Ctedra Microbiologa Agrcola

UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE ROS

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

Unidad Temtica 3

Crecimiento Bacteriano
Benintende, Silvia y Sanchez, Cecilia Introduccin En un sistema biolgico se define al crecimiento como el aumento ordenado de las estructuras y los constituyentes celulares de un organismo. Segn ello, el aumento de la masa celular producido por acumulacin de productos de reserva (glucgeno, polihidroxibutirato) no constituyen crecimiento. Se puede considerar como crecimiento al incremento de clulas individuales por un lado, y por otro lado se puede considerar al crecimiento del nmero de clulas (proliferacin de la poblacin). En lo que se refiere al crecimiento de clulas individuales, este consiste en el aumento del tamao y peso de las clulas que precede a la divisin celular. Esta divisin trae aparejada un aumento en el nmero de clulas (proliferacin de la poblacin). Las bacterias se dividen por fisin binaria, a travs de la una cual clula madre al alcanzar un determinado volumen se divide dando dos clulas hijas. El proceso de fisin binaria consiste en la autoduplicacin del material hereditario seguido de la reparticin en las dos clulas hijas, las que se separan por estrangulamiento de la membrana celular y formacin de la pared celular (Fig. 1).

Fig. 1. Divisin binaria de clulas procariotas. 1 El cromosoma circular est unido a un punto de la membrana plasmtica 2El cromosoma se duplica. Las dos copias estn fijas a la membrana en puntos cercanos 3 La clula se alarga, se agrega nueva membrana plasmtica entre los puntos de unin 4 La membrana plasmtica crece hacia el interior5 La clula original se ha dividido en
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dos clulas hijas. La imagen corresponde al corte transversal de una clula procariota durante la fisin binaria en una etapa similar a la fase 4 descripta.

Basado en el concepto que una clula se divide dando dos clulas hijas, y stas a su vez se vuelven a dividir dando dos clulas cada una de ellas, se presenta en el siguiente cuadro la proliferacin de una poblacin de clulas a partir de una sola, con un tiempo de generacin de 30 minutos.
Tiempo Nmero (horas) de clulas 0 1 0.5 2 91 4 1.5 8 2 16 2.5 32 3 64 3.5 128 4 256 4.5 512 5 1024 . . . . 10 1.048.576 Log.10 (nmero de clulas) 0 0.301 0.602 0.903 1.204 1.505 1.806 2.107 2.408 2.709 3.010 . . 6.021

Al graficar en un sistema de coordenadas el tiempo (abscisas) y el nmero de clulas (ordenadas) se obtiene una grfica como la que se muestra en el siguiente esquema:
2500 2000 N clulas 1500 1000 500 0 0 1 2 3 tiempo (hs) 4 5 6

Fig. 2. Velocidades de proliferacin en escala aritmtica.

Como se observa en la grfica la curva aumenta su pendiente. Frecuentemente es til transformar los datos de nmero de clulas a su logaritmo decimal ( graficar el nmero de clulas versus el tiempo transcurrido en una grfica semilogartmica). Se obtiene as una grfica en la que la relacin es lineal.

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10000

1000 N clulas 100

10 1 0 1 2 3 tiempo (hs) 4 5 6

Fig. 3. Velocidades de proliferacin en escala logartmica.

Se conoce como tiempo de duplicacin generacional al tiempo en que tarda una poblacin en duplicar su nmero. sta ltima grfica permite fcilmente encontrar el tiempo de duplicacin para la poblacin estudiada. Es frecuente que a partir de mediciones de crecimiento a intervalos conocidos y graficando estos datos se calcule el tiempo de duplicacin de una poblacin. Los tiempos de duplicacin varan segn el microorganismo del que se trate. Por ejemplo: Eschericha coli 0,35 hs Rhizobium meliloti 1,8 hs Nitrobacter sp aproximadamente 20 hs El estudio grfico del crecimiento es muy til, pero a veces es conveniente conocer la expresin matemtica que representa este crecimiento exponencial

