Linfonodos de Cães

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CINCIAS AGRRIAS E VETERINRIAS CMPUS DE JABOTICABAL
APOPTOSE EM LINFONODOS DE CES COM LEISHMANIOSE VISCERAL.
Pamela Rodrigues Reina Moreira

Mdica Veterinria
JABOTICABAL SO PAULO - BRASIL 2010
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CINCIAS AGRRIAS E VETERINRIAS CMPUS DE JABOTICABAL
Pamela Rodrigues Reina Moreira
Orientadora: Profa. Ass. Dra. Rosemeri de Oliveira Vasconcelos
Dissertao apresentada Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias UNESP, Cmpus de Jaboticabal, com o parte das exigncias para a obteno do ttulo de Mestre em Medicina Veterinria (Patologia Animal).
JABOTICABAL SP Fevereiro - 2010
M838a
Moreira, Pamela Rodrigues Reina Apoptose em linfonodos de ces com leishmaniose visceral / Pamela Rodrigues Reina Moreira. Jaboticabal, 2010 xiv, 54 f. : il. ; 28 cm Dissertao (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias, 2010 Orientadora: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos Banca examinadora: Antnio Carlos Alessi, Valria Maral Flix de Lima Bibliografia 1. Apoptose. 2. Leishmania (Leishamnia) chagasi. 3. Linfadenopatia. I. Ttulo. II. Jaboticabal-Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias. CDU 619:616.993.161:663.7
Ficha catalogrfica elaborada pela Seo Tcnica de Aquisio e Tratamento da Informao Servio Tcnico de Biblioteca e Documentao - UNESP, Cmpus de Jaboticabal.
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DADOS CURRICULARES DO AUTOR
PAMELA RODRIGUES REINA MOREIRA nascida em 31 de outubro de 1982, na cidade de Ribeiro Preto, So Paulo. Mdica Veterinria formada em dezembro de 2004, no Centro Universitrio Baro de Mau, em Ribeiro Preto. Durante o curso de graduao, foi bolsista da Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP), na modalidade de Iniciao Cientfica, no perodo de agosto de 2002 a julho de 2003, sob a orientao do Prof. Dr. Wilson Machado de Souza, na rea de anatomia de animais domsticos. Posteriormente usufruiu de uma bolsa de iniciao cientfica do Centro Universitrio Baro de Mau, no perodo de fevereiro a dezembro de 2004, sob a orientao do Prof. Dr. Paulo Srgio Patto dos Santos, na rea de cirurgia de grandes animais. Em fevereiro de 2005 a janeiro de 2007, cursou Residncia Mdica na rea de Patologia Animal, na Faculdade de Marlia (UNIMAR), sob orientao do Prof. Dr. Alessandre Hataka. Em janeiro de 2008, ingressou no Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria (Mestrado, rea de concentrao em Patologia Animal), na FCAV UNESP, Cmpus de Jaboticabal, sob a orientao da Profa. Dra. Rosemeri de Oliveira Vasconcelos.
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VIDA
J perdoei erros quase imperdoveis, tentei substituir pessoas insubstituveis e esquecer pessoas inesquecveis.
J fiz coisas por impulso. J me decepcionei com pessoas quando nunca pensei me decepcionar, mas tambm j decepcionei algum.
J abracei pra proteger e j dei risada quando no podia. J fiz amigos eternos. J amei e fui amado, mas tambm j fui rejeitado.
J fui amado e no soube amar. J gritei e pulei de tanta felicidade, j vivi de amor e fiz juras eternas.
J chorei ouvindo msica e vendo fotos, j liguei s pra escutar uma voz, j me apaixonei por um sorriso.
J pensei que fosse morrer de tanta saudade e... ...tive medo de perder algum especial (e acabei perdendo)! Mas sobrevivi!
Bom mesmo ir a luta com determinao, abraar a vida e viver com paixo, porque o mundo pertence a quem se atreve e A VIDA MUITO para ser insignificante" Charles Chaplin
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Dedico este trabalho aos meus pais Accio e Tnia, pelos grandiosos ensinamentos.
A minha av Janice e minha irm Paloma, pelo amor, carinho e por estarem sempre ao meu lado.
E em especial a minha filha Gabriella e meu sobrinho Patricky, pelo amor e compreenso nos momentos em que no pude estar junto eles.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Professora Rosemeri de Oliveira Vasconcelos,
Minha querida orientadora, inicialmente por me aceitar como orientada e, alm disso, por acompanhar cada etapa deste trabalho, pela dedicao, incentivo, valiosos ensinamentos e, principalmente, pelas demonstraes de carinho e amizade em todos os momentos. Aprendi muito com o seu exemplo de ser e agir. Sinceramente, a voc, minha eterna gratido e admirao.
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AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar Deus e Nossa Senhora por estarem sempre me protegendo e me guiando em todos os momentos da minha vida e dando-me fora. E sei tambm que ser essa mesma fora que me far seguir sempre em frente. minha orientadora, novamente e outras tantas vezes e que, tenho certeza, no sero suficientes para agradec-la por tudo, principalmente pelo carinho e dedicao, possibilitando a realizao de um grande sonho. Ao Prof. Dr. Antnio Carlos Alessi, pela amizade, incentivo, confiana, auxlio prestado e pelas sugestes na qualificao. Obrigado tambm por mais uma vez estar compartilhando de sua experincia na minha defesa da dissertao final e pela valiosa contribuio no desenvolvimento das imunoistoqumicas. Minha eterna admirao e gratido. Ao Prof. Dr. Dansio Prado Munari, que desempenhou papel especial neste trabalho, com sua ajuda na anlise estatstica, e claro com todo seu carter, amizade e companheirismo. Profa. Dra. Rosngela Zacarias Machado, pelas sugestes na qualificao, que muito contriburam para melhorar a apresentao final deste trabalho. Ao Prof. Dr. Alessandre Hataka pela confiana, pacincia e ensinamentos transmitidos na minha residncia. Obrigado por compartilhar dos meus ideais, incentivando-me a prosseguir nesta jornada. Obrigado tambm por ter dado de forma to desprendida o fruto de seus longos anos de estudo, pesquisa e prtica durante
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minha residncia. Obrigado, pois foi atravs de voc que aprendi a gostar de Patologia, aprendi bastante com voc e sei ainda que tenho muito o que aprender. Manifesto minha admirao, respeito e meu eterno agradecimento. Profa. Dra. Valria Maral Flix de Lima, agradeo pelas sugestes na dissertao, que muito contribuir para melhorar a publicao deste trabalho. Francisca de Assis Ardisson e Maria Ins Yamazaki, Campos do laboratrio de Histopatologia do Departamento de Patologia Veterinria, pelo processamento do material, possibilitando que eu realizasse meu experimento. Ao Centro de Controle de Zoonoses de Araatuba (SP) por cederem os animais deste estudo. bibliotecria Nbia Josefina Lopes Brichi (FCAV/UNESP), pela correo das referncias desta dissertao. Ao CNPq (Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento) pela concesso da bolsa. Aos amigos Mrcio de Barros Bandarra, Mariana Macedo Costa de Andrade e Felipe Adriano Sangali, pela companhia, foram momentos de muito aprendizado e alegria. Aos meus pais Accio e Tnia pela dedicao e amor sempre presentes. A vocs por tudo o que sou hoje. Obrigado por acreditarem em mim. Vocs me concederam a vida, me deram educao, conselhos e ensinamentos fundamentais para a formao do meu carter e dignidade. Tomara Deus que eu possa transmiti-la no exerccio de minha profisso e tambm ensinar minha filha, com a mesma dignidade
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com a qual vocs a fizeram chegar a mim e obrigado por ajudarem a cuidar da Gabi para que eu pudesse concluir esse meu grande sonho. minha irm Paloma pelo amor, amizade e ajuda tambm em todos os momentos que precisei com a Gabizinha, ajudando a olh-la para que eu pudesse estudar. A voc pela confiana depositada em mim, pelo apoio e torcida por mais essa vitria. Obrigado por tudo minha irm e querida companheira de profisso. minha filha Gabriella e meu sobrinho Patricky, que fizeram meu mundo muito melhor. Pelos momentos de alegria que s vocs souberam muito bem me proporcionar, pelo amor e compreenso nos momentos em que no pude estar junto a vocs. minha av Janice, pelo amor, carinho, incentivo e por sempre estar rezando por mim.
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SUMRIO
Pgina LISTA DE FIGURAS................................................................................... RESUMO..................................................................................................... SUMMARY I. INTRODUO......................................................................................... II. REVISO DE LITERATURA................................................................... 2.1 Aspectos Gerais da Leishmaniose Visceral.................................... 2.2 Resposta imune do co................................................................. 2.3 Apoptose............................................................................................ III. OBJETIVOS........................................................................................... IV. MATERIAL E MTODOS.................................................................. 4.1 Material.......................................................................................... 4.2 Anlise Histopatolgica..................................................................... 4.3 Anlise Imunoistoqumica.............................................................. 4.4 Anlise Estatstica......................................................................... V. RESULTADOS................................................................................... 5.1 Anlise Anatomopatolgica........................................................... 5.2 Anlise Microscpica..................................................................... VI. DISCUSSO.......................................................................................... VII. CONCLUSES..................................................................................... VIII. REFERNCIAS............................................................................... IX. ANEXOS........................................................................................... 9.1 Protocolo de Imunoistoqumica para determinao da carga parasitria de Leishmania (L.) chagasi em linfonodos de ces naturalmente infectados......................................................................... 9.2 Protocolo de Imunoistoqumica para determinao da densidade de clulas apoptticas em linfonodos de ces naturalmente infectados por Leishmania (L.) chagasi................................................................... 53 x Xiii Xiv 01 03 03 07 09 13 14 14 15 15 16 18 18 18 32 40 41 51 51
LISTA DE FIGURAS
Pgina FIGURA 1 Fotomicrografia de linfonodos de ces com Leishmaniose Visceral. (A) Regio capsular do linfonodo poplteo com infiltrado inflamatrio crnico acentuado (*), no detalhe notar a predominncia de plasmcitos (setas / co oligossintomtico, Obj. 20x). (B) Regio cortical do linfonodo com vrias clulas apoptticas (setas). Notar no detalhe o ncleo picntico e o citoplasma acidfilo (linfonodo ilaco, co assintomtico). Hematoxilina e Eosina. Obj. 40x............................. FIGURA 2 Fotomicrografia de linfonodos de ces com Leishmaniose Visceral. (A) Regio de transio cortico-medular do linfonodo poplteo com severa e difusa reao granulomatosa (*, Obj.20x). (B) Regio medular do linfonodo subescapular com presena de granulomas (*) nos cordes (Obj.40x). Hematoxilina e Eosina / Co sintomtico.............................................................................................. FIGURA 3. Fotomicrografias de linfonodos de ces com Leishmaniose Visceral. (A) Regio medular com severa plasmocitose nos cordes (* / linfonodo mesentrico / co oligossintomtico). (B) Regio capsular do linfonodo poplteo com presena de fibroblastos parasitados (setas). No detalhe observa-se a imunomarcao de Leishmania sp. no fibroblasto (co sintomtico / Complexo Estreptavidina Biotina Peroxidase). Hematoxilina e Eosina / Obj.40x....................................... FIGURA 4 Fotomicrografias de linfonodos de ces com Leishmaniose Visceral. (A) Regio paracortical (setas) e na medular (cabea de seta), com clulas apoptticas imunomarcadas (linfonodo ilaco, grupo sintomtico, Obj.20x). (B) Regio medular com presena de clulas apoptticas nos cordes (setas). Notar detalhe dos corpos apoptticos (seta, linfonodo subescapular, co oligossintomtico, 24 23 22 21
