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PR OTE NA S
MTODOS DE SEPARAO, PURIFICAO, QUANTIFICAO E CARACTERIZAO DE PROTENAS.
Cromatografia por filtrao em gel Cromatografia de permuta inica Cromatografia de afinidade Cromatografia de HPLC
28-03-2011
As amostras de protenas so carregadas em poos na extremidade superior do gel de acrilamida. As protenas movem-se dentro da malha do gel quando a corrente elctrica aplicada.
As protenas so visualizadas por tratamento com corantes (ex. azul de Coomassie, nitrato de prata) que se liga s protenas mas no ao gel. Cada banda representa uma protena diferente; possvel determinar a massa molecular da protena por comparao com a migrao de protenas de pesoconhecido (log MW!!!)
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Permite determinar o peso molecular de uma protena Permite analisar os estados oligomricos de uma protena (monmero, dmero, trmero, etc) Com uma resina de poro muito pequeno, pode ser feita troca de tampo ou desalting de solues de protenas.
Cromatografia de afinidade
Separao das protenas atravs da sua especificidade de ligao. As protenas retidas pela matrix so as que se ligam especificamente ao ligando associado malha da matrix. As protenas que no se ligam ao ligando so eludas da coluna pelo tampo e as protenas que ficam associadas so posteriormente eludas usando uma soluo de ligando livre.
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A amostra a dializar colocada dentro de uma membrana de dilise. A membrana imersa em tampo de dilise que cria um diferencial de concentrao atravs da membrana. As molculas vo ter tendncia a difundir am ambas as direces atravs da membrana at atingirem o equilibrio (concentrao idntica em ambos os lados). O processo de dilise pode ser optimizado substituindo o tampo por tampo fresco aps algum tempo, criando-se novo ponto de equilbrio.
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mtodos colorimtricos
Triptofano
Abs
c
Abs280 280
protena ( M )
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quelatao pela cadeia polipetdica do io Cu2+ num meio fortemente alcalino adequado quantificao total de protenas vrias. necessrio fazer uma curva de calibrao com soluo padro de qualquer protena
A sensibilidade baixa (mg) Medem-se as ligaes peptdicas
soluo alcalina, quando reage com a protena. O io Cu+ e o grupo fenol da tyr, indolo do Trp e SH da Cys ento reagem com o reagente FolinCiocolteau, produzindo um producto instvel tipo azul-molibdenio
adequado quantificao total de protenas vrias Mas depende para cada protena, do nmero de resduos Trp, Tyr e Cys. necessrio fazer uma curva de calibrao com soluo padro de protena A sensibilidade grande (~microgramas) Varivel entre protenas Mede-se a A 650 nm.
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reduo alcalina do io Cu2+ a Cu+ pelos resduos aromticos da protena, seguido da sua quelatao e desenvolvimento de cor pelo reagente BCA
adequado quantificao total de protenas vrias Depende da presena de resduos aromticos. necessrio fazer uma curva de calibrao com soluo padro de protena A sensibilidade grande (~microgramas) Varivel entre protenas Mede-se a A 562 nm.
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Sequenciao de um polipptido
6M HCl Free amino acids HPLC ou troca ionica Composio dos aminocidos Determinao do tipo e da quantidade relativa dos amino cidos
Identificao do residuo aminoterminal; purificar e reciclar o polipeptido resultante atravs do processo de degradao de Edman
Sequenciao de uma protena grande: Quebra das protenas, sequenciao e ordenao dos fragmentos peptidicos
1- A composio de amino cidos e o residuo amino terminal so determinados
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Reduo pelo ditiotreitol (DTT) leva formao de dois residuos de cistena. Para prevenir a formao de nova ligao de dissulfureto, o grupo reactivo OSH tem de sofrer nova modificao, como acetilao pelo iodoace
Sequenciao de uma protena grande: Quebra das protenas, sequenciao e ordenao dos fragmentos peptidicos
1- A composio de amino cidos e o residuo amino terminal so determinados
2- quebra de pontes persulfureto 3- Fragmentao com diversos tipos de mtodos e sequenciao pelo mtodo Edman dos fragmentos pptidicos
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Sequenciao de uma protena grande: Quebra das protenas, sequenciao e ordenao dos fragmentos peptidicos
1- A composio de amino cidos e o residuo amino terminal so determinados
2- quebra de pontes persulfureto 3- Fragmentao com diversos tipos de mtodos e sequenciao pelo mtodo Edman dos fragmentos pptidicos 4- conjugao de toda a informao para obter a sequencia da protena Espectrometria de massa base de dados de pptidos
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Imunoblot ou western blot Poos 1 a 3: amostras dos passos de purificao successivos de uma dada protena, separadas em gel SDS Page. Poos 4 a 6. mesmas amostras, aps terem sido transferidas para membrana de nitrocelulose. A membrana depois hibridada com anticorpo especfico contra a protena previamente purificada.
