Manejo de pragas utilizando soja-Bt , manejo de resistncia e novos cenrios

Daniel R. Sosa-Gmez 11:00-12:00

29-11-2012

Spodoptera cosmioides

Spodoptera eridania

Heliothis virescens
Soja: cry IA controla A. gemmatalis, P. includens e H. zea

(Miklos et al. 2007)

Helicoverpa zea?
John L. Capinera, University of Florida

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Helicoverpa_gelotopoeon.jpg

Helicoverpa gelotopoeon e H. zea

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/ba/Helicoverpa_gelotopoeon.jpg http://www.inra.fr/papillon/noctuid/autres/texteng/h_zea.htm

Questionamentos
1) Quais espcies so sensveis a toxina Cry1Ac? 2) Quais espcies no so sensveis a toxina Cry1Ac? 3) A toxina expressa em toda a planta? 4) Qual a dinmica de expresso da toxina atravs do ciclo da cultura? (sincronia com as pragas) Os nveis de expresso so elevados durante a ocorrncia da fase suscetvel do inseto no campo? 5) A expresso da toxina varia de regio para regio? 6) Existe possibilidade de seleo de gentipos resistentes? 7) Todas as espcies tem capacidade para tornar-se resistentes? 8) Em quanto tempo podem tornar-se resistentes? 9) A resistncia pode ser generalizada ou localizada?

Resistncia
Capacidade, de uma raa de inseto, de tolerar doses de txicos que so letais para a maior parte dos indivduos de uma populao normal da mesma espcie
Conceito relativo, envolve comparaes intraespecificas, ao menos, entre duas populaes
Who Expert Committeee on Insecticides (1957)

Fatores que modificam as frequncias dos alelos resistentes

A. Fatores Operacionais
Semelhana com inseticidas utilizados anteriormente Persistncia do inseticida no ambiente (formulao) Limiar de aplicao Estgio no momento da aplicao Mtodos de aplicao

Aplicaes limitadas no espao

Alternncia das aplicaes

Adaptado de Georghiou & Taylor (1986)

Fatores que modificam as frequncias dos alelos resistentes

B. Fatores biolgicos e ecolgicos Nmero de geraes por ano Descendncia por gerao Monogamia, poligamia o partenognese Isolamento, mobilidade e migrao Monofagia, polifagia Sobrevivncia fortuita, presena de refgios

Adaptado de Georghiou & Taylor (1986)

Fatores que modificam as frequncias de alelos resistentes

C. Fatores Genticos
Frequncia (inicial) de alelos resistentes;
Nmero de alelos resistentes; Dominncia dos alelos resistentes; Expressividade e interaes dos alelos resistentes; Histrico da exposio a outros inseticidas;

Integrao do genoma resistente com outros

fatores de adaptao ao meio ambiente (fitness).

Adaptado de Georghiou & Taylor (1986)

Resistncia
Pragas da cultura da soja
27 milhes de ha (CONAB) Variabilidade gentica (espcies de Noctuidae)

Migrao
Resistncia a HD1 (A. gemmatalis 5 geraes em isolamento reprodutivo) Nmero de aplicaes (lagartas: 2 a 3 aplicaes, percevejos= 1,5 a 2) Recessividade/ dominncia dos alelos de resistncia Frequncia dos alelos de resistncia

Variabilidade gentica
Todas as populaes so iguais? Em que medida elas so diferentes? Quais fatores ambientais esto associados a essa variabilidade? Existe transferncia de genes entre populaes? A variabilidade gentica implica variabilidade de resposta a toxinas e inseticidas?

Marianna, Quincy, FL

Variabilidade gentica

Fluxo gnico
Planaltina, DF Londrina, PR Passo Fundo, RS

La Virginia, Tucuman

Argentina
Braslia Florida

Braslia

Passo Fundo

Londrina
A. argillacea
Fotos: MacheleWhite Sosa-Gomez et al. (2004)

A similaridade gentica encontrada entre populaes distantes geograficamente e os valores de Nm (2.0566 > Nm< 15.2618) indicam que ocorre migrao.
Sosa-Gmez (2004)

Ubirat

Londrina

Centenrio do Sul Cndido Mota

O ndice de fluxo gnico (Nm global= 0.8307) menor que o Ponta Por observado em Anticarsia gemmatalis e Helicoverpa armigera indicando que os Sapezal percevejos migram muito menos que as mariposas.
Sosa-Gomez et al. (2004)

Fragmentos mtDNA:
COI- Citocromo oxidase I; COII- Citocromo oxidase II; CytB- Citocromo B.