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Obj.40x). Complexo Estreptavidina Biotina Peroxidase......................... FIGURA 5 Fotomicrografias de linfonodos de ces com Leishmaniose Visceral. (A) Regio medular com inmeros macrfagos 25
imunomarcados para Leishmania sp. (setas). (B) Regio cortical com presena de macrfagos parasitados no centro do folculo linfide (*). Linfonodo poplteo, co sintomtico, Complexo Estreptavidina Biotina Peroxidase, Obj.40x............................................................................... FIGURA 6. Mdias e respectivos desvios-padro para a caracterstica carga parasitria por grupo de ces infectados (S = sintomtico; O = oligossintomtico e A = assintomtico), nos linfonodos poplteo (a) e subescapular (b). Mdias seguidas de letras distintas diferem significativamente pelo Teste de Tukey (P<0,05)................................... FIGURA 7. Mdias e respectivos desvios-padro para a caracterstica clulas apoptticas por grupo nos linfonodos poplteo (a) e subescapular (b) de ces infectados para LVC (S = sintomtico; O = oligossintomtico; A = assintomtico; C = controle). Mdias seguidas de letras distintas diferem significativamente pelo Teste de Tukey (P<0,05).................................................................................................. FIGURA 8. Mdias e respectivos desvios-padro para a caracterstica clulas apoptticas por grupo nos linfonodos mesentricos (a) e ilacos (b) de ces infectados para LVC (S = sintomtico; O = oligossintomtico; A = assintomtico e C = controle). Mdias seguidas de letras distintas diferem significativamente pelo Teste de Tukey (P<0,05).................................................................................................. FIGURA 9. Proporo de escore celular no linfonodo poplteo dos grupos de ces infectados para LVC (A = assintomtico, O = oligossintomtico e S= sintomtico), observados no infiltrado celular (linfcito, plasmcito e macrfago). FIGURA 10. Proporo de escore celular de macrfagos (1 = discreto; 2 = moderado; 3 = acentuado) no linfonodo subescapular 30 29 28 27 26
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dos grupos de ces infectados para LVC (A = assintomtico, O = oligossintomtico e S= sintomtico). Mdias seguidas de letras distintas diferem significativamente pelo Teste de Kruskal-Wallis (P<0,05)..................................................................................................
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RESUMO - A linfadenomegalia generalizada um aspecto da Leishmaniose Visceral Canina (LVC), mas existem poucos estudos enfocando alteraes no linfonodo. O objetivo deste estudo foi analisar os linfonodos de ces com LVC, considerando a densidade de clulas apoptticas. Utilizou-se 32 ces naturalmente infectados, de rea endmica para LVC, classificados nos grupos sintomtico (S), assintomtico (A) e oligossintomtico (O). Os linfonodos foram colhidos para anlise histopatolgica. A avaliao da carga parasitria e porcentagem de apoptose foi feita pelo mtodo de imunoistoqumica. Na avaliao histopatolgica, no infiltrado dos linfonodos dos grupos O e S predominaram macrfagos e plasmcitos, envolvendo todas as regies do linfonodo e causando distoro deste rgo pela presena de granulomas atpicos associados atrofia linfide nos casos crnicos. A carga parasitria e a densidade de clulas apoptticas foram maiores nos ces sintomticos, podendo estar associado causa de atrofia linfide, deixando-os mais susceptveis a LVC. Os linfonodos subescapular e poplteo foram os que apresentaram maior reatividade, porm a atrofia linfide foi mais evidente neste ltimo. Conclui-se que independente do quadro clnico, a resposta predominante foi granulomatosa e de plasmcitos. A associao entre a apoptose e a carga parasitria no foi significativa (P<0,05), mas parece ter importncia biolgica, j que ces (grupo S) com a maior carga parasitria, tambm tiveram o maior nmero de clulas apoptticas, sugerindo um mecanismo de evaso imune do parasito, favorecendo sua sobrevivncia e multiplicao no hospedeiro.
Palavras-Chave: Apoptose, ces, Leishmania (Leishmania) chagasi, Leishmaniose Visceral, linfadenopatia
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APOPTOSIS IN LYMPH NODES OF DOGS WITH VISCERAL LEISHMANIASIS.
SUMMARY - The generalized lymphadenopathy is an aspect of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL), but there are few studies focusing on changes in the lymph node. The aim of this study was to examine the lymph nodes of dogs with CVL, considering the density of apoptotic cells. We used 32 dogs naturally infected in an endemic area for CVL, classified in groups symptomatic (S), asymptomatic (A) and oligosymptomatic (O). The lymph nodes were collected for histopathological analysis. The evaluation of parasite load and percentage of apoptosis was performed by immunohistochemistry. Histopathology, macrophages and plasma cells predominated in the infiltrate of the lymph nodes of groups O and S, involving all regions of the lymph node and forming granulomas associated with lymphoid atrophy in chronic cases. The parasite load and the density of apoptotic cells were higher in symptomatic dogs, which may be linked to causing lymphoid atrophy, leaving the dog more susceptible to LVC. The subscapular and popliteal lymph nodes were those with higher reactivity, but the lymphoid atrophy was most evident in the popliteal lymph node. It follows that regardless of the clinical picture, the predominant response was granulomatous and plasma cells. The association between apoptosis and the parasite load was not significant (P <0.05), but seems to have biological importance, since it was observed that dogs (group S) with the highest parasite load, also had the highest number of apoptotic cells, suggesting a mechanism for immune evasion of the parasite, promoting their survival and multiplication in the host.
Keywords: apoptosis, dogs, Leishmania (Leishmania) chagasi, visceral leishmaniasis, linphadenopathy
I. INTRODUO
A Leishmaniose Visceral (LV) uma zoonose de distribuio mundial, causada por protozorios do gnero Leishmania. A forma visceral desta enfermidade tambm denominada Calazar ou Febre Dum-Dum, tendo como integrantes do seu ciclo evolutivo, mamferos domsticos e silvestres (incluindo o homem) e insetos vetores do protozorio. No continente americano o agente etiolgico envolvido Leishmania (Leishmania) chagasi, que considerada idntica a Leishmania (Leishmania) infantum descrita em alguns pases da Europa, sia e do Mediterrneo. Esse protozorio da famlia Trypanosomatidae, sendo considerado um parasito intracelular obrigatrio de clulas do sistema fagocitrio mononuclear dos hospedeiros vertebrados. O principal vetor da Leishmania o flebotomnio hematfago Lutzomyia longipalpis. Embora esta doena tenha sido descrita como de ocorrncia rural ou de reas prximas a matas, atualmente sabe-se que ela ocorre predominantemente em zonas suburbanas e urbanas, com notificao de casos humanos e caninos em 19 estados brasileiros. Os fatores que favorecem esta mudana epidemiolgica so a reduo das reas de mata nativa, a migrao de pessoas da zona rural para reas urbanas, o saneamento bsico deficiente e as pobres condies socioeconmicas da populao da periferia das cidades. Aliado a isso, ocorre a migrao do inseto vetor e de reservatrios silvestres do protozorio, para reas de convvio com o homem e animais domsticos. A leishmaniose visceral canina (LVC) causa um quadro sistmico crnico, com manifestaes clnicas inespecficas, similares as do homem. A doena mais prevalente na populao canina que na humana, pois geralmente casos humanos so precedidos por casos caninos. Os ces tambm apresentam uma maior quantidade de parasitos na pele, quando comparados ao homem, o que favorece a infeco dos insetos vetores. Uma das estratgias para o controle da LVC no Brasil, indicada pelo Ministrio da Sade, consiste na eutansia dos ces soropositivos para o protozorio, com ou sem sinais clnicos, por serem considerados a principal fonte de infeco para o homem. J est comprovado que existe uma maior densidade de parasitos nos ces
com doena avanada, embora muitas pesquisas mostrem que parece no haver esta associao com o estadiamento clnico do animal. A L. (L.) chagasi tem a capacidade de sobreviver aos mecanismos de defesa do seu hospedeiro vertebrado canino. Sua principal estratgia modular a resposta imune, causando um desequilbrio entre as respostas Th1 e Th2, induzindo em ces susceptveis e com maior carga parasitria, uma predominncia de resposta imune humoral, com perfil de citocinas Th2, ineficientes no controle da multiplicao do protozorio dentro do macrfago. A apoptose um mecanismo que pode ser acionado por diversos estmulos, desencadeando a liberao de uma cascata enzimtica dentro da clula, levando-a a morte. Por isso denomina-se morte celular programada. A apoptose de macrfagos infectados por formas amastigotas de Leishmania j foi descrita em estudos com vacinas e infeces experimentais. Existem vrios estudos que enfocam a apoptose em infeces por parasitos, com destaque para as diferentes vias que ativam a cascata de enzimas que levam a clula morte por apoptose. Nestes casos estes parasitos podem modular este mecanismo para proteger a clula parasitada ou lesar clulas no parasitadas, como as do sistema imune, garantindo desta forma a sua sobrevivncia dentro do hospedeiro. Avaliar a presena de apoptose em linfonodos perifricos e cavitrios de ces infectados por L. (L.) chagasi e determinar quais regies do linfonodo e quais os tipos celulares apresentam este processo patolgico, so aspectos importantes na avaliao de um possvel mecanismo de evaso imune do agente etiolgico da Leishmaniose Visceral Canina.
II. REVISO DE LITERATURA
2.1 Aspectos Gerais da Leishmaniose Visceral
A Leishmaniose Visceral (LV) uma das mais importantes zoonoses emergentes de origem parasitria, sendo considerada a segunda maior enfermidade no mundo causada por protozorios, perdendo apenas para a Malria. Esta doena tem distribuio mundial, sendo causada por protozorios do gnero Leishmania. No Novo Mundo causada pelo protozorio Leishmania (Leishmania) chagasi, enquanto que Leishmania (Leishmania) infantum descrita em alguns pases da sia e do Mediterrneo (WHO, 2008). Esse parasito pertence ordem Kinetoplastida, subordem Trypanosomatina e famlia Trypanosomatidae. um parasito intracelular obrigatrio de clulas do sistema fagocitrio mononuclear do hospedeiro vertebrado (REY, 2001). Existem divergncias sobre o uso de L. chagasi para a designao da espcie do agente etiolgico de LV. Alguns autores consideram que Leishmania (Leishmania) chagasi idntica a Leishmania (Leishmania) infantum e, por isso, o nome chagasi seria sinnimo de infantum. Porm, outros autores chamam ateno para as diferenas bioqumicas que existem entre elas e, usam preferencialmente L. (L.) chagasi (MAURCIO et al., 1999; BRASIL, 2006; SOARES, 2007). O primeiro caso da doena em seres humanos foi descrito na Grcia, em 1835. Em 1903, na ndia Leishman reconheceu a semelhana do parasito com as formas arredondadas observadas nas infeces por Trypanosoma sp. Neste mesmo ano, Donovan descreveu estes mesmos parasitos na enfermidade denominada Febre DumDum ou Calazar (PESSA e MARTINS, 1988; REY, 2001). O primeiro relato da doena no Brasil datado de 1913, em homem proveniente do municpio de Boa Esperana, no Mato Grosso o Sul (CASTRO, 1996). No Brasil, a transmisso de L. (L.) chagasi, se d pela picada do vetor Lutzomyia longipalpis. Recentemente, Lutzomyia cruzi foi tambm incriminado como vetor da