imunocitoqumica. Anticorpos especficos e marcados com corantes so introduzidos nas clulas para identificar a localizao celular de protenas. Ex. Anticorpos fluorescentes foram usados para localizar microtbulos em clulas de Drosophila (DNA em azul).
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inactivar metaloproteases... Ateno a protenas que necessitem de metal. No usar nesse caso. Usar agentes protectores de grupos sulfidrilo, 1mM DTT ou 5-20 mM b-mercaptoetanol.
Usar inibidores de protease Usar glicerol, ou detergentes para estabilizar
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Ovo (albumina, lysozyma, gema) Clara do ovo (albumina, lysozyme) Lisozima pura
Unidade: quantidade do enzima que transforma 1umol de substrato por minuto a 25 C Actividade especfica Unidades de enzima por mg de protena total
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Questes
1. Um estudante desenvolveu vrios passos para purificar a ribonuclease, uma protena que possui massa molecular aproximadamente de 13 000 Da. Quando analisou uma fraco precipitada com sulfato de amnio por electroforese em gis de poliacrilamida contendo SDS, observou a presena de dois polipptidos contaminantes. O polipptido A com massa molecular de 14 000 e o polipptido B com massa molecular 75 000. A anlise dos polipptidos por focagem isoelctrica revelou que o polipptido A possui um ponto isoelctrico 4 unidades mais acdico do que o da ribonuclease, enquanto que o polipptido B possui um pI idntico ao da protena que se pretende purificar. Que tcnicas sugeriria ao seu colega para a separao eficiente da ribonuclease das protenas contaminantes? Fundamente a sua resposta com base nos princpios das tcnicas que escolheu.
Questes
2. Um estudante pretende repetir a experincia de um colega em que se tinha separado a urease (pI = 5,0) da mioglobina (pI = 7,0) por cromatografia de troca inica, cujo cromatograma se encontra na figura.
No entanto, as condies de pH do tampo no se encontram especificadas e o aluno encontra-se indeciso quanto ao pH a utilizar. Que tampo utilizaria, a pH 3, pH 6 ou pH 9? Explique porqu.
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Questes
3. A massa molecular duma protena desconhecida foi analisada por cromatografia de excluso numa coluna de Sephacryl S-300. Como padres utilizaram-se as seguintes protenas: albumina de soro bovino (66 000), aldolase (158 000), catalase (210 000), ferritina (440 000) e tiroglobulina (670 000). Os volumes de eluio (em ml) obtidos foram: 13,6 16,2 18,4 20,0 22,5 a) Faa a correspondncia entre os volumes de eluio e os padres que lhes correspondem. b) O volume de eluio da protena Desconhecida de 19,0 ml. Calcule a massa molecular relativa desta protena
Questes
Aps purificao parcial de uma protena, encontraram-se na amostra analisada por electroforese bidimensional quatro spots com as seguintes caractersticas
Polipeptido A B C D Massa molecular 15 kDa 15 kDa 53 kDa 22 kDa pI 4 8 6,6 6,6
Faa um esquema com o arranjo relativo que estaria espera de encontrar no gel bidimensional.
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Questes
5. Um grupo de investigao em fisiologia vegetal descobriu uma nova protena que expressa nos cotildones do termoceiro. Isolaram a protena e produziram anticorpos policlonais especficos contra essa protena em coelho. Um dos problemas cientficos que um novo estagirio tem para resolver descobrir se esta protena tambm expressa nos cotildones de outras espcies vegetais. Qual o mtodo que melhor se adequaria a fazer tal estudo?
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