Anlises:
AMOVA- Arlequin; Frequncia hapltipos- TCS.

CONCLUSES

A subpopulao da Bahia uma maior concentrao de indivduos em um mesmo hapltipo; H maior variabilidade gentica dentro das subpopulaes do que entre as subpopulaes.

LC50 = 77.2 g of a.i. per mL of diet

LC50 = 6,642.1 g of a.i. per mL of diet = 86 x

Sosa-Gmez & Miranda (2012)

Sosa-Gmez & Miranda (2012)

Chrysodeixis includens (Walker [1858])

CONCLUSES

No existe estruturao nas subpopulaes

estudadas de C. includens;

A ausncia de agrupamento na anlise da rede

de hapltipos das sequncias de mtDNA

evidenciou a reduzida diferenciao entre as subpopulaes.

Population Structure in Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae): An Estimate of Gene Flow

Heliothis virescens e Helicoverpa zea

H. virescens

H. zea

Starting with the third instar, close examination reveals tubercles with small thorn-like microspines on the first, second, and eighth abdominal segments that are about half the height of the tubercles. In corn earworm the microspines on the tubercles are absent or up to one-fourth the height of the tubercle (Neunzig, 1964)

Variabilidade Gentica de Heliothinae

Anlise com base em isoenzimas; Pouca diferenciao gentica entre populaes; H. virescens mais restrito a rea cultivadas que H. zea; Nm = 135;

Korman et al. (1993)

Variabilidade Gentica de Heliothis virescens - Brasil

Anlise com base em microssatlites; Existe estruturao gentica moderada entre populaes; A estruturao gentica de H. virescens no foi relacionada com regio geogrfica, safra ou hospedeiro; Nem = 1,64 a 0,74;
Domingues (2011)

Todas as populaes de uma mesma espcie se comportam igual? Existe variabilidade de resposta a inseticidas (toxinas)?
GPS Numero de geraes em laboratrio - dieta

Bioensaios
Dose a quantidade de substncia que provoca uma resposta por unidade de peso do organismo em ensaio (ng/mg)

Concentrao a quantidade de substncia que provoca uma resposta por unidade de diluente (20 mg/ml ou 20 ppm em insetos aquticos) ou por inseto (2 mg/insect) ou por unidade de rea (2 mg/cm2)

Bioensaios - Requisitos
Tcnicas de criao; Desenho experimental apropriado; Conhecimentos de estatstica aplicada a bioensaios; Conhecimento da variabilidade intraespecfica da populao; Nmero mnimo de indivduos Conhecimentos sobre a biologia e fisiologia do inseto

 Protena sinttica de Cry1Ac11,14%- MVP II

(Pseudomonas com Cry1Ac encapsulada Dow

Agrosciences, San Diego, EUA).

1 ml de dieta em cada clula- bandeja de bioensaio; Aps geleificao dieta, uma lagarta neonata foi

inoculada em cada clula;

Placas vedadas com lmina plstica auto-adesivas.

(BIO-CV-16, CD Interantional Inc., Pitman, NJ);

C. includens apresenta maior tolerncia a inseticidas qumicos e biolgicos que A. gemmatalis; Quando inoculada como Bacillus thuringiensis sua tolerncia entre 1,5 e 5,6 vezes maior que A. gemmatalis

Espcies do sistema produtivo da soja Bt

Algodo cry1Ac

P. gossypiella
C. includens S. cosmioides S. frugiperda S. eridania H. virescens H. zea

Milho Cry 1Ab

Soja Cry1Ac

Elasmo

Ensaios de campo e em CV: USA & Argentina

Soja Bt e testemunhas negativas (segregantes iso gnicas e linhas parentais) foram avaliados contra Anticarsia gemmatalis e Pseudoplusia includens nos Estados Unidos e contra A. gemmatalis, Epinotia aporema, Rachiplusia nu (1,9% desfolha), e Spilosoma virginica (8,5% desfolha) na Argentina. A soja Bt apresentou eficincia total contras as populaes de todas essas pragas
MacRae et al (2005)

Spilosoma virginica (Fabricius, 1798)

http://cobbextension.blogspot.com.br/2012/10/fuzzy-orange-catarpiller.html

Tolerncia de noctudeos associados com a cultura da soja a toxina Cry1ac. Bioensaios realizados com protena purificada e formulada
Espcie LC50 (g de Nmero de protena ativa.ml- populaes 1 dieta) 8 0,04 a 0,21 Fonte

A. gemmatalis H. virescens R. nu P. includens S. frugiperda

Cavaguchi, 2012 Albernaz, 2011 Cavaguchi et al., 2012 Cavaguchi, 2012, Benardi et al., 2011 Bernardi 2012 Bernardi 2012 Bernardi 2012

