativo da remoo do plasma seminal na Mot, Nar e MI, aps o descongelamento, mas houve uma reduo (P<0,05) na Mot e MI, quando

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Tabela 1 Viabilidade do smen suno (% erro-padro) submetido a diferentes perodos de equilbrio a 2226C, antes do congelamento Tratamentos Parmetros de viabilidade Motilidade ps-descongelamento Motilidade ps-TTR Nar ps-descongelamento Nar ps-TTR Membranas ntegras ps-descongelamento Membranas ntegras ps-TTR
T1=1,5h, T2=20h e T3=20h e sem plasma seminal a, b na mesma linha (P<0,05)

T1 (n= 15) 60,2 1,6a 51,0 2,2a 67,8 3,6a 40,6 3,7a 46,0 2,7a 34,3 2,5a

T2 (n= 15) 53,3 39,4 71,5 33,2 32,9 26,8 2,1ab 4,0a 1,8a 3,1ab 3,6b 3,4a

T3 (n= 15) 48,3 32,5 67,4 31,5 28,5 17,1 4,0b 5,2b 3,8a 4,3b 4,1b 2,6b

avaliadas aps o TTR, em relao ao tratamento com mesmo tempo (20h) de equilbrio e presena de plasma seminal (T2). difcil de estabelecer se este efeito se deveu exclusivamente ausncia do plasma seminal ou tambm ao efeito da centrifugao. Informaes quanto sensibilidade do espermatozide suno centrifugao so escassas. A centrifugao do smen suno, por 10 min a 800g, classicamente utilizada nos protocolos de congelamento. Salamon (1973) observou que a centrifugao a 1000g por 10 minutos causou efeitos deletrios na motilidade de espermatozides sunos. Pode ser cogitado que a realizao de duas centrifugaes, uma para a remoo do plasma seminal e outra no prprio congelamento, tenha acarretado danos aos espermatozides. Fazano (1986), no entanto, no detectou reduo na motilidade e Nar, aps o descongelamento, quando o smen foi submetido a duas centrifugaes de 800g por 10 minutos cada. Resultados contraditrios tm sido observados no que diz respeito influncia do plasma seminal na qualidade espermtica (Paquignon, 1985). Pursel et al. (1972) reportaram que o plasma seminal torna o espermatozide suno mais sensvel ao choque trmico. De fato, espermatozides ejaculados so mais sensveis ao congelamento do que espermatozides epididimrios, embora no esteja comprovado que a maior sensibilidade se

deva exclusivamente ao contato com o plasma seminal (Rath & Niemann, 1997). Tambm h controvrsias no que diz respeito remoo ou no do plasma seminal, aps a ejaculao, antes de efetuar o congelamento. Salamon (1973) observou que a retirada do plasma seminal no interferiu na viabilidade ps-descongelamento e Moore & Hibbit (1977) no observaram diferenas na viabilidade dos espermatozides, antes e aps o congelamento, utilizando ejaculado total ou ejaculado de machos sem vesculas seminais. Da mesma forma, Kotzias Bandeira (1997) tambm no observou nenhuma influncia do plasma seminal na qualidade espermtica, ao adicion-lo na frao rica. A remoo ou no do plasma seminal, aps a coleta e diluio, no acarretou em efeitos prejudiciais aos espermatozides submetidos ao congelamento (Fazano, 1986). Com base nas observaes citadas e os resultados obtidos neste experimento, um procedimento extra de centrifugao, envolvendo a remoo do plasma seminal, alm de tornar o protocolo de congelamento menos prtico, no apresenta benefcios que justifiquem sua incluso no protocolo de congelamento de smen suno. Ao considerar o efeito dos machos na qualidade espermtica ps-descongelamento foi constatada uma variao significativa (P<0,05) entre os mesmos (Tabela 2), mas no foi observado efeito (P>0,05) da interao macho e tratamento. Essas diferenas observadas en-

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tre machos quanto viabilidade espermtica aps o congelamento (Tabela 2) confirmam as constataes efetuadas anteriormente por vrios pesquisadores (Larsson & Einarsson, 1976; Larsson, 1978; Mies Filho et al., 1978; Cster-Cuevas, 1978; Fiser et al. 1996; Rodriguez-Martinez et al., 1996; Reed, 1985; Roca et al., 1999). No que diz respeito espcie suna, alguns autores (Woelders et al., 1996;

Almlid & Hofmo, 1996; Johnson et al., 1981) citam que diferenas raciais influenciam na congelabilidade do smen. No presente estudo, apesar da composio gentica semelhante, foram observadas diferenas entre os machos, aps o descongelamento, de at 18% no Nar e de 10% na motilidade, demonstrando que outros fatores tambm devem estar envolvidos nessa variao.

Tabela 2 Efeito do macho sobre a viabilidade de smen suno (% erro-padro) submetido ao congelamento

Parmetros de viabilidade Motilidade ps-descongelamento Motilidade ps-TTR Nar ps-descongelamento Nar ps-TTR Membranas ntegras ps-descongelamento Membranas ntegras ps-TTR
a,b na mesma linha (P<0,05)

M1 (n=15) 60 50 73 46 40 30 1,6a 3,9a 1,6a 2,9a 3,5a 3,3a

Machos M2 (n=15) 50 38 76 39 34 28 3,7b 3,6ab 1,4a 1,9a 4,0a 3,3ab

M3 (n=15) 51 35 58 21 33 20 2,8b 4,8b 3,5b 3,3b 4,1a 3,0b

CONCLUSES Na presena de plasma seminal, um perodo longo (20h) de equilbrio, a 22-26C, afetou negativamente a integridade das membranas espermticas, aps o descongelamento, mas no a motilidade e Nar, em relao a um perodo curto de equilbrio (1,5h). A ausncia de plasma seminal, durante um perodo de equilbrio de 20h, diminuiu a viabilidade espermtica (motilidade e integridade das membranas) ps-TTR.

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