doena no Estado do Mato Grosso do Sul. Estes flebotomnios so conhecidos popularmente como mosquitos-palha, asa dura, cangalha, birigui ou tatuquira e pertencem famlia Psychodidae. Eles medem cerca de 1,0 a 4,0mm de comprimento, possuem o corpo e asas pilosos e tem uma colorao castanho-claro. Possuem um comportamento caracterstico de voar em pequenos saltos e pousar com as asas entreabertas, alm de apresentarem atividade crepuscular. As formas imaturas
desenvolvem-se em ambientes terrestres midos, ricos em matria orgnica e com baixa incidncia luminosa (SANTA ROSA e OLIVEIRA, 1997; CAMARGO-NEVES et al., 2001; CASTRO, 1996; MONTEIRO et al., 2005; SOARES e TURCO, 2003). A L. (L.) chagasi pode ser encontrada nas formas promastigota e paramastigota (formas flageladas), no trato digestivo dos hospedeiros invertebrados. A forma amastigota (formas sem flagelo livre) observada no citoplasma de fagcitos dos hospedeiros vertebrados (REY, 2001). Algumas espcies de mamferos j foram identificadas como reservatrio deste parasito, tais como, raposa, co, gato, marsupiais, roedores, eqinos, gambs, tamandus, tatus, primatas e preguias (SANTA ROSA E OLIVEIRA, 1997; BRASIL, 2006; ROSSI, 2007; SANTIAGO et al., 2007). Epidemiologicamente, a LVC considerada mais importante que a doena humana, pois mais prevalente e apresenta grande nmero de ces infectados com parasitismo cutneo. Essas caractersticas tornam o co domstico o principal reservatrio do parasito (REY, 2001). J nos mamferos silvestres a Leishmania sp. causa pouco ou nenhum efeito patolgico, caracterizando-se por uma relao de equilbrio entre o parasito e o hospedeiro (FALQUETO e SESSA, 2005). A OMS (Organizao Mundial da Sade) estima que 350 milhes de pessoas estejam expostas ao risco de adquirir Leishmaniose, com registro aproximado de dois milhes de novos casos de diferentes formas clnicas. Atualmente, a doena afeta 88 pases dos quatro continentes. Aproximadamente 90% de casos da forma visceral ocorrem em Bangladesh, Brasil, ndia e Sudo e h estimativa de prevalncia de 14 milhes de casos e 59 mil bitos, nmero que, no caso de doenas parasitrias, s superado pelas mortes causadas por malria (WHO, 2008; ALVES, 2009).
Nas Amricas, a LV ocorre desde o Mxico at a Argentina, sendo que cerca de 90% dos casos humanos descritos so procedentes do Brasil (GRIMALDI et al., 1989). Ela apresenta comportamento epidemiolgico cclico, com elevao de casos em perodos mdios a cada cinco anos. Atualmente, essa endemia atinge 20 Estados brasileiros, com mdia anual de 3.095 casos no perodo de 1996 a 2005 e incidncia de 2,1 casos por 100.000 habitantes (ALVES, 2009). A leishmaniose visceral tem atingido muitos estados do territrio brasileiro, com elevada taxa de mortalidade de pessoas infectadas (SAVANI et al., 2003; NAVEDA et al., 2006). J foram identificados casos humanos em 19 dos 27 estados da Federao, com casos autctones descritos em aproximadamente 1600 municpios. A maioria destes ocorre na regio nordeste do pas (MELO, 2004). Os dados epidemiolgicos dos ltimos dez anos revelam a periurbanizao e a urbanizao da leishmaniose visceral, com destaque para os surtos ocorridos no Rio de Janeiro, Belo Horizonte, Araatuba, Santarm, Corumb, Teresina, Natal, So Lus, Fortaleza, Camaari e mais recentemente em Trs Lagoas, Campo Grande e Palmas (BRASIL, 2006). O primeiro caso de leishmaniose visceral canina, no Estado de So Paulo, foi diagnosticado em maio de 1998, no municpio de Araatuba, na UNESP - FOA (Faculdade de Odontologia de Araatuba). Em abril de 1999 foi relatado o primeiro caso humano da doena e a presena do vetor j havia sido identificada desde 1997. Em Araatuba, cerca de 37.000 ces infectados foram submetidos eutansia, no perodo de 2002 a 2006. A partir de ento o nmero de casos caninos da doena vem aumentando consideravelmente. Segundo a Direo Regional de Sade, 41 municpios j apresentaram casos confirmados da doena, que est se difundindo para outras regies do estado, inclusive com casos autctones identificados na cidade de So Paulo, desde 2005 (BRASIL, 2006; ZORZETTO, 2008). O Ministrio da Sade registrou 53.480 casos humanos entre 1990 a 2007, com 1.750 mortes. Em registros anteriores, a leishmaniose visceral era responsvel por trs de cada cem bitos humanos, atualmente estes registros aumentaram para sete bitos de pessoas infectadas (ZORZETTO, 2008).
Especificamente, no Estado de So Paulo, de acordo com os dados do Centro de Vigilncia Epidemiolgica (ALVES, 2009), dos casos humanos registrados (autctones / bitos) tem-se a seguinte freqncia: 1999 (17/5), 2000 (15/0), 2001 (57/3), 2002 (115/13), 2003 (155/22), 2004 (134/13), 2005 (155/14), 2006 (247/10), 2007 (247/21) e 2008 (116/11). A disseminao da LV para inmeros municpios do Estado de So Paulo, sugere a adaptao do vetor em reas urbanas (CAMARGONEVES et al., 2001). O Centro de Controle de Zoonoses de Araatuba realizou a eutansia de 47.635 ces no perodo de 1999 a 2005. No ano de 2005, cerca de 16,7% dos ces
eutanasiados eram positivos para LV (979 / 5.861). No incio deste perodo houve um aumento dos casos humanos associado ao aumento do nmero de bitos de ces, possivelmente pelo aumento do nmero de vetores, pela permanncia de ces infectados em reas de risco e pela rpida reposio da populao canina na rea (ASSIS et al., 2008). Quanto ao ciclo biolgico da L. (L.) chagasi, a forma de transmisso atravs da picada dos vetores, que ingerem os macrfagos infectados com formas amastigotas de Leishmania, durante o repasto sangneo. Posteriormente passam a forma
promastigota, que multiplicam-se e diferenciam-se no intestino do inseto. Em seguida, a forma infectante (promastigota metacclica) migra para a probscide do inseto e inoculada na pele do hospedeiro vertebrado. Na epiderme do hospedeiro, as formas promastigotas so fagocitadas e no vacolo parasitforo dos macrfagos, diferenciamse em amastigotas e multiplicam-se intensamente at o rompimento destas clulas. No meio extracelular elas so fagocitadas por novos macrfagos em um processo contnuo, levando a disseminao sistmica do parasito (REY, 2001; BRASIL, 2006). A infeco por Leishmania geralmente causa uma inflamao crnica. No entanto, existe uma forma de evoluo aguda grave, que leva o animal a bito em poucas semanas. Existe ainda uma forma de evoluo latente, com durao de cerca de dois anos, acompanhada ou no de sintomas, que pode inclusive evoluir para a cura espontnea (FEITOSA et al., 2000). O perodo de incubao da LV pode levar cerca de trs a oito meses (PEARSON e SOUSA, 1996).
2.2 Resposta imune do co
Os fatores que determinam a susceptibilidade ou resistncia leishmaniose visceral so ainda pouco definidos, mas a gentica do hospedeiro pode ter um fator importante (PEARSON e SOUSA, 1996). O grau de severidade clnica e a evoluo da doena esto relacionados ao equilbrio das respostas imune celular e humoral no co infectado (BRITO, 2006). Em ces assintomticos, a infeco por L. (L.) chagasi geralmente promove a doena sistmica crnica. No entanto, a evoluo pode ser aguda e grave, levando o animal a bito em poucas semanas. Por outro lado, a doena pode tornar-se latente e evoluir para a cura clnica espontnea (GENARO, 1993). Nos ces sintomticos, observa-se uma reduo no nmero de linfcitos T CD4+ concomitante com a proliferao do parasito nos macrfagos, o que sugere a ausncia de resposta imune efetiva no sentido de eliminar o parasito (CORRA et al., 2007). Na L. (L.) chagasi, a resistncia infeco (animais assintomticos), depender da resposta Th1, a qual est associada produo de citocinas como INF-(, TNF-(, IL-2 e IL-12, alm de linfcitos T CD4+ e CD8+. Por outro lado, a ocorrncia de leses sistmicas est diretamente relacionada com a resposta imune do hospedeiro e a evoluo da doena. O surgimento dos sinais clnicos em ces susceptveis (sintomticos) deve-se a capacidade de desenvolver uma resposta do tipo Th2, com proliferao de linfcitos B e das citocinas IL4, IL5, IL6, IL10, que vo promover uma plasmocitose. Essa resposta leva a uma hipergamaglobulinemia, que contribui para a formao de imunocomplexos e, conseqentemente leva a uma resposta humoral ineficiente (BARBIRI, 2006). Os ces infectados apresentam sinais clnicos variados, desde um estado aparentemente saudvel at a severa caquexia no estgio final. Na LVC, os sinais clnicos so febre irregular de longo curso, palidez de mucosas e um emagrecimento progressivo, at o estado de caquexia intensa, na fase terminal. Podem apresentar ainda alteraes cutneas (perda de pelos focais ou generalizada; pequenas
ulceraes crostosas, no focinho, orelhas e extremidades; despigmentao cutnea e reas de hiperqueratose, principalmente em locais correspondentes a salincias sseas), ndulos intradrmicos, ulcerados ou no, decorrentes da multiplicao das formas amastigotas, com um processo inflamatrio local. Onicogrifose, apatia, diarria, hemorragia intestinal, paresia dos membros plvicos, ascite, edema de extremidades, epistaxe, vmitos, alteraes oculares (blefarites, espessamento das plpebras, inflamao da conjuntiva, opacificao da crnea aps conjuntivite purulenta, ceratoconjuntivite seca, inflamao do trato uveal). Miotrofia, hepatoesplenomegalia, glomerulonefrite proliferativa e nefrite intersticial podendo levar a uma insuficincia renal sendo muitas vezes, a principal causa de morte em ces com leishmaniose (MARZOCHI et al., 1985; SANTA ROSA e OLIVEIRA, 1997; ASHFORD, 2000; LIMA et al., 2004; GIUNCHETTI et al., 2008). Os ces com LV apresentam hipertrofia do sistema fagocitrio mononuclear, com proliferao dos macrfagos, que resultam em linfoadenopatia generalizada na maioria dos casos. Os linfonodos destes ces geralmente apresentam linfadenite crnica, envolvendo toda a arquitetura do linfonodo, entretanto, no h uma leso especfica da doena. As leses descritas so o infiltrado inflamatrio crnico capsular, composto por macrfagos, plasmcitos e linfcitos, infiltrado nos seios subcapsulares, hiperplasia folicular da cortical; hipertrofia e hiperplasia dos macrfagos dos sinusides e cordes medulares; congesto, hemossiderose e presena de formas amastigotas do protozorio dentro de macrfagos (LIMA et al., 2004). A presena de infiltrado plasmocitrio esperada, devido ativao policlonal e a proliferao de linfcitos B, que induzem um aumento dessas clulas na cortical, no centro germinativo e nos cordes medulares dos linfonodos (MYLONAKIS et al., 2005). Na anlise histolgica de linfonodos de animais assintomticos descrita uma prevalncia de hipertrofia e hiperplasia celular das zonas cortical e medular. Nos ces sintomticos, a atrofia da regio cortical foi descrita como o aspecto mais marcante (GIUNCHETTI et al., 2008). Em algumas pesquisas relata-se que os linfonodos mais comumente afetados em ces com LVC foram os poplteos, sugerindo evidncias de envolvimento visceral.
Esplenomegalia e hepatomegalia tambm so freqentes nestes ces (FEITOSA et al., 2000).
2.3 Apoptose
