1

Exerccios sobre sntese de protenas

1. Em procariotos, quantas ligaes fosfato de "alta energia" sero gastas na insero de um aminocido na cadeia polipeptdica, comeando com o aminocido livre? Duas para a ativao do aminocido por converso em aminoacil-tRNA s expensas de ATP AMP + 2Pi e mais duas para a ligao e translocao do aminoacil-tRNA no ribossomo, ambas s expensas de GTP GDP + Pi. O total portanto, quatro. 2. A sequncia de nucleotdeos em torno do stio de iniciao na mensagem para a sntese da protena de revestimento do fago de RNA R17 5'...G A A G C A U G G C U U C U A A C U U U ... 3' (a) Qual cdon especifica o primeiro aminocido da protena? (b) Por qu a sequncia de trs nucleotdeos UAA localizados mais direita no causa a terminao da cadeia de protena? (a) A leitura comea na extremidade 5'. O primeiro cdon a ser lido para qualquer protena ser AUG, que especifica o aminocido iniciador formilmetionina. (b) Aps a iniciao, a sequncia de cdons a ser lida ser: AUG GCU UCU AAC UUU A sequncia UAA no ser lida como um cdon. Diz-se que ela est fora de fase (out of phase) com o molde de leitura (reading frame). 3. Qual o peso molecular de mRNA que codifica uma protena de peso molecular igual a 75000? Considere 120 o peso molecular mdio dos aminocidos e 320 o peso molecular mdio dos nucleotdeos. Uma protena de peso molecular 75000 contm 75000/120 = 625 aminocidos necessrio um mRNA contendo 3 625 = 1875 nucleotdeos para codificar uma protena (talvez um pouco mais de nucleotdeos para poder codificar as regies de "incio" e "fim"). Portanto, o peso molecular do mRNA , aproximadamente 1875 320 = 6 105

2 Em geral, a razo PMRNA /PMprotena situa-se entre 8 e 10, dependendo da composio em aminocidos. 4. O DNA (cromossomo) da E. coli tem um peso molecular de 2,2 109, o que corresponde a 3,56 106 pares de nucleotdeos. Se 75% do cromossomo da E. coli codificam protenas especficas, quantas protenas diferentes, de peso molecular mdio de 60000 podem ser formadas? 75% de 3,56 106 nucleotdeos codificadores correspondem 0,75 3,56 106 = 2,67 106 Isto, por sua vez, corresponde a 2,67 106/3 = 890000 cdons Uma protena com peso molecular de 60000 contm aproximadamente 500 aminocidos; portanto, aproximadamente 890000/500 = 1780 protenas diferentes podem ser formadas 5. A eficincia (quer dizer a velocidade) da iniciao da sntese de protenas em procariotos pode variar em mais de 100 vezes para diferentes mRNAs. De que maneira a sequncia Shine-Dalgarno poderia ser, em parte pelo menos, responsvel por estas diferenas? A sequncia de Shine-Dalgarno uma regio rica em purinas prxima extremidade 5' do mRNA dos procariotos. Ela pareia com uma sequncia rica em pirimidinas prxima extremidade 3' do rRNA ribossomal 16S. O parea mento das bases entre a sequncia Shine-Dalgarno e o rRNA 16S importante para o incio da traduo. A sequncia de Shine-Dalgarno apresenta muitas variaes, mas a sequncia complementar no rRNA ribossomal 16S praticamente constante. Assim, diferentes mRNAs variam muito na sua afinidade pela subunidade 30S. Aqueles com maior afinidade so traduzidos mais rapidamente. 6. Qual seria o motivo pelo qual a sntese de protenas em procariotos , em mdia, 10 vezes mais rpida do que a sntese de protenas em eucariotos? A causa mais provvel que os ribossomos de eucariotos so maiores, mais complexos e, portanto, mais lentos do que ribossomos de procariotos. Alm disto, iniciao da traduo em eucariotos requer muito mais fatores de iniciao do que em procariotos. De um modo geral, deve-se dizer tambm que clulas de eucariotos no esto geralmente sob presso para multiplicarse rapidamente, o contrrio do que ocorre com procariotos.

