UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTBAL DE HUAMANGA FACULTAD DE INGENIERA QUMICA Y METALURGIA ESCUELA DE FORMACIN PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

COMP. PROD. AGROINDUSTRIALES (TA 341) INFORME DE PRCTICA DE LABORATORIO N 04 y 05 Propiedades de las Protenas y Actividad Enzimtica en Productos Agroindustriales DOCENTE ESTUDIANTE : :

AYACUCHO PER 2012

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PRCTICA N 04

PROPIEDADES DE LAS PROTENAS I. OBJETIVOS

1.1. Determinar las propiedades de las protenas: punto isoelctrico y desnaturalizacin. 1.2. Identificar y observar una protena desnaturalizada.

II.

FUNDAMENTO TERICO

Si en una disolucin de protenas se producen cambios de pH, alteraciones en la concentracin, agitacin molecular o variaciones bruscas de temperatura, la solubilidad de las protenas puede verse reducida hasta el punto de producirse su precipitacin. Esto se debe a que los enlaces que mantienen la conformacin globular se rompen y la protena adopta la conformacin filamentosa. De este modo, la capa de molculas de agua no recubre completamente a las molculas proteicas, las cuales tienden a unirse entre s dando lugar a grandes partculas que precipitan. Adems, sus propiedades biocatalizadores desaparecen al alterarse el centro activo. Las protenas que se hallan en ese estado no pueden llevar a cabo la actividad para la que fueron diseadas, en resumen, no son funcionales.

Esta variacin de la conformacin se denomina desnaturalizacin. La desnaturalizacin no afecta a los enlaces peptdicos: al volver a las condiciones normales, puede darse el caso de que la protena recupere la conformacin primitiva, lo que se denomina renaturalizacin.

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III. 3.1

MATERIALES Y MTODOS MATERIALES - Tubos de ensayo - Bao mara - Pipetas - Vasos de precipitado - Albmina al 1% - Cloruro de sodio 1% REACTIVOS - Acido Actico - Hidrxido de sodio - Acetato de sodio - Sulfato de cobre II 0,5% - pH Metro - 6 Huevos

3.2 METODOLOGA EXPERIMENTAL

3.2.1 DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO

Preparar soluciones de pH distinto mezclando cido actico y acetato de sodio en las siguientes proporciones:

pH 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 5,2 5,4 5,6

CH3COONa 0,1 M (mL) 0,4 0,6 0,9 1,3 1,95 2,45 3,0 3,5 3,95 4,1 4,5

CH3COOH 0,1 M (mL) 4,6 4,4 4,1 3,7 3,05 2,55 2,0 1,5 1,05 0,9 0,5

Agitar bien cada tubo y agregar 1 mL de solucin de albmina de huevo. Observar y establecer el Punto Isoelctrico.

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3.2.2 DESNATURALIZACIN DE LA ALBMINA

Colocar 10 g de albmina en dos tubos de ensayo. Al primer tubo agregarle 5 mL de NaCl al 1%. Agitar. Llevar los dos tubos a calentamiento en agua hirviente. Cuando el segundo tubo est caliente, agregar 5 mL de NaCl al 1%. Agitar. Continuar calentando por 10 minutos. Extraer del agua caliente y enfriar. Efectuar el examen de Biuret a las dos muestras. Comparar los resultados.

3.2.3 IDENTIFICACIN DE PROTENAS O REACCIN DE BIURET

A 2 mL de solucin de albmina al 10% (clara de huevo) se le aade 2 mL de NaOH al 10%, luego se le adiciona unas gotas de solucin de CuSO4 (sulfato cprico), si observamos que se forma un complejo de color azul intenso nos indica que hay una reaccin positiva ( es decir hay presencia de protenas).

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IV.

RESULTADOS Y DISCUSIN

4. 1. DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO Cuando una protena se acerca demasiado a su punto isoelctrico, esta tiende a desnaturalizarse y pierde solubilidad lo cual hace que se formen precipitados, pudimos observar esta reaccin en las soluciones de clara de huevo con el pH ms cido:

N 01

pH 3,6

Resultado

N 06

pH 4,6

Resultado

02

3,8

07

4,8

03

4,0

08

5,0

04

4,2

09

5,2

05

4,4

10

5,4

El tubo con mayor cantidad de precipitados fue el nmero 02 de pH 3.8 por lo que decimos que a este pH decimos que se encuentra el punto isoelctrico.