A morte celular programada vem sendo descrita desde 1828, quando os pesquisadores observaram a regresso fisiolgica de estruturas durante o
desenvolvimento de fetos e larvas. No entanto, o termo apoptose foi descrito na literatura biomdica apenas em 1972, para definir clulas que morrem como parte de um programa normal de desenvolvimento celular. Sua adequada regulao mostra-se importante para o desenvolvimento e manuteno dos tecidos normais (apud Kerr et al. (1972) em COTTER, 2009). O termo apoptose e morte celular programada so usados como sinnimos, referindo-se a morte individual de uma clula em uma ampla variedade de processos. O termo morte celular programada deveria ser utilizado em casos fisiolgicos (embriognese e crescimento tecidual normal). A morte celular patolgica deveria ser identificada pelos termos apoptose ou necrose apopttica (MYERS & MCGAVIN, 2009). A apoptose a via de morte celular, induzida por um programa intracelular altamente regulado, no qual as clulas destinadas a morrer ativam enzimas que degradam seu DNA nuclear e as protenas citoplasmticas. Um aspecto caracterstico a hidrlise das protenas envolvendo a ativao de vrios membros da famlia das enzimas caspases. A apoptose inicia-se atravs de duas vias distintas, porm convergentes. A via extrnseca iniciada pelos receptores de morte celular (TNFR1, FAS) e a via intrnseca ou mitocondrial ativada pelo aumento da permeabilidade mitocondrial, com a liberao de molculas pr-apoptticas no citoplasma, sem interao com os receptores de morte celular. Ambas convergem para ativar a cascata de enzimas caspases (KUMAR et al., 2005; TERZIAN et al., 2007, MYERS & MCGAVIN, 2009).
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Pela via extrnseca ocorre a ativao de receptores de membrana, transmitindo sinais para o interior da clula e ativando, inicialmente a caspase 8 ou a caspase 10. A via intrnseca, ativada por estresse celular, mediada pela liberao do citocromo c pela mitocndria, levando a ativao da caspase 9. Essas duas vias levam a ativao das caspases efetoras, tais como as caspases 3, 6 e 7 (DE NARDI, 2007). As caspases podem ser definidas como uma famlia de proteases presentes no genoma dos mamferos. Acredita-se que elas causem a apoptose quebrando ou degradando diversos substratos celulares considerados importantes na homeostasia da clula (ZIMMERMANN e GREEN, 2001; FURTADO, 2006; DE NARDI, 2007). A enzima caspase 3 considerada a mais prevalente nas clulas, caracterizando-se como responsvel pela maioria dos efeitos apoptticos, como a quebra de muitas protenas nucleares importantes. No entanto, as caspases 6 e 7, juntamente com a 3, so referidas como as caspases de execuo ou efetoras e possuem importante funo no controle da morte celular programada (ZIMMERMANN e GREEN, 2001; DE NARDI, 2007; TERZIAN et al., 2007). A apoptose pode ser um mecanismo til ou danoso ao hospedeiro, pois muitos microrganismos patognicos a utilizam como uma via que permite a sua sobrevivncia, por meio da sua inibio ou da sua induo em clulas do sistema imune. Por este fato, podem aumentar a resistncia de clulas infectadas do hospedeiro a apoptose ou induzir apoptose de clulas linfides, afetando com isso o perfil de citocinas produzidas e a regulao da sobrevivncia do parasito. Infeces por parasitos intracelulares (Trypanosoma cruzi) podem direcionar a resposta de linfcitos T, pela apoptose de linfcitos T CD4+ e CD8+, por meio de citocinas (IL-2 e IL-4), agravando a infeco (DOS REIS et al., 2007). A importncia da apoptose na modulao da resposta imune em pacientes com leishmaniose cutnea ainda incerta. BERTHO et al. em 2000, em um estudo realizado com citometria de fluxo nos subtipos de clulas T CD4+ e T CD8+ observaram que foram detectadas numerosas clulas em apoptose inicial a despeito de seu aspecto morfolgico normal. Neste estudo, nos pacientes que tiveram cura espontnea, observou-se pequeno nmero e clulas apoptticas T CD8+, freqncia similar
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verificada em clulas T CD4+ de pacientes com doena ativa. Apesar da amostra utilizada neste estudo ter sido pequena (15 pacientes com leses ativas, 2 com leses que curaram espontaneamente) os autores especulam que estes resultados em relao ao T CD8+ podem apontar para seu papel no mecanismo de cura da leishmaniose cutnea localizada. Estudos experimentais com camundongos infectados com T. cruzi descrevem a apoptose de linfcitos T, um fator importante para a sobrevivncia do protozorio dentro de macrfagos (FREIRE-DE-LIMA et al., 2000). Tambm relata-se que a apoptose de linfcitos na Doena de Chagas teria como conseqncia a inibio da resposta Th1, que favorece o parasito. Da mesma forma, a liberao de molculas pr-apoptticas pelo protozorio, no meio extracelular, induziria a apoptose de macrfagos e a liberao de formas infectivas viveis de T. cruzi (LOPES e DOS REIS, 2000). Em camundongos infectados com Leishmania major, descreve-se que ocorre apoptose FasL-dependente em macrfagos peritoneais, com isso h liberao de quimiocinas (MIP-1, MIP-1 e MIP-2), que atraem neutrfilos, que tambm sofrem apoptose e com isso desativam os macrfagos, pela secreo de PGE2 e TGF. Por esse fato, o protozorio tem maior sobrevivncia no hospedeiro (DOS REIS et al., 2007). A Leishmania amazonensis possui a fosfatidilserina (PS) em sua membrana celular externa. PS induz no hospedeiro a sntese de citocinas antiinflamatrias, com isso h inibio da sntese de xido ntrico pelo macrfago e h o estmulo a produo de TGF e IL-10. Esses fatos favorecem a entrada e a multiplicao do parasito no macrfago. J foi comprovado tambm que PS um potente estimulador da apoptose. Essa capacidade de PS pode estar relacionada com a seleo de genes durante a presso de seleo do parasito, que favorecem a sua interao com o hospedeiro. Ainda no est claro se PS presente na superfcie do parasito produzido por ele ou pelo hospedeiro, mas sabe-se que existem parasitos positivos ou negativos para PS, com isso sugerido se a presena do PS uma caracterstica de virulncia ou se a infectividade do parasito definida pela capacidade desta substncia de evitar a morte do parasito dentro do fagolisossomo de macrfagos (BARCINSKI et al., 2003).
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Postulou-se que na infeco experimental por Leishmania donovani ocorre a induo da apoptose de clulas no infectadas do sistema imune (linfcitos T CD4+), possivelmente por influncia do lipofosfoglicano (LPG) presente em sua parede celular, sugerindo que este seria um mecanismo de evaso do sistema imune do hospedeiro (LDER et al., 2001). Pelo fato do controle da LVC ser feito pela eutansia de ces soropositivos, poucos estudos foram feitos para avaliar a resposta do co frente ao protozorio. Sabese que pode haver predominncia de resposta humoral e de citocinas antiinflamatrias em alguns casos de doena avanada. Avaliar a presena de apoptose em clulas linfides seria importante para entender uma possvel evaso imune do parasito, pela identificao da clula alvo deste mecanismo, o que favoreceria o comprometimento da resposta celular do hospedeiro.
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III. OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo analisar linfonodos perifricos e cavitrios de ces naturalmente infectados por L. (L.) chagasi, oriundos do municpio de Araatuba (SP), rea endmica para Leishmaniose Visceral, visando a: - Avaliar a presena de clulas em apoptose nos linfonodos; - Determinar a densidade destas clulas entre os diferentes linfonodos analisados; - Associar a densidade de clulas apoptticas com a carga parasitria de cada linfonodo; - Comparar estes achados com o estadiamento clnico dos ces.
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IV. MATERIAL E MTODOS
4.1- Material
Foram avaliados 32 ces do Centro de Controle de Zoonoses de Araatuba (SP), regio endmica para Leishmaniose Visceral. Os animais encaminhados por proprietrios ou capturados nas ruas da cidade so submetidos eutansia diariamente neste local. Avaliou-se uma amostra desta populao, sem predileo por raa, sexo ou idade. Os ces foram submetidos eutansia sob anestesia barbitrica (Tiopental, Cristlia Itapira, SP), conforme recomenda o cdigo de tica para uso de animais em pesquisa cientfica (AVMA, 2001), mediante injeo intravenosa de cloreto de potssio1. No exame externo dos cadveres foram avaliadas as alteraes macroscpicas que permitiram classific-los nos grupos deste estudo. A classificao do Ministrio da Sade (2006) foi considerada para formao dos grupos: ces sintomticos (leses de pele, onicogrifose, emagrecimento), oligossintomticos (linfoadenomegalia e perda de peso) e assintomticos (ausncia de sinais clnicos sugestivos de infeco por Leishmania). Um grupo composto por 10 ces hgidos, oriundos de rea no endmica para LVC foi utilizado como controle para a imunomarcao de clulas apoptticas. Os linfonodos poplteos destes ces so oriundos da rotina de necropsias do Departamento de Patologia Veterinria da FCAV UNESP, do Cmpus de Jaboticabal. Os linfonodos colhidos foram submetidos anlise histopatolgica e
imunoistoqumica.
O delineamento experimental deste estudo foi aprovado pela Comisso de tica e Bem Estar
Animal da FCAV UNESP, Cmpus de Jaboticabal (Protocolo n. 000599-08).
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4.2 - Anlise Histopatolgica
Foram colhidos fragmentos de linfonodos (poplteo, subescapular, mesentricos e ilacos), para anlise em microscopia de luz. Os linfonodos foram selecionados de regies superficiais e profundas para avaliar se h o mesmo padro de resposta celular, quando comparado ao estgio clnico da doena nos ces. Os fragmentos dos linfonodos foram fixados em soluo de formol a 10%, tamponado com fosfatos (0,15 molar), com pH 7,2. Aps 24 horas de fixao, os fragmentos foram desidratados em solues de concentrao decrescente de lcool, diafanizados em xilol e includos em parafina. Os cortes foram feitos na espessura de 5m e corados com hematoxilina e eosina, para posterior identificao das principais alteraes morfolgicas do linfonodo. Foram avaliadas as alteraes microscpicas presentes nos linfonodos poplteo, subescapular, mesentrico e ilaco, considerando a reao celular predominante (reatividade linfide, granulomas, plasmocitose) e a intensidade das leses foi graduada em sem alteraes (0), discreta (1), moderada (2) e acentuada (3) para os tipos celulares macrfago e plasmcitos. Para os linfcitos considerou-se o seguinte escore: (0) atrofia linfide, (1) no reativo, (2) discreta reatividade, (3) moderada reatividade, (4) acentuada reatividade linfide.
4.3 - Anlise Imunoistoqumica
A anlise imunoistoqumica, para a determinao da carga parasitria (ANEXO 1) foi feita por meio do Complexo Estreptavidina Biotina Peroxidase (kit LSAB Dako, cd. K0690). Como anticorpo primrio foi utilizado soro de co positivo para Leishmaniose Visceral (diluio 1:1000), segundo protocolo descrito por TAFURI et al. (2004). A soropositividade deste co foi avaliada pela tcnica de ELISA. O cromgeno
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utilizado foi diaminobenzidina (DAB, Dako, cd. K3468). O sistema de recuperao antignica foi feito pelo vapor (panela eltrica a vapor, Philips Walita), com soluo de citrato de sdio 10 mM, pH 6,0. Como controle negativo optou-se por excluir o anticorpo primrio da reao. Para a determinao da densidade de clulas apoptticas (ANEXO 2) utilizou-se o anticorpo anti-caspase 3 clivada (Cell Signaling, cd. 9661) , na diluio de 1:200, segundo o protocolo descrito por DE NARDI, (2007). Para a determinao da porcentagem de clulas imunomarcadas, consideraramse cinco campos microscpicos, com objetiva de 40x, abrangendo todas as reas anatmicas do linfonodo (cpsula, seio subcapsular, cortical e medular). A partir dos valores obtidos nestes campos, fez-se uma mdia do nmero de clulas