3 7. Encontre uma explicao para o motivo pelo qual ribossomos de procariotos podem traduzir uma molcula de mRNA circular, ao passo que ribossomos de eucariotos normalmente no podem, mesmo na presena de todos os fatores necessrios. Os ribossomos procariotos podem selecionar um cdon de iniciao localizado em qualquer lugar na molcula de mRNA sempre que este se localizar logo aps a sequncia de Shine-Dalgarno. Os ribossomos de eucariotos normalmente selecionam o AUG mais prximo da extremidade 5' do mRNA. Portanto, os ribossomos de eucariotos no podem reconhecer um stio de incio de traduo num mRNA circular. 8. Explique a importncia que poderia ter o fato de que peptdeos como fMetLeu-Phe so capazes de ativar as funes de fagocitose de leuccitos de mamferos. Somente polipeptdeos bacterianos recm sintetizados possuem fMet na extremidade N-terminal. Consequentemente, a presena de fMet em sistemas de mamferos significa a presena de bactria invasora. Os leuccitos que reconhecem resduos de fMet podero combater estas bactrias por fagocitose. 9. Uma preparao de t-RNA foi incubada com ATP, Mg 2+, uma preparao dialisada de aminoacil transferases, alanina no marcada e L-[14C]alanina em quantidades trao. Amostras, contendo 10 g de t-RNA, foram retiradas a diversos tempos, tratadas com cido tricloroactico a 5%, filtradas atravs de filtro de membrana e lavadas com cido tricloroactico a 5%. A quantidade de alanina em cada filtro foi medida com base na radioatividade incorporada, tendo-se obtido os seguintes resultados: Tempo de retirada das amostras (minutos) Quantidade de alanina (pmol = 1012 mol) 0 1,10 5 18,3 10 142,7 20 144,9 30 140,4

Descreva brevemente o que est ocorrendo no sistema de incubao e nos procedimentos subsequentes. O peso molecular do t-RNA 25.000. Qual percentagem do t-RNA total L-alanil t-RNA? O sistema de reao permite a ligao de L -alanina ao RNA mensageiro especfico para este aminocido. Todos os componentes necessrios esto presentes. Graficamente temos o seguinte:

4 Alanina incorporada (pmol/10 g de RNA) 150

75

0 0 5 10 15 20 25 30 Tempo (minutos)

Aos dez minutos a incorporao j mxima e no muda mais em termos significativos. Portanto, pode-se concluir que todo o L-alanil-tRNA j reagiu. Podemos tirar a mdia dos trs ltimos valores e subtrair o valor basal (incorporao inespecifica). Isto dar:
Mdia = (142,7 1,1) + (144,9 1,1) + (140,4 1,1) 141,6 + 143,8 + 139,3 = = 1 41,56 pmol/10 g RNA 3 3

Se foram incorporados 141,56 pmol de L-alanina porque no meio de incubao existe uma quantidade equivalente de L-alanil-tRNA. O peso molecular deste L-alanil-tRNA igual a 25000. Portanto, se 1 pmol pesa 25000 pg, 141,56 pmol iro pesar: 141,56 25000 = 3,539 106 pg 3,539 g H portanto 3,539 g de L-alanil-tRNA na amostra. A quantidade total de tRNA presente de 10 g. Assim, 3,539/10 100 = 35,39% so L-alanil-tRNA 10. Polirribonucleotdeos de sequncia randmica podem ser construdos pela ao da enzima polinucleotdeo fosforilase a partir de misturas de ribonucleotdeos difosf ato:
polinucleotdeo fosforilase

nUDP + mCDP

poli UC + (n + m)Pi

Quando usado como mRNA num sistema de sntese de protenas, uma sequncia randmica de polirribonucleotdeos deste tipo ir dirigir a