Donde: : nmero de clulas o masa microbiana al tiempo t 0 :nmero de clulas o masa microbiana en el momento inicial (t0) :constante que da idea de la velocidad instantnea del crecimiento t-t0 :tiempo transcurrido entre la medicin inicial y la final Ciclo normal del crecimiento Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento exponencial prolongado. Si ello ocurriera en poco tiempo la tierra estara tapada de una masa microbiana mayor que la de la tierra misma. El crecimiento est normalmente limitado por el agotamiento de nutrientes o por la acumulacin de productos del mismo metabolismo microbiano, que les son txicos a la poblacin. La consecuencia es que el crecimiento al cabo de un cierto tiempo llega a disminuir hasta detenerse. En la figura 4 se presenta la grfica de una curva tpica de crecimiento bacteriana. Como se puede observar, en la grfica se ha relacionado el tiempo transcurrido con el logaritmo del nmero de clulas bacterianas. Cuando se realiza este tipo de grficas se obtiene una lnea recta, sin embargo en esta slo un sector (fase exponencial) corresponde a una recta.

= 0 . (t to).

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Es posible distinguir cuatro fases: 1) fase de latencia o de retardo 2) fase exponencial 3) fase estacionaria 4) fase de muerte En la fase de latencia existe un aparente reposo en el que las clulas sintetizan las enzimas necesarias para la actividad metablica que deben llevar adelante. Cuando se hacen mediciones del nmero de clulas en distintos tiempos dentro de esta fase, el valor no cambia sustancialmente. En cambio, interiormente las clulas trabajan activamente adaptando el equipo enzimtico al medio de cultivo. La bacteria se prepara para hacer uso de los nutrientes que este medio le aporta, por lo tanto es la fase de adaptacin al medio, con aumento de la masa celular pero no del nmero de clulas. La edad del inculo va a influir en el tiempo de latencia en el medio fresco debido a la acumulacin de materiales txicos y a la falta de nutrientes esenciales dentro de la clula durante el crecimiento anterior. En general, inculos viejos alargan la fase de latencia.

Fig. 4 Curva de proliferacin tpica de una poblacin bacteriana

Pasado este perodo, el cultivo entra en la denominada fase de crecimiento exponencial, donde la velocidad de crecimiento es mxima. La velocidad de crecimiento que alcanza un cultivo, depende del tipo de microorganismo que se trate y diversos factores ambientales como son la temperatura, el pH, oxigenacin, etc. La velocidad de crecimiento comenzar a disminuir hasta hacerse nula cuando alcance la fase estacionaria, ya que cambios en la composicin y concentracin de nutrientes entre el cultivo del inculo y el medio fresco pueden desencadenar el control y la regulacin de la actividad enzimtica. Esta fase se presenta por agotamiento del suministro de algn nutriente esencial o por acumulacin de productos metablicos que sean txicos. Tambin puede ser por la disminucin de la oxigenacin o cambios en las condiciones de pH del medio de cultivo (acidificacin o alcalinizacin): En esta fase se equilibran el nmero de clulas nuevas con el nmero de clulas que mueren. Por ltimo, el cultivo entra en la fase de muerte, en la que el nmero de clulas que mueren se va haciendo mayor.
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La pendiente de esta fase puede ser ms o menos pronunciada de acuerdo al tipo de microorganismo de que se trate. Suelen presentarse pendientes menos bruscas cuando el microorganismo presenta alguna forma de resistencia (esporas, glicocalix). Mtodos de medicin del crecimiento El crecimiento se evala haciendo mediciones sucesivas en tiempos determinados de la poblacin en estudio. En cada momento se evala cual es la poblacin en ese instante. Existen diversas formas de evaluar una poblacin bacteriana. a. Conteo microscpico directo Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa, ya que consiste en contar con un microscopio la cantidad de clulas presentes en un volumen determinado. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos ( cmara de Petroff Hauser, cmara de Neubaver Fig. 5-). Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados La muestra puede utilizarse tal cual, (leche, o cultivos puros en medio lquido), o puede prepararse una dilucin.

