NUMERACION DE COLIFORMES, DETERMINACION DEL NMERO MS PROBABLE

I.

OBJETIVO

Determinar el nmero de coliformes totales en diferentes en alimentos en este caso Lechuga licuada. II. FUNDAMENTO TEORICO

Las coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comnmente en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos. La presencia de bacterias coliformes en el suministro de agua es un indic de que el suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos en descomposicin. Generalmente, las bacterias coliformes se encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los sedimentos del fondo. Los coliformes se introducen en gran nmero al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayora de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre. Este mtodo usado para el aislamiento y el recuento de

microorganismos patgenos en agua, alimentos, etc. Pueden no ser eficaces debido a que dichos microorganismos se encuentran en muy baja cantidad, sobre todo en presencia de nmeros altos de otros

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microorganismos, o producto.

que tengan una

distribucin irregular en el

La utilizacin de ciertos microorganismos del grupo coliforme o coliaergeno como indicadores de la contaminacin fecal de los alimentos, es una prctica establecida hace muchos aos, y es utilizada sucesivamente en el agua, leche, helados, mariscos y otros alimentos. El uso de E. coli como indicador de contaminacin en el agua fue sugerido en 1892 por Schardigen. Luego, en 1893 T. Smith, observ que ste germen est distribudo uniformemente en el intestino, por lo tanto en el alimento su presencia debe ser considerada como una contaminacin fecal ya sea por el hombre o por los animales.

Organismos

ndices.-

Cuya

presencia

puede

significar

simultneamente la presencia de grmenes patgenos, por ejemplo: un nmero elevado de E. coli en alimentos precocidos y congelados, indica un tratamiento inadecuado, pero tambin podra significar la presencia de otros grmenes entricos. Organismos Indicadores.- Su presencia indica en trminos ms generales una deficiencia en la calidad microbiolgica, por ejemplo: un nmero elevado de coliformes en leche pasteurizada indica una pobre calidad microbiolgica.

a. Organismos coliformes:

En bacteriologa se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formacin de gas
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a 35C en 48 horas". No se trata de un grupo taxonmico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayora de ellas de origen intestinal. Coliformes totales. Bacterias capaces de producir alguna patologa, que no ha sido posible analizar por la falta de medios tcnicos de laboratorio.

b. Escherichia coli :

Habitante habitual en individuos sanos, no patgena aunque puede haber cepas que causan problemas intestinales serios (mortalidad infantil). Relacin probablemente, simbitica porque la bacteria proporciona al animal la vitamina K que ste no puede sintetizar.

Deteccin de Escherichia coli y de coliformes

Del origen fecal de esta bacteria se concluye que su presencia en un alimento indica que ste ha tenido contacto con, y por tanto est contaminado por, materia de origen fecal. La supervivencia de estas bacterias en medios no entricos es limitada por lo que su presencia indica una contaminacin reciente. Por estas razones, E. coli es el microorganismo ndice ideal para la deteccin de contaminaciones recientes.

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La identificacin del grupo coli-aerogenes se hace mediante la deteccin de microorganismos capaces de fermentar lactosa a 42 en presencia de un 2% de bilis y de cristal violeta. En alimentos tratados tambin conviene comprobar la presencia de coliaerogenes mediante la produccin de gas en verde brillante con 2% de lactosa, aunque esto no indica claramente contaminacin fecal debido a los mltiples orgenes de las bacterias de este grupo.

No es recomendable el uso del concepto de coliformes fecales definido por las que crecen en presencia de sales biliares a 40-42 porque el grupo no est definido taxonmicamente y las diferencias experimentales en los procesos de deteccin son muy crticas.

III.

MATERIALES Y REACTIVOS

Placas petri Pipetas bacteriolgicas de 1 ml. Aguja de inoculacin con alambre de nicron o platino-iridio Incubadora regulada a 35-37 C. Caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA), volmenes de 1 ml en tubos de 150x15 mm. Conteniendo tubos de fermentacin invertidos ((75x1)mm).

Agar-Violeta cristal-rojo neutro-bilis (VRBA) o agar Endo o Agar Mc Conkey.