5 incorporao de aminocidos de acordo com a razo molecular dos seus constituintes nucleotdeos. (a) Quais aminocidos sero incorporados sob a direo de um copolmero de U e C no qual a razo molar U:C igual a 4:1? (b) Quais sero as velocidades relativas de incorporao, assumindo que o mRNA fator limitante? (a) Os cdons possveis no copolmero em questo sero UUU Phe (fenilalanina) UUC Phe UCU Ser (serina) CUU Leu (leucina) UCC Ser CUC Leu CCU Pro (prolina) CCC Pro Portanto, sero incorporados 4 aminocidos. (b) Quanto maior a velocidade de incorporao, maior ser proporo com que cada aminocido entra no polipeptdeo. Para prever as velocidades relativas de incorporao ser necessrio calcular primeiro as frequncias de cada cdon. A razo molar U:C 4:1; a frequncia de U portanto 0,8 e a de C 0,2 Portanto, as frequncias dos cdons U3, U2C, UC2 e C3 sero cdon U3: UUU(Phe) = (0.8)(0.8)(0.8) = 0.51 cdons U2C: UUC(Phe) = (0.8)(0.8)(0.2) = 0.13 UCU(Ser) = (0.8)(0.2)(0.8) = 0.13 CUU(Leu) = (0.2)(0.8)(0.8) = 0.13 cdons UC2: UCC(Ser) = (0.8)(0.2)(0.2) = 0.032 CUC(Leu) = (0.8)(0.2)(0.2) = 0.032 CCU(Pro) = (0.2)(0.2)(0.8) = 0.032 cdon C3: CCC(Pro) = (0.2)(0.2)(0.2) = 0.008 As velocidades relativas de incorporao de cada aminocido sero iguais soma das frequncias dos cdons de cada aminocido: Phe = 0.51 + 0.13 = 0.64 Ser = 0.13 + 0.03 = 0.16 Leu = 0.13 + 0.03 = 0.16 Pro = 0.032 + 0.008 = 0.04 Portanto, a razo de incorporao ser de 16Phe : 4Ser : 4Leu : 1 Pro.

11. Os genes codificando 10 enzimas necessrias para a sntese de His constituem um nico transcrito em E. coli. Eles esto amontoados num nico genoma na sequncia mostrada abaixo, na qual cada nmero representa um gene: A B

10

Transcrio Os nmeros indicam a sequncia das enzimas na via biossinttica, a enzima (1) catalisando a primeira reao, e assim por diante. Suponha agora que voc isolou um mutante que de alguma maneira sofreu uma inverso perfeita de dois genes por quebra e rejuno nos pontos mostrados pelas setas A e B, de tal maneira que a sequncia inteira de nucleotdeos dos genes 9 e 7 foi invertida e os genes 5 e 8 foram preservados:

10

Transcrio Questes: (a) Este mutante ser His+ (fentipo normal) ou His (necessitando His exgena para o crescimento)? (b) Explique como a inverso pode afetar (b1) a transcrio do genes 5, 4, etc. (b2) a traduo das mensagens dos genes 5, 4, etc. (a) Se o segmento do DNA correspondente aos genes 9 e 7 for invertido e reinserido conforme foi descrito, a fita anti-senso deste segmento ter que ser conectada fita senso dos genes 8 e 5 para preservar a polaridade, conforme mostrado abaixo: A 8 9 7 B 5 antisenso 8 7 9 5