imunomarcadas por animal. A mdia da carga parasitria e do nmero de clulas apoptticas foi avaliada em cada grupo de ces infectados (assintomtico, oligossintomtico e sintomtico).
4.4 - Anlise Estatstica
As contagens de clulas imunomarcadas para carga parasitria e clulas apoptticas, foram submetidas anlise de varincia pelo mtodo dos quadrados mnimos, utilizando o programa computacional SAS (SAS 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA). Foram verificadas as pressuposies de normalidade dos resduos e homogeneidade de varincias. Para atender estas pressuposies, os dados foram submetidos transformao logartmica e comparao de mdias de carga parasitria por grupo e a densidade mdia de clulas apoptticas por grupo foi realizada pelo Teste de Tukey (P<0,05). Os escores de tipo celular verificados no infiltrado inflamatrio do linfonodo poplteo foram avaliados por regresso logstica, considerando o efeito de grupo. A comparao entre grupos para os escores foi feita pelo Teste de Qui-quadrado (P<0,05). Coeficientes de correlao de Spearman entre os
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escores de tipo celular foram obtidos por grupo para cada clula (macrfago, plasmcito e linfcito). Para o parmetro tipo celular, nos demais linfonodos, alm da regresso logstica o teste no paramtrico de Kruskal-Wallis. A associao entre a carga parasitria e densidade de clulas apoptticas foi avaliada pela Correlao Simples de Pearson (P<0,05), em cada linfonodo, por grupo.
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V. RESULTADOS
5.1- Anlise Anatomopatolgica
No exame externo dos animais sintomticos, as leses mais freqentes foram: conjuntivite, caquexia, onicogrifose, reas de alopecia, descamao e ulcerao na pele, que variavam de distribuio local a disseminada. O ouvido externo, a regio periocular e as extremidades dos membros foram os locais mais frequentemente envolvidos. necropsia, observou-se linfadenomegalia, esplenomegalia, hepatomegalia e degenerao heptica. Nos ces oligossintomticos observou-se apenas um aumento de volume generalizado de linfonodos e, por vezes, reas de descamao cutnea, j nos animais assintomticos havia ausncia de sinais clnicos evidentes. Os achados anatomopatolgicos mais freqentes foram o aumento de volume dos linfonodos perifricos, que ao corte apresentavam com protruso do parnquima e um aspecto gelatinoso (edemaciado). Muitas vezes na regio da cortical havia a presena de reas esbranquiadas, sugestivas de hiperplasia linfide. A colorao alaranjada da zona medular foi um achado freqente (hemossiderose).
5.2 - Anlise Microscpica
De maneira geral, na anlise microscpica do linfonodo poplteo foi observada a presena de infiltrado celular na cpsula, com distribuio difusa a moderada, composto predominantemente por plasmcitos, macrfagos reativos e/ou parasitados, formando granulomas (Figura 1A). Na regio subcapsular, a clula mais freqente foi o macrfago, com hemossiderose e eritrofagocitose e em algumas situaes com formas
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amastigotas do protozorio. Entretanto, em alguns animais com elevada carga parasitria j foi possvel observar a presena de granulomas nestes locais, que se estendiam at a regio trabecular da cortical, atingindo a camada medular. Na regio cortical, a reatividade linfide variou de discreta a moderada e, nos casos mais avanados de LVC houve atrofia linfide, devido invaso histioctica. Nesses casos foi comum observar debris celulares e clulas com caractersticas de apoptose na cortical, tanto na poro central do nodo linfide (linfcitos B) quanto na regio paracortical povoada por linfcitos T (Figura 1B). A maior prevalncia desta leso foi nas regies paracortical e nos cordes medulares. E as clulas mais
frequentemente envolvidas foram os linfcitos. O aspecto microscpico mais comum foi presena de picnose nuclear e de acidofilia citoplasmtica, embora tambm tenha sido observada a presena de corpos apoptticos (Figuras 4A e 4B). Os granulomas focais tinham por predileo pela regio de transio corticomedular. Nos casos mais avanados, somente em ces com elevada carga parasitria foi possvel observar na colorao de hematoxilina e eosina a presena de formas amastigotas de Leishmania sp. intracitopalsmtica. Nestes casos a reao
granulomatosa era difusa e atpica, composta raramente por clulas multinucleadas (clulas gigantes). Estes granulomas invadiam a cortical (Figura 2A), causando atrofia linfide e na medular distorciam a arquitetura dos cordes e sinusides. Na camada medular havia hiperplasia e hipertrofia histiocitria nos sinusides, geralmente associada eritrofagocitose e hemossiderose. Os granulomas eram mais freqentes nestas reas do linfonodo (Figura 2B). Nos cordes predominavam plasmcitos e clulas Mott (Figura 3A). A identificao de macrfagos imunomarcados com formas amastigotas de Leishmania, nos granulomas, foi vista em todas as regies do linfonodo (Figura 5A e B), mas tambm observou-se esta reao positiva em fibroblastos capsulares (Figura 3B). No linfonodo subescapular, a reatividade linfide foi um aspecto marcante, independente de grupo, com menor nmero de granulomas em relao ao linfonodo poplteo. J os linfonodos ilacos, seguidos dos mesentricos foram os que apresentaram menor resposta celular em todos os ces deste estudo.
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A carga parasitria no linfonodo poplteo foi maior nos grupos S e O (P<0,05), como pode ser observado na Figura 6A. No linfonodo subescapular a carga parasitria foi maior no grupo S (P<0,05) quando comparado aos demais grupos, como observado na Figura 6B. J os linfonodos mesentricos e ilacos no apresentaram diferenas estatsticas significativas entre os grupos e tiveram uma carga parasitria baixa. A imunomarcao de clulas apoptticas ocorreu predominantemente no citoplasma da clula linfide. Em relao densidade de clulas apoptticas todos os linfonodos dos ces infectados deste estudo no diferiram estatisticamente na comparao entre grupos (P>0,05), apenas em relao ao grupo controle (P<0,05). O linfonodo poplteo no diferiu entre os grupos infectados, apenas em relao ao grupo controle para os grupos S e O (Figuras 7A). O mesmo aspecto pode ser observado nos linfonodos mesentrico, ilaco (Figuras 8A e B), com maior mdia de clulas apoptticas no grupo S. A nica exceo foi observada no linfonodo subescapular, que tambm apresentou diferenas estatsticas significativas entre os grupos infectados e o controle (P<0,05), mas a maior densidade de apoptose ocorreu no grupo O (Figura 7B).
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*
A
B
Figura 1 - Fotomicrografia de linfonodos de ces com Leishmaniose Visceral. (A) Regio capsular do linfonodo poplteo com infiltrado inflamatrio crnico acentuado (*), no detalhe notar a predominncia de plasmcitos (setas / co oligossintomtico, Obj. 20x). (B) Regio cortical do linfonodo com vrias clulas apoptticas (setas). Notar no detalhe o ncleo picntico e o citoplasma acidfilo (linfonodo ilaco, co assintomtico). Hematoxilina e Eosina. Obj. 40x.
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*
B
Figura 2 Fotomicrografia de linfonodos de ces com Leishmaniose Visceral. (A) Regio de transio cortico-medular do linfonodo poplteo com severa e difusa reao granulomatosa (*, Obj.20x). (B) Regio medular do linfonodo subescapular com presena de granulomas (*) nos cordes (Obj.40x). Hematoxilina e Eosina / Co sintomtico.
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* *
*
A
B
Figura 3 - Fotomicrografias de linfonodos de ces com Leishmaniose Visceral. (A) Regio medular com severa plasmocitose nos cordes (* / linfonodo mesentrico / co oligossintomtico). (B) Regio capsular do linfonodo poplteo com presena de fibroblastos parasitados (setas). No detalhe observa-se a imunomarcao de Leishmania sp. no fibroblasto (co sintomtico / Complexo Estreptavidina Biotina Peroxidase). Hematoxilina e Eosina / Obj. 40x.
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B
Figura 4 Fotomicrografias de linfonodos de ces com Leishmaniose Visceral. (A) Regio paracortical (setas) e na medular (cabea de seta), com clulas apoptticas imunomarcadas (linfonodo ilaco, grupo sintomtico, Obj.20x). (B) Regio medular com presena de clulas apoptticas nos cordes (setas). Notar detalhe dos corpos apoptticos (seta, linfonodo subescapular, co oligossintomtico, Obj.40x). Complexo Estreptavidina Biotina Peroxidase.
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B
Figura 5 Fotomicrografias de linfonodos de ces com Leishmaniose Visceral. (A) Regio medular com inmeros macrfagos imunomarcados para Leishmania sp. (setas). (B) Regio cortical com presena de macrfagos parasitados no centro do folculo linfide (*). Linfonodo poplteo, co sintomtico, Complexo Estreptavidina Biotina Peroxidase, Obj.40x.
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a
45 40 Carga Parasitria 35 30 25 20 15 10 5 0 S O Grupos de ces A
10,16 2,90b 29,59 8,44a 42,62 12,16a
b
Carga Parasitria
35 30 25 20 15 10 5 0
32,22 24,52a
3,02 2,30b
2,88 2,19b
O Grupos de ces
Figura 6 - Mdias e respectivos desvios-padro para a caracterstica carga parasitria por grupo de ces infectados (S = sintomtico; O = oligossintomtico e A = assintomtico), nos linfonodos poplteo (a) e subescapular (b). Mdias seguidas de letras distintas diferem significativamente pelo Teste de Tukey (P<0,05).
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a
Nmero de clulas apoptticas
25 20 15 10
6,35 3,11ab 19,86 9,74a
14,32 7,02a
5 0 S O A
1,90 0,93b
Grupos de ces
14 12 10 8 6 4 2 0 S O A C Grupos de ces
4,34 3,44ab 2,30 1,82b 9,42 7,46ab 11,79 9,33a
Figura 7 - Mdias e respectivos desvios-padro para a caracterstica clulas apoptticas por grupo nos linfonodos poplteo (a) e subescapular (b) de ces infectados para LVC (S = sintomtico; O = oligossintomtico; A = assintomtico; C = controle). Mdias seguidas de letras distintas diferem significativamente pelo Teste de Tukey (P<0,05).
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a
16 14 12 10 8 6 4 2 0
14,17 8,25a
8,58 4,99a 6,31 3,67ab
1,90 1,10b
Grupos de ces
25 20 15 10
6,35 3,11ab 19,86 9,74a
14,32 7,02a
5
1,90 0,93b
0 S O A C Grupos de ces
Figura 8 - Mdias e respectivos desvios-padro para a caracterstica clulas apoptticas por grupo nos linfonodos mesentricos (a) e ilacos (b) de ces infectados para LVC (S = sintomtico; O = oligossintomtico; A = assintomtico e C = controle). Mdias seguidas de letras distintas diferem significativamente pelo Teste de Tukey (P<0,05).
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Pela anlise do perfil celular predominante no linfonodo poplteo foi possvel verificar que houve diferena significativa entre grupos para os tipos celulares linfcitos e macrfagos (P<0,05). Na comparao entre grupos, os ces dos grupos S e O diferiram significativamente do grupo A para a varivel macrfago, ou seja, tiveram maior densidade destas clulas. J para os linfcitos, as diferenas ocorreram entre todos os grupos. Na caracterstica plasmcito s notou-se diferena significativa entre os grupos A e O. Para o grau de associao entre os trs tipos celulares verificaram-se diferenas entre estes no grupo A, no grupo O somente para macrfagos e plasmcitos e no grupo S houve uma associao negativa entre macrfagos e linfcitos (Figura 9).
100% 80% 60% 40% 20% 0% A O S A O S A O S Linfcito Plasmcito Macrofgo