0,18 a 0,66 0,70 0,77 a 3,72 Aprox. 100

5 1 13

1 1 1

S. eridania
S. cosmioides

>100
> 100

Sosa-Gmez & Omoto (2012)

 A protena tic107 (cry 1A) podem ser expressas em nveis elevados: 6,12 g mg1 de protena total extravel. Nveis de expresso dessa magnitude no foram relatados antes em soja. Relatos prvios indicam nveis de expresso 100 vezes menores. Isolinha: Asgrow var. A3237
Fonte: Miklos et al. 2007

Nveis de expresso de toxinas Bt na soja

Tissue expression (fresh tissue weight) of Cry protein

Crop
Cry1Ab corn Bt11 Cry1Ab corn MON810
Cry1F corn TC1507 Cry3A potato Cry1Ac cotton Cry1A soybean Cry1A soybean
a

Leaf (ng/mg)
3.3 10.3
56.6-148.9 28.3 2.0 50-200 1910-3800 a

Whole plant (ng/mg)

NA 4.6
830-1573a 3.3 NA NA NA Miklos et al. 2007

ng/mg total protein

Mendelsohn et al. 2003. Nature Biotechnology 21 (9): 1003-1009

Expression of TIC107 in Bt soybean lines

microg / g fresh weight

Plant growth stage MacRae et al (2005)

Microgram per mg of extractible protein

Mean Values of Bt protein detected in soybean leaf tissue measured by ELISA

Days after planting

Miklos et al. (2007) Crop Sci.

Cry1Ac protein levels in MON87701 tissues (g. g-1 de peso fresco)

Preocupaes
Grandes reas com soja-Cry1Ac e outras culturas com o mesmo gene (algodo) Soja sobre soja (soja de safrinha) Soja , algodo e milho (Cry1F) Todas as espcies de lagartas respondem da mesma maneira a toxina Cry1Ac? Existe tolerncia diferencial a toxina? Quais so esses nveis de tolerncia?

Possveis problemas
Disponibilidade de Cry1Ac em reas continuas (presso de seleo) Desobedincia as normas de refgio

Resistncia de P. includens e H. virescens a toxinas Cry 1A

Premissas para a utilizao de refgios

Frequncia inicial de alelos resistentes baixa A resistncia deve ser um carter recessivo; Dose suficiente para causar alta mortalidade dos indivduos suscetveis e heterozigotos; A produo de indivduos suscetveis nas reas de refgio localizadas a uma distancia tal, que permita acasalamentos ao acaso.

Gene Pyramiding
1) Insect resistant to one toxin can be effectively controlled by a second toxin produced in the same plant; 2) Strains resistant to two toxins with independent mode of action cannot emerge through selection pressure with one toxin alone; 3) Assumption underlying the strategy of Bt gene pyramiding is that a single gene will not confer resistance to two toxins that are immunologically distinct and that have different binding targets

(Gahan et al, 2005)

Similar sequences tend to have similar target spectra. However, single Cry toxins, such as Cry1Ba, can affect a broad class of organisms, and very distantly related toxins, such as Cry1Aa and Cry2Aa, can have similar activity spectra. Structural studies have shown that Cry toxins that appear highly divergent by sequence analysis (e.g. Cry1Aa, Cry3Aa, Cry2Aa, 20% amino acid identity in pairwise analyses) have remarkably similar three-domain structure.
Griffitts & Aroian (2005)

Limitations of the Bt gene pyramiding strategy

It is difficult to define levels (low, medium or high) of heterozygous resistant individuals; Development of multiple and cross resistance to synthetic insecticides came about partly as a result of the widespread use of insecticide mixtures where insect were exposed to multiple toxic at different or at the same time; One toxin can bind to several action sites (assumption that strains resistant to two toxins with independent mode of action cannot evolve through selection) Manyangarirwa et al. (2006)

Resistncia cruzada
Um nico mecanismo confere resistncia

a dois ou mais compostos qumicos

(qumicos geralmente relacionados)

i.e. cipermetrina e deltametrina

Resistncia mltipla
Quando pelo menos dois mecanismos de resistncia diferentes coexistem e conferem resistncia a dois ou mais compostos qumicos (qumicos geralmente no relacionados) i.e. Cipermetrina & Profenofs em Bemisia tabaci biotipo B (raa NED 3)

Cahill, M.; Byrne, F.J.; Denholm, I; Devonshire, A.L. & Gorman, K.J. 1995?

Griffitts & Aroian (2005)

Agradecimentos