IV.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
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Determinacin del nmero ms probable:

Preparar las muestras de alimento de acuerdo al procedimiento recomendado. Pipetear 1 ml. de c/u de las diluciones del homogeneizado de alime nto en tubos de caldo verde brillante bilis lactosa (Caldo BRILA) utilizando tres tubos por dilucin. Incubar los tubos a 35-37C por 24-48 horas. Anotar los tubos que muestren produccin de gas (Prueba Presuntiva). De cada tubo que contiene gas, aislar sobre placas con agarvioleta cristal-rojo neutro-bilis (VRBA) o agar Endo. Incubar a 35-37C por 24-48 horas. Confirmar la presencia de bacterias Conformes por: La formacin de colonias, rojo oscuro con dimetro mayor de 5 mm. en agar VRBA. La formacin de colonias rojas rodeadas halo rojo en agar Endo. Anotar el nmero de tubos confirmados. Referirse a la tabla del NMP para expresar resultado.

Primero pesamos 10 g de muestra (MUESTRA LECHUGA)

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Luego con la ayuda del mortero procedemos a triturar la muestra ,

luego colocamos la muestra en el matraz

Se procede a diluir la muestra con 90 ml de agua peptonada, una vez

listo viseamos la muestra al equipo de filtracin y esperamos que filtre tapando bien.

Si hay presencia de gas en los tubos es debido a los coliformes (lactosa +). Los resultados despus de 48 horas a 37C fueron los siguientes: LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA - B

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Por ultimo, Incubar los tubos a 35-37C por 24-48 horas.

Los tubos 10-3, 10-4, 10-5, reaccionaron de la siguiente manera 3 3 1

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________________________________________________________________________________________ V. RESULTADOS: NUMERACION MS PROBABLES (NMP): TRES TUBOS DE CADA DISOLUCION. NUMERO DE TUBOS POSITIVOS: En cada nivel de solucin
Dilucin 10-1 Dilucin 10-2 Dilucin 10-3 NMP Por gr.

limite de confianza
99 % 95 %

0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

1 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 2 3 3 3

0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 2 0 1 2

3 4 7 7 11 9 14 15 20 21 23 40 40 70 90 150 210 200 500 >1100

1 1 1 1 2 1 3 3 5 5 4 10 10 20 20 30 50 <100 100 200

23 28 35 36 44 50 62 65 77 80 177 230 290 370 520 660 820 1900 3200 6400

1 1 2 2 4 2 5 5 8 8 7 10 20 20 30 50 80 200 200 300

17 21 27 28 35 38 48 50 61 63 129 180 210 280 390 610 640 1400 2400 4800

a. Calculado a partir de los datos de Man (1975). b. En cada nivel de dilucin, inocular 1 ml. en cada uno de tres tubos de medio. Para calcular en NMP de las diluciones mayores que las que se sealan, multiplicar el NMP por el factor de dilucin apropiado de 10, 100, 1000, etc. Por ejemplo, si se han seleccionado tubos provenientes de las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, multiplicar por 10, si de las diluciones 10-3, 10-4 y 10-5, multiplicar por 100.

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N PRESENTA CUANTOS BURBUJAS -6 -5 -4 -3 -2 -1 NO SI/NO SI SI SI/NO SI 3 1/2 3 3 2/1 3

INDICACION POSITIVO NEGATIVO +++ - ++ ++ +++ +-+ +++ -

COMO SE TOMO LAS DISOLUCIONES 10-3, 10-4 y 10-5, SE MULTIPLICA POR

100. LO QUE NOS DA DISOLUCIONES DE 10-1, 10-2, 10-3 LOS CUALES PODEMOS HALLAR EN LA TABLA DE LOS DATOS DE MAN Y OBTEMEMOS 3, 3, 1 QUE NOS DA UN NMP DE 500. POR gr.

VI.

CONCLUCIONES

Decimo entonces que la presencia de coliformes nos indica una deficiencia en la calidad microbiolgica y en la manufactura y manipulacin de los alimentos. Si hubiera presencia de gas en los tubos confirmara la presencia de bacterias coliformes. La formacin de gas se debe a que el e. coli es lactosa positivo y degrada la lactosa para transformarla en CO2
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Obtuvimos valores de dilucin de 3, 3, 1 que nos da unas 500 bacterias por gr. La fermentacin de la lactosa se da con la formacion de gas que es un indicador de la presencia de enterobacteria lactosa (+).

VII.

RECOMENDACIONES Usar mascarilla, guardapolvo, y gorra con el cabello sujetado para no contaminar el ambiente. Desinfectar el ambiente.

VIII. BIBLOGRAFIA http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20 general/12-metodos%20de%20recuento.htm. http://www.ciese.org/curriculum/dipproj2/es/fieldbook/co liform.shtml. avdiaz.files.wordpress.com/2010/02/presentacion-clase4.pdf http://es.scribd.com/doc/56673690/22/Tecnica-dedeterminacion-del-numero-mas-probable-NMP

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