4 3 2 1 0
Figura 9 - Proporo de escore celular no linfonodo poplteo dos grupos de ces infectados para LVC (A = assintomtico, O = oligossintomtico e S= sintomtico), observados no infiltrado celular (linfcito, plasmcito e macrfago).
Escores de intensidade de infiltrado celular: sem alterao (0), discreta (1), moderada (2) e acentuada (3) para os tipos celulares macrfago e plasmcitos. Para os linfcitos considerou-se o seguinte escore: (0) atrofia linfide, (1) no reativo, (2) discreta reatividade, (3) moderada reatividade, (4) acentuada reatividade linfide.
30
O perfil celular predominante no linfonodo subescapular foi de macrfagos, com diferenas significativas entre grupos (P<0,05). Na comparao entre grupos, os ces do grupo S diferiram significativamente do grupo A e O (Figura 10).
b 100% 80% 60% 40% 20% 0% A O
3 2 1
Grupos de ces
Figura 10 - Proporo de escore celular de macrfagos (1 = discreto; 2 = moderado; 3 = acentuado) no linfonodo subescapular dos grupos de ces infectados para LVC (A = assintomtico, O = oligossintomtico e S= sintomtico). Mdias seguidas de letras distintas diferem significativamente pelo Teste de KruskalWallis (P<0,05).
Os
outros
tipos
celulares
no
diferiram
estatisticamente
no
linfonodo
subescapular, bem como, nos linfonodos mesentricos e ilacos no foi possvel observar diferenas estatsticas significativas em relao ao tipo celular predominante entre os grupos de ces infectados (P>0,05).
31
Na anlise do grau de associao entre as variveis carga parasitria e densidade de clulas apoptticas nos linfonodos, no houve correlao significativa entre os grupos de ces infectados (P>0,05).
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VI. DISCUSSO
Na LVC, as alteraes em rgos linfides so as leses mais freqentes, no entanto, existem poucos estudos enfocando as alteraes no linfonodo dos ces infectados (LIMA et al., 2004; GIUNCHETTI et al., 2008). Nos linfonodos poplteos dos ces deste estudo, foi possvel observar macroscopicamente, que independente do volume do linfonodo, na maioria dos ces havia microscopicamente infiltrado celular (macrfagos e/ou plasmcitos), que muitas vezes distorcia a arquitetura do linfonodo, nos casos mais avanados da doena. Portanto, a ausncia de linfadenomegalia no indicativa da ausncia de alteraes celulares e/ou da presena do parasito neste rgo linfide, que o mais analisado durante o exame clnico de ces em reas endmicas para LVC. Portanto, estes resultados esto de acordo com as observaes de LIMA et al. (2004), que verificaram que no h relao entre o estadiamento clnico e carga parasitria de ces naturalmente infectados, com a intensidade das leses nos linfonodos dos animais dos grupos assintomtico (A), oligossintomtico (O) e sintomtico (S). Nesta zoonose, a linfoadenopatia crnica normalmente descrita em ces infectados por L. (L.) chagasi, com reatividade das zonas cortical e medular (LIMA et al. 2004). Neste estudo, no linfonodo poplteo, houve diferena significativa entre os trs grupos de ces infectados para reatividade linfide (P<0,05). A hiperplasia folicular da regio cortical ocorreu em animais dos grupos A e O. A atrofia folicular predominou nos ces do grupo S. Esses achados so similares aos descritos por GIUNCHETTI et al. (2008). O perfil celular predominante entre os grupos no linfonodo poplteo foi de macrfagos, plasmcitos e linfcitos. J a predominncia de macrfagos nos grupos S e O pode estar relacionada com um perfil de citocinas pr e anti-inflamatrias que estejam orquestrando a resposta imune nestes grupos. Sabe-se que algumas citocinas tm ao antimicrobicida (CORRA et al., 2007), portanto, a reao granulomatosa observada nos linfonodos, independente do grupo de ces infectados, poderia estar
33
relacionada com um perfil de resposta predominantemente do tipo Th2, com macrfagos com inibida capacidade de destruir o parasito, induzida por estas citocinas. J foi descrita a presena de nveis elevados de IL-10 e TGF- em baos de ces sintomticos e assintomticos para Leishmania, confirmando a predominncia do perfil Th2 na doena ativa, juntamente com a reduo dos nveis de IFN-(, potente ativador da atividade microbicida de macrfagos (CORRA et al. 2007). Da mesma forma, ALVES et al (2009) observaram predominncia de citocinas do tipo Th2 (IL-4, IL-10, TGF-() no linfonodo pr-escapular de ces do grupo sintomtico, associadas elevada carga parasitria, mostrando susceptibilidade infeco por Leishmania chagasi. Da mesma forma, sabe-se que alm da deficiente produo de enzimas lticas, tais como iNOS em macrfagos parasitados por Leishmania (L.) chagasi (ZAFRA et al., 2008), tambm ocorre a inibio da capacidade de expressar molculas de MHC classe II na membrana celular destes fagcitos ou esta expresso aparece internalizada na membrana celular da forma amastigota de Leishmania amazonensis (LEO et al., 1995), comprometendo tanto a funo de lise do parasito, quanto a de apresent-lo aos linfcitos T CD4+. Esses aspectos caracterizam mecanismos de escape do sistema imune do hospedeiro canino e comprovam, portanto a capacidade de sobrevivncia e de multiplicao no sistema fagoctico mononuclear do co e de sua disseminao sistmica. Os granulomas observados no presente estudo, no possuem a conformao clssica descrita nos granulomas nodulares tuberculides, onde aparecem trs estruturas distintas, tais como, uma rea central de necrose caseosa, uma rea intermediria com macrfagos (clulas epiteliides e gigantes) e uma rea perifrica composta por linfcitos, plasmcitos e cpsula fibrosa. Neste tipo de granuloma predominam as citocinas do tipo Th1. Em nosso estudo, a inflamao granulomatosa observada compatvel com a classificao de granulomas difusos do tipo lepromatosos, tambm vistos na infeco por Mycobacterium leprae, M. aviumintracellulares paratuberculosis (Doena de Jonhe) e M. avium-intracellulare de aves e outras espcies de animais. Nestes granulomas o aspecto caracterstico infiltrado
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inflamatrio predominantemente macrofgico, com poucos linfcitos e plasmcitos, com perfil predominante de citocinas Th2 (ACKERMANN, 2009). A associao negativa entre macrfagos e linfcitos no grupo S, vista no linfonodo poplteo, mostrando que nos casos mais avanados da LVC, a capacidade de resposta imune do co est comprometida, j que os linfcitos da regio cortical sofrem atrofia, devido invaso histioctica. Esse quadro agravado pelo comprovado aumento da carga parasitria neste grupo. Estes resultados so similares aos descritos por LIMA et al. (2004), no entanto neste estudo foi observada tambm a presena de granulomas altamente parasitados na regio cortical, contrariando as observaes deste autor. Neste estudo observa-se que nos linfonodos poplteos e subescapulares, o aumento do nmero de parasitos coincidiu com o aumento do nmero de granulomas e com o agravamento da doena. Entretanto, alguns autores afirmam que no fgado a presena de granulomas associados baixa carga parasitria indicaria um sinal de resistncia deste rgo frente infeco (GIUNCHETTI et al., 2008). No caso do presente estudo acredita-se que existam respostas diferenciadas para o parasito em cada rgo, ou seja, uns so mais resistentes e outros mais susceptveis a multiplicao de L. (L.) chagasi. REIS et al. (2009) mostraram perfis de resposta variados em diferentes rgos de ces com LVC, denominando estas diferenas como resposta compartimentalizada de cada rgo frente a infeco. Esse padro de resposta pode estar relacionado proliferao ou ao controle da multiplicao do parasito nos rgos infectados. Mesmo quando se compara diferentes linfonodos, estas respostas variadas aparecem. No caso do linfonodo subescapular houve maior reatividade e menos atrofia linfide, quando comparado ao poplteo. LIMA et al. (2004), estudaram linfonodos perifricos de ces com LVC e observaram que o linfonodo cervical foi o mais afetado e isso foi devido rea drenada pelo mesmo (regio da cabea), maior alvo do vetor de LVC. No caso deste estudo, o linfonodo subescapular tambm drena esta regio e, portanto apresentou maior reatividade. A causa da maior atrofia linfide observada no linfonodo poplteo, em ces com doena avanada, poderia ocorrer porque este
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linfonodo seja afetado mais tardiamente que os linfonodos da regio cervical e que o subescapular. Portanto os efeitos inibidores induzidos pelo protozorio teriam um tempo de ao diferenciado entre os linfonodos afetados. ALVES et al. (2009) observaram que nos linfonodos pr-escapulares houve reatividade linfide e proliferao de macrfagos na medular, resultando em linfadenopatia, mais freqente que nos linfonodos axilar e poplteo. Em nosso estudo, tambm observamos maior reatividade linfide no subescapular, que drena a mesma regio que o pr-escapular descrito por estes autores. J nos linfonodos mesentricos e ilacos no foi observado a mesma caracterstica, pois eles apresentaram baixa carga parasitria associada a discretas alteraes morfolgicas. A diferente resposta celular observada entre os linfonodos poplteo e subescapular poderia ser explicada pelo tempo de evoluo da doena, ou seja, na fase aguda os linfonodos cervicais e o subescapular seriam os mais envolvidos, pois a regio da cabea o local de maior acesso do mosquito-palha. J na fase crnica o linfonodo poplteo seria o mais afetado, possivelmente por um contato mais tardio com o antgeno. Na rotina do exame clnico dos ces, os linfonodos cervicais geralmente so negligenciados e o subescapular somente palpvel quando h aumento de volume perceptvel. Enquanto o poplteo o linfonodo de escolha e drena a linfa dos membros plvicos (DYCE et al., 2004; ALVES et al., 2009) Em regies quentes estas reas tambm so muito procuradas pelo inseto vetor, principalmente na regio interdigital, pois um local de maior umidade. J a regio inguinal tambm muito afetada, pois composta por pele glabra. Em um animal do grupo sintomtico, com elevada carga parasitria, observou-se a presena de fibroblastos altamente parasitados por formas amastigotas de Leishmania chagasi. Esta observao mostra que esta clula tambm hospedeira do protozorio, conforme relatos de BOGDAN et al. (2000). Sabe-se que fibroblastos quando ativados, produzem citocinas, fatores de crescimento, entre outros (MORAES e JOAZEIRO, 2005). Estudos in vitro com fibroblastos parasitados por L. major mostram que esta clula no possui capacidade microbicida, portanto o parasito teria um ambiente menos hostil para sobreviver, embora no seja descrita sua multiplicao no
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interior destas clulas (BOGDAN et al. 2000). Por este fato, com base nos relatos da literatura e nas observaes deste estudo sugere-se que o protozorio Leishmania sp. poderia utilizar o fibroblasto para modular a resposta imune do hospedeiro, juntamente com os macrfagos, favorecendo sua evaso imune. O envolvimento do fibroblasto na resposta imune j foi descrito em outras situaes, onde estas clulas so denominadas de fibroblastos sentinelas e so capazes de expressar citocinas e receptores de superfcie similares aos dos linfcitos T CD4+. Estas subpopulaes de fibroblastos podem expressar citocinas do tipo Th1 (IL-2, TNF-, IFN-) ou Th2 (IL-4, TGF- e MPC-1). Estas citocinas permitem ao fibroblastto interagir com os componentes da matriz extracelular e com leuccitos, tais como, macrfagos, granulcitos, mastcitos e linfcitos (MORAES e JOAZEIRO, 2005). A presena de plasmocitose e de corpsculos de Russell nestas clulas foi um aspecto marcante nos linfonodos perifricos. Possivelmente este perfil celular indica uma predominncia de resposta humoral, j que plasmcitos produzem