senso

7 Como no h nenhum novo promotor presente, todo o conjunto vai continuar sendo transcrito, da esquerda para a direita, num nico mRNA, no qual o segmento correspondente aos genes 7 e 9 no ter a mensagem normal, mas sim o SEU COMPLEMENTO EM ORDEM INVERTIDA. Consequentemente, as enzimas codificadas pelos genes 7 e 9 no sero produzidas e o mutante dever ser His. (b1) A fita anti-senso invertida da regio 9 + 7, que no normalmente transcrita, pode conter fortuitamente uma sequncia que sinaliza terminao da sntese de mRNA. Se for assim, o gene 5 no ser transcrito. (b2) A mensagem reversa complementar transcrita do segmento 9 + 7 muito provavelmente conter, fortuitamente, um ou mais cdons de terminao, UAG, UAA ou UGA. A terminao prematura das cadeias ter o efeito de diminuir a probabilidade de que os ribossomos possam atingir, por exemplo, o stio de iniciao da sntese da protena correspondente ao gen 5, e de todas as outras protenas. Isto ir reduzir tambm a produo das protenas dos genes 4, 6, 3 e 2. 12. Os estudos clssicos de Christian Anfinsen e colaboradores sobre o dobramento de ribonuclease desnaturada e reduzida (SS 2SH) provaram que a sequncia de aminocidos por si s capaz de determinar a estrutura tridimensional da protena. No entanto, no transcurso dos trabalhos, descobriu-se uma enzima do fgado de camundongos (MLE) capaz de acelerar enormente a velocidade de redobramento da ribonuclease. Posteriormente foi mostrado que a MLE capaz de catalisar a renaturao de outras protenas, fazendo isto atravs da catlise no especfica de reaes de troca de dissulfetos: S1 S2 S3 S4 S1 S2 S3 S4

Estas trocas tem que ocorrer para que as pontes de dissulfeto incorretas formadas inicialmente possam rearranjar para formar as pontes corretas medida que a conformao da protena atinge o equilbrio termodinmico. Suponha que voc descobriu que 20 enzimas de mamferos, selecionadas ao acaso, todas com pelo menos 4 pontes de dissulfeto nas suas estruturas, podem ser classificadas em dois grupos distintos quando incubadas com MLE: (1) 17 enzimas (Grupo 1) no so afetadas, ao menos aparentemente; (2) 3 enzimas (Grupo 2) perdem sua atividade enzimtica, tanto mais rapidamente quanto maior for a concentrao de MLE no meio de incubao. Pergunta-se:

8 (a) O que voc pensa sobre a explicao geral mais provvel para este resultado? (b) Qual ser a diferena na sntese das enzimas do Grupo 2 e do Grupo 1? (c) Voc esperaria que as enzimas do Grupo 2 so de um modo geral menos estveis do que aquelas do Grupo 1 mesmo na ausncia de MLE? (d) Cite duas protenas de mamferos que voc poderia esperar exibirem um comportamento similar s enzimas do Grupo 2 com MLE. (e) Voc pode divisar alguma vantagem das enzimas do Grupo 2 para o organismo? (a) As enzimas do Grupo 2 parecem ser termodinamicamente instveis requerendo pontes de dissulfeto para manter suas configuraes nativas, enquanto que as do Grupo 1 so estruturas estveis nas quais as pontes de dissulfeto conferem estabilidade extra. (b)Todas as protenas atingem sua estrutrura tridimensional por dobramento at um estado de energia livre mnima. Nenhum mecanismo direto conhecido o qual possibilite o dobramento da cadeia polipeptda numa estrutura que seja termodinamicamente instvel com fixao atravs de pontes de dissulfeto. No entanto, possvel criar estruturas deste tipo por clivagem de ligaes peptdicas aps o dobramento e ligao cruzada de dissulfeto de um precursor estvel. Consequentemente, pode-se esperar que as enzimas do Grupo 2 tenham sido modificadas aps a traduo. (c) Protenas do Grupo 2 podero ser mais instveis na presena de uma substncia que tenha grupos sulfidrila devido a possveis reaes de troca, mesmo que lentas. Fora disto elas devero ser to estveis quanto as protenas do Grupo 1. No entanto, sua estabilidade cintica e no termodinmica, na dependncia da alta energia de ativao das reaes de troca de dissulfetos na ausncia de catalisadores. (d) Dois exemplos bem conhecidos so a insulina e a quimotripsina. Toda protena produzida por quebra proteoltica de uma estrutura precursora pode ser enquadrada nesta categoria. (e) H pelo menos duas vantagens aparentes: (1) tais protenas podem ser armazenadas na forma precursora e ento ativadas rapidamente por quebra proteoltica quando necessrio; (2) tais protenas podem ser destrudas rapidamente por grupos sulfidrila livres ou enzimas como a MLE e portanto podem ser rapidamente eliminadas quando necessrio.