Fig. 5 Cmara de Neubaver

Para hacer el conteo se procede de la siguiente manera. Si se posee una cmara dividida en 25 cuadrados. El rea de los 25 cuadrados es conocida, como tambin el volumen de muestra que esta rea admite. Contando el nmero de bacterias presentes en los cuadrados (o algunos de ellos) se puede conocer cuanto hay en volumen conocido. Suponiendo 50 bacterias en 25 cuadrados, y sabiendo que los 25 cuadrados corresponden a 0,02 mm3. 50 bacterias _______ 0,02 mm3 x = _______ 1000 mm3 (1 cm3) x= 1000 mm3 * 50 bacterias 0,02 mm3 x = 2.500.000 bact./mL = 2,5.106 bact./mL

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Ventajas del mtodo Es rpido Los frotis se pueden guardar Las exigencias de equipo son mnimas Se pueden observar las diferentes morfologas de los microorganismos. Es empleado para recuento de poblaciones microbianas de suelo

Desventajas del mtodo La cantidad de muestra analizada es poca Provoca cansancio del operador Slo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000 por mL. Es difcil distinguir los microorganismos de las partculas de muestra Una inadecuada distribucin de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores Es difcil diferenciar los microorganismos viables de los no viables

b. Conteo de clulas viables El mtodo se basa en la consideracin que el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias. Este mtodo puede hacerse con medios slidos o lquidos. El mtodo ms frecuentemente empleado es el conteo en placas (medios slidos) formando colonias. Por lo tanto se determinan por este mtodo slo las clulas microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura). Para ello se siembra una cantidad conocida de la suspensin bacteriana cuyo nmero se desea conocer. En un medio slido cada bacteria se multiplicar formando una colonia visible a simple vista que puede ser contada. Como las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.), y esto puede constituir una desventaja ya que si dos bacterias no se separan darn una sola colonia, subestimando de esta forma el nmero de microorganismos en la suspensin. Adems, a los efectos de que todas las clulas que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del mtodo sean menores, se establece que las condiciones ptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias. Algunas bacterias son difciles de contar en medios slidos (Nitritadores) y se requiere de conteos en medios lquidos. Para ello se recurre a la tcnica de determinacin del nmero ms probable (NMP) de microorganismos. Se basa en la determinacin de la presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo (en funcin de que crezcan o de que produzcan determinada reaccin en el medio o no), en diferentes cantidades de muestra. Para poder determinar el NMP de microorganismo se debe diluir hasta tener una densidad que sea menor a 1 clula por cada mililitro de diluyente. Por ejemplo, para hacer diluciones hasta obtener 3 clulas en 5 ml se siembra 1 ml en cada uno de 5 tubos con medio lquido adecuado, esperando que en 3 tubos haya crecimiento de microorganismos y en 2 no ( si las clulas no se distribuyen 1 en cada ml se pueden obtener otros resultados: 2 positivos y 3 negativos, o 1 positivo y 4 negativos). Los resultados posibles son al azar. La interpretacin de los resultados, se hace en base a una distribucin estadstica, y en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos, teniendo en cuenta la dilucin en la se observa proliferacin de microorganismos.
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Este mtodo se emplea recuentos microbianos de Nitratadores por la dificultad que presentan para ser visualizadas las colonias en medios slidos. Tambin es til para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. Se prefiere adems este mtodo cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.). c. Medicin de la densidad bacteriana Es una tcnica en la que se mide la masa de microorganismos en una suspensin. Para ello se utiliza un espectrofotmetro y se mide la cantidad de luz que atraviesa en una suspensin de microorganismos, en comparacin con un blanco que es el medio esterilizado y sin sembrar. Cuanto mayor es el nmero de clulas en suspensin, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio. Para relacionar la transmitancia con al densidad bacteriana se requiere de hacer curvas patrn de densidad conocidas. A= k x W A: Absorbancia k: constante W: masa celular

d. Otros mtodos de recuento Determinacin de ATP: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Se considera que la proporcin de ATP encontrado en una muestra es proporcional con la presencia de clulas vivas Recuento electrnico: Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan de electrodos que miden la resistencia elctrica del sistema. Un volumen fijo de una suspensin bacteriana es forzado a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto. Cuando pasa un microorganismo, la resistencia al pasaje de una corriente elctrica se incrementa debido a que la conductividad de la clula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. No pueden medirse soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de ms de una clula en un breve perodo de tiempo va a ser tomado como una clula ms grande, y es comn la obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes.

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Bibliografa Brock, T. & M. Madigan. 1993. MICROBIOLOGA. 6ta Edicin. Prentice Hall Hispanoamrica S. A. Mxico. Ranea, F. 2002. http://www.microbiologia.com.ar/fisiologia/crecimiento.html