imunoglobulinas e os corpsculos de Russell no mais so que estas protenas visveis no ambiente intracitoplasmtico do plasmcito. Portanto, ces com este tipo celular no responderiam eficientemente ao protozorio. Em camundongos infectados com L. amazonensis, a predominncia de linfcitos B e anticorpos favoreceu a progresso da doena, devido supresso da migrao de linfcitos T CD4+ para o stio da leso (WANASEN e SOONG, 2008). A presena de hemossiderina foi um aspecto freqente nos animais avaliados, independente da carga parasitria (16/32 ces). No homem e nos ces, a anemia freqente na Leishmaniose Visceral. Ela pode estar associada insuficincia renal crnica e a hipoplasia ou aplasia da medula pelo acentuado infiltrado celular e parasitrio (COSTA-VAL et al., 2007), bem como, a anemia hemoltica descrita em pacientes humanos que possuem anticorpos anti-eritrcitos, pela ativao de linfcitos B, pelo aumento da permeabilidade da membrana do eritrcito, por citocinas que interferem na ao da eritropoietina e pelo seqestro de eritrcitos para o bao (MAHAJAN e MARWAHA, 2007).
37
Em
relao s clulas apoptticas, no houve diferenas estatsticas
significativas entre os trs grupos de ces infectados, apenas em relao aos ces do grupo controle. Porm pode-se observar que nos linfonodos poplteos, mesentricos e ilacos, essas clulas apareceram com maior densidade no grupo S, seguido dos ces do grupo O, j no subescapular essa concentrao foi maior no grupo O (Figuras 7A/B e 8A/B). Embora no tenha sido possvel observar associao significativa entre a presena de apoptose no tecido linfide, com o aumento da carga parasitria no linfonodo, parece haver evidncia biolgica dessa associao, j que a maior densidade de clulas apoptticas ocorreu em animais que tiveram a maior carga parasitria, como foi observado no grupo de ces sintomticos. Possivelmente, L. (L.) chagasi poderia utilizar-se de mecanismos de evaso imune, por participar da induo da reao granulomatosa e da atrofia linfide em animais com quadro clnico mais grave. Com isso, esses ces seriam mais susceptveis a infeco e incapazes de responder com uma imunidade do tipo celular. GOTO e LINDOSO (2004) observaram a apoptose in vivo em hamsters com Leishmaniose visceral, apenas na fase inicial da infeco. A progresso da doena coincidiu com a ausncia da apoptose nas clulas do fgado e bao. Por esse fato, deduziu-se que com a evoluo da LV, a apoptose pode diminuir sua ao sobre as clulas do sistema imune. No presente estudo, a evoluo da LVC crnica e foi significativa em linfonodos de ces do grupo sintomtico, em fase avanada da doena. Por isso, seria importante afirmar que a resposta dos ces frente infeco por L. (L.) chagasi bem diferente dos modelos experimentais, possivelmente porque este tipo de hospedeiro no sofre os efeitos imunomodulatrios da saliva do inseto vetor do protozorio. Similar aos resultados do presente estudo, VEROSA et al. (2009 a/b) observaram apoptose nos grupos de ces assintomticos e sintomticos, tanto no infiltrado inflamatrio renal quanto no cutneo, porm s houve diferena estatstica entre os grupos na pele, sugerindo que a apoptose participa na modulao da resposta inflamatria nos ces com LVC.
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Neste estudo observou-se a prevalncia de clulas apoptticas na cortical, tanto na poro central do nodo linfide (linfcitos B) quanto na regio paracortical, povoada por linfcitos T. Nas regies paracortical e nos cordes medulares foi observada a maior densidade de clulas apoptticas, sendo os linfcitos T e B as clulas que sofreram este processo. Em estudos experimentais com camundongos infectados com T. cruzi descreveu-se que os linfcitos T apoptticos so importantes para a sobrevivncia do protozorio dentro de macrfagos (FREIRE-DE-LIMA et al., 2000), com conseqente inibio da resposta Th1. Da mesma forma, a liberao de molculas pr-apoptticas pelo protozorio, no meio extracelular, induziria a apoptose de macrfagos e a liberao de formas infectivas viveis de T. cruzi (LOPES e DOSREIS, 2000). Os resultados deste estudo estariam em concordncia com estes autores, pois a carga parasitria e a densidade de clulas apoptticas foram maiores nos ces sintomticos, podendo estar relacionadas causa de atrofia linfide dos linfonodos, deixando-os mais susceptveis a LVC. Uma hiptese final para explicar a sobrevivncia do protozorio Leishmania sp. nos hospedeiros susceptveis seria que este parasito eficiente em enganar o sistema imune do hospedeiro, pois j comprovado que existe reduo da populao de linfcitos T CD4+ em animais infectados por L. donovani, via apoptose (LDER et al., 2001). Da mesma forma, descreve-se que o perfil predominante de citocinas em ces sintomticos o do tipo Th2 (citocinas anti-inflamatrias) e com isso h a inibio da ativao e da atividade microbicida de macrfagos, que so estimulados principalmente por IFN- (CORREA et al., 2007). A expresso de MHC-II pode variar entre as espcies de Leishmania, mas em estudos com L. donovani houve reduo desta expresso, caracterizando uma ineficiente capacidade do macrfago em apresentar antgenos aos linfcitos T (REINER et al.,1987). Por esse fato, considerando os resultados deste estudo, pode-se sugerir que em animais com doena avanada (grupo sintomtico) houve maior carga parasitria e processo inflamatrio crnico extenso nos linfonodos perifricos, seguido de uma reduo drstica da populao linfide. Esses animais seriam menos eficientes em responder infeco pelo protozorio e em montar uma resposta imune do tipo Th1, j que tiveram atrofia linfide. Ficou claro que Leishmania
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(L.) chagasi utiliza o processo apopttico como mecanismo de evaso imune, quando observa-se a rarefao de linfcitos T nos linfonodos de ces com doena crnica. Em estudos futuros seria muito importante avaliar o tipo de linfcito que sofre depleo e a atividade dos macrfagos na LVC.
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VII. CONCLUSES
Nas condies deste estudo foi possvel concluir que:
- Macrfagos e plasmcitos foram as clulas predominantes nos grupos de ces infectados. - O aumento da densidade de macrfagos (granulomas) foi inversamente proporcional a densidade de linfcitos (atrofia linfide) no grupo sintomtico. - A presena de apoptose e a carga parasitria foram maiores no grupo de ces sintomticos, embora no houvesse uma associao significativa entre estes parmetros. - Existe diferena na intensidade e tipo de resposta imune entre os linfonodos subescapular e poplteo.
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PARASITOLOGIA
VETERINRIA,
SIMPSIO
LATINO-
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51
IX ANEXOS
9.1- Protocolo de Imunoistoqumica para determinao da carga parasitria de Leishmania (L.) chagasi em linfonodos de ces naturalmente infectados:
Determinao da carga parasitria com a imunomarcao das formas amastigotas de L. (L.) chagasi presentes nos linfonodos, por meio do protocolo imunoistoqumico descrito por TAFURI et al. (2004).
Os tempos de cada etapa e todo procedimento encontram-se detalhados a seguir: 1. 60C. As lminas foram inicialmente mantidas por 1 hora em estufa a desparafinadas e hidratadas em solues
Posteriormente foram
decrescentes de xilol e lcool. 2. Entre cada um dos passos descritos a seguir fez-se banhos em
gua destilada e soluo de tampo fosfato (PBS), pH 7,6. 3. O sistema de recuperao antignica foi feito pelo vapor (Steamer -
panela a vapor Philips Walita), com soluo de citrato sdio 10 mM, pH 6,0, por 40 minutos. 4. Bloqueio da peroxidase endgena foi efetivado por incubao em
soluo de lcool metlico e perxido de hidrognio (30 volumes) a 3%, durante 10 minutos, temperatura ambiente e em cmara escura. 5. Bloqueio de protenas inespecficas foi realizado com Protein Block
(DAKO, cd. X0909) por 20 minutos, temperatura ambiente. 6. Adicionou-se o anticorpo primrio na diluio 1:1000 (soro de co
positivo para LV). Em seguida as lminas foram incubadas por 18 horas em cmara mida a 40C.
52
7.
Adio
do
anticorpo
secundrio
biotinalado
(Kit
LSAB
DakoCytomation, cd. K0690) e incubao por 30 minutos, temperatura ambiente, em cmara mida. 8. Empregou-se o substrato Estreptavidina Peroxidase (Kit LSAB
DakoCytomation, cd. K0690) e incubou-se por 30 minutos, temperatura ambiente. 9. Procedeu-se revelao com cromgeno diaminobenzidina (DAB,
Dako, cd. K3468) por trs minutos, temperatura ambiente, em cmara mida. 10. Realizou-se lavagem das lminas em gua destilada e a contra-
colorao com Hematoxilina de Harris, por 1 minuto. 11. Finalizou-se com lavagem em gua corrente, a desidratao em
lcoois crescentes, xilol e a montagem com Blsamo do Canad (Synth). Controles negativos para marcao de formas amastigotas de Leishmania foram realizados com PBS, em substituio ao anticorpo primrio.
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9.2 - Protocolo de Imunoistoqumica para determinao da densidade de clulas apoptticas em linfonodos de ces naturalmente infectados por Leishmania (L.) chagasi:
Para a determinao da apoptose em clulas linfides utilizou-se o anticorpo anti-caspase 3 clivada de origem humana e feita em coelho (Cell Signaling, cd. 9661), segundo o protocolo descrito por DE NARDI (2007), com os mesmos procedimentos descritos anteriormente. 1. 60C. As lminas foram inicialmente mantidas por 1 hora em estufa a desparafinadas e hidratadas em solues
Posteriormente foram
decrescentes de xilol e lcool. 2. Entre cada um dos passos descritos, os cortes de linfonodo foram
submetidos a banhos em gua destilada e soluo de tampo fosfato (PBS), pH 7,6. 3. O sistema de recuperao antignica foi feito pelo vapor (panela a
vapor Philips Walita), com soluo de citrato sdio 10 mM, pH 6,0, por 40 minutos. 4. Bloqueio da peroxidase endgena foi efetivado por incubao em
soluo de lcool metlico e perxido de hidrognio (30 volumes) a 3%, durante 10 minutos, temperatura ambiente e em cmara escura. 5. O bloqueio de protenas inespecficas foi realizado com Protein
Block (DAKO, cd. X0909) por 20 minutos, temperatura ambiente. 6. Porteriormente adicionou-se o anticorpo primrio anti-caspase 3
clivada (Cell Signaling, cd. 9661), na diluio 1:200. Em seguida as lminas foram incubadas por 18 horas em cmara mida a 40C. 7. Adio do anticorpo secundrio biotinalado (Kit LSAB
DakoCytomation, cd. K0690) e incubao por 30 minutos, temperatura ambiente, em cmara mida.
54
8.
Empregou-se o substrato Estreptavidina Biotina Peroxidase (Kit
LSAB DakoCytomation, cd. K0690) e incubou-se os cortes por 30 minutos temperatura ambiente. 9. Procedeu-se revelao com cromgeno diaminobenzidina (DAB,
Dako, cd. K3468) por trs minutos, temperatura ambiente, em cmara mida. 10. Realizou-se a lavagem das lminas em gua destilada e a contra-
colorao foi feita com Hematoxilina de Harris, por 1 minuto. 11. Finalizou-se com lavagem em gua corrente, seguida da
desidratao em lcoois crescentes, xilol e a montagem com Blsamo do Canad (Synth). Os controles negativos para marcao de clulas apoptticas foram realizados com soluo de PBS, em substituio ao anticorpo primrio. O controle positivo foi feito em linfonodos de ces hgidos de reas no endmicas para LVC.