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4.2. DESNATURALIZACIN DE LA ALBMINA

La muestra calentada no resulto positivo y la albumina sin calentar se form el complejo azul.

4.3. IDENTIFICACIN DE PROTENAS O REACCIN DE BIURET A 2 mL de solucin de albmina al 10% (clara de huevo) se le ha adido 2 mL de NaOH al 10%, luego unas gotas de solucin de CuSO4 (sulfato cprico) Se observa el color violeta ndico positivo en la muestra, por lo que concluimos que contiene protenas.

V.

CONCLUSIONES

Gracias a su reaccin tan clara de la precipitacin de la albumina en su punto isoelctrico, determinarlo es fcil, sin embargo no podemos tener una precisin suficiente, pues dependemos de la reaccin que se aprecia solo visiblemente. Por otro lado la identificacin de las protenas se hace con reacciones igualmente apreciables por un gran cambio de color. En la desnaturalizacin de las protenas, estas pierden muchas propiedades, entre ellas las que las hacen susceptibles al cambio de color en la prueba de biuret.

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VI.

CUESTIONARIO

6.1. Qu utilidad tienen la determinacin del Punto Isoelctrico, desde el punto de vista de la aplicacin tecnolgica o nutricional de las protenas?

La cualidad anfotrica de las protenas permite su disociacin y determina, junto a otros factores, su solubilidad. La carga neta de la protena vara con las condiciones del medio (pH) en que se encuentra. As pueden comportarse como aniones o cationes (cidos o bases), o precipitar cuando la carga neta es cero. La primera cualidad permite que las protenas tengan una cierta capacidad tamponadora o amortiguadora. Por otro lado, La precipitacin se produce a un pH determinado (punto isoelctrico para cada tipo de protena y es de crucial importancia en la industria alimentaria, tanto para evitar que precipiten protenas como para conseguirlo. El punto isoelctrico es caracterstico de cada protena y esto permite lograr la precipitacin selectiva de protenas de un medio. No obstante, la solubilidad (le las protenas no depende exclusivamente del pH, del medio, sino que influyen tambin tanto el nmero de grupos polares y apolares corno su distribucin. As, es posible que una protena con un escaso nmero de interacciones hidrofobias no precipite en su punto isoelctrico debido a la hidratacin y a la repulsin estrica.

Investigue cules son los puntos isoelctricos de las siguientes protenas: casena, albmina, globulina (glicinina en soja)

Sustancia Caseina Albmina Globulina G1 (lisozima) Globulina G2 Globulina G3 4.6 4.7

Punto Isoelctrico

10.7 5.5 5.8

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VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Vctor Manuel Rodrguez Rivera, Edurne Simn Magro, Bases de la Alimentacin Humana. Espaa. Editorial Netbiblo, 2da Edicin, S.L. p. 193. Angel Gil Hernndez, Tratado de Nutricin: Composicin y Calidad Nutritiva de los Alimentos, Espaa, Editorial Medica Panamericana, 2da Edicin, Tomo II. pginas 80 y 6, Antonio Pea Daz Antonio Pea, Bioqumica, Mxico 2004, Editorial Limusa p. 96.

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PRCTICA N 05

ACTIVIDAD ENZIMTICA EN PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES

I. 1.1

OBJETIVOS Observar y medir la actividad enzimtica de enzimas presentes en la levadura durante el proceso de fermentacin en diferentes harinas de origen vegetal.

1.2

Observar la inactividad de enzimas presentes en algunos productos por accin del calor, de antioxidantes y del pH.

II.

FUNDAMENTO TERICO

Las enzimas, funcionan como catalizadores naturales en las reacciones bioqumicas. Ellas no cambian o se utilizan durante su reaccin. Por ejemplo, durante la fermentacin, las enzimas que se elaboran a partir de clulas de levadura, convierten las molculas de azcar en molculas de etanol, pero las molculas de levadura no disminuyen durante el proceso. Por esta razn, pequeas cantidades de enzimas comerciales dan grandes resultados y al comparar con otros mtodos de procesamiento, son mucho ms econmicos. Las enzimas (una gran parte), se derivan de organismos fngicos y bacterianos. Algunos productos se elaboran a partir de plantas como la papaya, la pia, etc. a partir de productos que se generan de tejidos de animales, como por ejemplo la lipasa pancretica. Las enzimas son muy especficas en el trabajo que realizan. Por ejemplo, las enzimas de amilasa, solo trabajan en almidn, las enzimas de proteasa lo hacen con protenas, etc., esto permite que las enzimas contengan caractersticas que son de gran beneficio en procesamientos industriales.