Linfonodos de Cães

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CINCIAS AGRRIAS E VETERINRIAS CMPUS DE JABOTICABAL

APOPTOSE EM LINFONODOS DE CES COM LEISHMANIOSE VISCERAL.

Pamela Rodrigues Reina Moreira

JABOTICABAL SO PAULO - BRASIL 2010

APOPTOSE EM LINFONODOS DE CES COM LEISHMANIOSE VISCERAL.

Pamela Rodrigues Reina Moreira

Orientadora: Profa. Ass. Dra. Rosemeri de Oliveira Vasconcelos

JABOTICABAL SP Fevereiro - 2010

DADOS CURRICULARES DO AUTOR

Professora Rosemeri de Oliveira Vasconcelos,

APOPTOSE EM LINFONODOS DE CES COM LEISHMANIOSE VISCERAL.

Palavras-Chave: Apoptose, ces, Leishmania (Leishmania) chagasi, Leishmaniose Visceral, linfadenopatia

APOPTOSIS IN LYMPH NODES OF DOGS WITH VISCERAL LEISHMANIASIS.

Keywords: apoptosis, dogs, Leishmania (Leishmania) chagasi, visceral leishmaniasis, linphadenopathy

II. REVISO DE LITERATURA

2.1 Aspectos Gerais da Leishmaniose Visceral

2.2 Resposta imune do co

Esplenomegalia e hepatomegalia tambm so freqentes nestes ces (FEITOSA et al., 2000).

IV. MATERIAL E MTODOS

Animal da FCAV UNESP, Cmpus de Jaboticabal (Protocolo n. 000599-08).

4.2 - Anlise Histopatolgica

4.3 - Anlise Imunoistoqumica

4.4 - Anlise Estatstica

5.1- Anlise Anatomopatolgica

5.2 - Anlise Microscpica

Nmero de clulas apoptticas

8,58 4,99a 6,31 3,67ab

Nmero de clulas apoptticas

100% 80% 60% 40% 20% 0% A O S A O S A O S Linfcito Plasmcito Macrofgo

b 100% 80% 60% 40% 20% 0% A O

relao s clulas apoptticas, no houve diferenas estatsticas

Nas condies deste estudo foi possvel concluir que:

(Leishmania) chagasi. Veterinary Parasitology, Amsterdam, v.143, p.267-274, 2007.

Leishmaniasis. Journal Tropical Pediatrics, Oxford, v.53, n.4, p.284-286, 2007.

AMERICANO DE RICKETISIOSES, 1., 2004, Ouro Preto. Anais... CD-ROM.

Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2007.

Empregou-se o substrato Estreptavidina Biotina Peroxidase (Kit

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