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III.

MATERIALES Y METODOS

3.1 MATERIALES

Prueba de probeta Probeta graduada de 100 ml Bao mara Harinas de origen vegetal: trigo, camote, quinua, etc.

Inactivacin de enzimas presentes en la papa y manzana Cocinas Vasos de precipitacin cido ctrico Bisulfito de sodio Solucin de guayacol 0,05% Solucin de perxido de hidrgeno 0,05% Muestras vegetales: papas, manzanas, limones y frutas diversas.

3.2 METODOLOGA

3.2.1 PRUEBA DE LA PROBETA

Pesar 1 g de levadura y disolver en 30 ml. de agua potable en un vaso de 250 ml. aadir seguidamente una mezcla de 9 g de harina de trigo y 1 g de harina de otro origen.

Mezclar rigurosamente con la ayuda de un agitador. En seguida transferir a una probeta graduada de 100 ml., observar el volumen inicial y llevar a incubar a un Bao Mara a 26,5C. Anotar el volumen de la suspensin a intervalos de 5 minutos, comparando as la rapidez y accin de las levaduras. Conjuntamente llevar un control conteniendo harina de trigo.

Registrar estos resultados y obtener la rapidez de las levaduras expresadas en el tiempo necesario para alcanzar el "mximo". As una levadura de accin

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enzimtica mediana necesitar 90 minutos dando un N90, mientras que una levadura rpida necesitar solo 75 minutos a la cual le corresponder el N75; esta variacin en el tiempo tambin depende del tipo de harina o mezcla de ellas.

3.2.2

INACTIVACIN

DE

ENZIMAS

PRESENTES

EN

ALGUNOS

PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES

3.2.2.1 EFECTO DEL TIEMPO DE CALENTAMIENTO

Pelar una muestra de papa y/o otras muestras asignadas por el profesor, cortar en rodajas de 2 cm. de espesor, colocar en un recipiente con agua hirviente por el perodo de 1, 2, 4, 6, 8, 10 y 12 minutos; dejar una rodaja de testigo y realizar la prueba de guayacol en c/u de las rodajas es decir aadirle 1 ml de guayacol al 0,05% y 1 ml de perxido de hidrgeno al 0,05% de tal forma de cubrir la superficie de la rodaja con las dos soluciones.

Observar que sucede despus de 3 minutos

Determinar el tiempo necesario para la inactivacin de enzimas presentes en las papas.

3.2.2.2. EFECTO DE LOS ANTIOXIDANTES

EFECTO DEL CIDO CITRICO

a) Tomar 10 g de pulpa de manzana en 3 tubos de ensayo. b) Aadir 1 mL de cido ctrico al 1%, 2,5% y 5% respectivamente a los tubos c) Mezclar bien y comparar con un cuarto tubo que contiene 10 g de pulpa y 1 mL de agua, luego de 30 minutos de reposo.

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3.2.2.3.

EFECTO DEL PH Cortar cubitos de manzana de 1 cm. de arista aproximadamente. Baar los cubitos con cada una de las soluciones siguientes: cido ctrico 0,5%, HCl 2M, zumo de limn y agua destilada Verificar el pH de las soluciones

Dejar en reposo los cubitos por 30 minutos y comparar los resultados

IV.

RESULTADOS Y DISCUSIN

4.1. PRUEBA DE LA PROBETA

Determinar el tiempo necesario para encontrar el mximo desarrollo de la fermentacin por accin de enzimas de la harina y levadura.
Tiempo 0 5 10 15 20 25 Volumen 36 38 46 60 85
Volumen (mL) 90 85 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 5 10 15 20 25 Tiempo (min) 36 38 46 60 73 Volumen

73

El mximo volumen alcanzado a los 25 min. Fue de 85 mL. Probablemente el tiempo optimo este muy cerca, pues ha alcanzado ms del doble de su volumen.

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4.2.

INACTIVACIN

DE

ENZIMAS

PRESENTES

EN

ALGUNOS

PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES

4.2.1. EFECTO DEL TIEMPO DE CALENTAMIENTO

A partir de la muestra 6, la que se hirvi por 8 minutos, vemos que las enzimas ya no dan un resultado positivo al anlisis con el guayacol, por lo que decimos que el tiempo ptimo es de 8 minutos.

4.2.1. EFECTO DE LOS ANTIOXIDANTES

EFECTO DEL CIDO CITRICO

El primer tubo de la izquierda contiene la muestra de manzana solo con agua, y se puede apreciar claramente que el de la derecha no ha sufrido oxidacin, por lo que el pH ms cido evita que las enzimas se degraden produciendo este color anaranjado.

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4.2.2. EFECTO DEL PH En el tubo con cido ctrico se observa una ligera oxidacin; con el HCl, la oxidacin es mucho menor, lo mismo con el zumo de limn, pese a ser menos cido que la solucin con HCl, ha protegido ms a los trozos de manzana, y finalmente el agua

destilada, que posee un pH neutro, ha protegido en algo la oxidacin gracias a que asla a los trozos de manzana del oxgeno del aire, mas no del que contiene en s.

V.

CONCLUSIONES

La velocidad con la que la levadura produce CO2 es muy rpida, por lo que se le ha aprovechado durante tantos aos con tan buenos resultados. Adems de no contener enzimas u otras sustancias que puedan ser nocivas para el consumo humano. La accin de calor se ha podido observar en la prueba de guayacol, en la cual determinamos para la muestra el tiempo mnimo necesario para la inactivacin de las enzimas de la papa, pues, estas pasado cierto tiempo expuesto a la temperatura de ebullicin del agua, ya no pueden mantener su capacidad cataltica. En este ensayo, hemos desnaturalizado al punto de destruir a algunas enzimas que se identifican con el guayacol, por lo que ya pueden reactivarse. El pH al ser un factor de actividad enzimtica varia la velocidad y capacidad de estas de cumplir con su actividad por lo que variando ligeramente el pH podemos modificar la velocidad y prolongar la vida til de algunos alimentos.

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VI. 6.1

CUESTIONARIO Cul es el complejo enzimtico que participa en el proceso fermentativo del pan?

Enzima o Complejo Enzimtico

Evento Bioqumico

Descripcin Desdobla la sacarosa que

Invertasa

Inversin de la sacarosa

se agreg a la harina en glucosa y fructosa. Hidrolizan el almidn en

-amilasa y amilasa.

La conversin de almidn polisacridos en dextrinas y maltosa. pequeos, como

ms las

dextrinas y la maltosa. Maltasa La conversin de la Hidroliza la maltosa en dos unidades de glucosa. Convertir la glucosa y la fructosa Zimasa La utilizacin de producidas a

maltosa en glucosa.

la partir de la inversin de la sacarosa agregada y de la hidrlisis del almidn - en etanol y dixido de carbono.

glucosa y la fructosa.

La Proteasas

modificacin

de

la

Gracias a esto, se pueden formar las complejas redes de gluten capaces de

estructura de las protenas del gluten.

retener el gas producido.

6.2

Cules son las enzimas presentes en todos los vegetales?

Las peroxidasas constituyen un ubicuo grupo de enzimas, presentes en todos los vegetales superiores que han sido investigados y en los leucocitos. Suelen contener un grupo prosttico hemo (ferriprotoporfirina), no obstante, tambin pueden utilizar otros grupos.

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6.3

Explique que se entiende por inactivacin de enzimas.

Las

enzimas

se

pueden

inactivar

(desnaturalizar)

principalmente

por

envenenamiento, contaminacin microbial, sedimentacin y desnaturalizacin qumica. Se utiliza este proceso para evitar que determinadas enzimas cumplan distintas funciones perjudiciales para un determinado proceso, o por que han cumplido con su trabajo y deben de separarse o incluso conservarse.

6.4

Investigue

cul

es el

mecanismo general

del

pardeamiento

enzimtico, indique las reacciones qumicas.

Se denomina pardeamiento enzimtico la transformacin, enzimtica en sus primeras etapas de compuestos fenlicos en polmeros coloreados, frecuentemente pardos o negros. Las fases de su transformacin son los siguientes:

VI.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Alicia Hernandez, Et al, Microbiologa Industrial, Editorial EUNED, pp. 183-184. Gonzalo Sergio Opazo Quesney, Caracterizacin Histolgica y

Bioqumica de desrdenes fisiolgicos en Paltas (persea americana mill.) cv. hass en Almacenaje Refrigerado, en dos Estados de Madurez. Universidad Catlica de Valparaso Facultad de Agronoma - Taller de Licenciatura, QUILLOTA, CHILE 2000, pgina 18. Cheftel, 2000. Introduccin a la bioqumica y tecnologa de los alimentos. Vol 1. Editorial Acribia. Pginas 309-316

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