ndice

Introduccin A. Recomendaciones generales Tipo B. Tipo de muestras B.1. Muestras en el animal vivo B.2. Muestras en el cadver B.3. Muestras fetales Verificaciones prcticas Referencias Anexo I Anexo II

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Introduccin
Este Manual es consecuente con las directrices de la OIE y con la Normativa Nacional y de la UE.

La Brucelosis es una enfermedad infecciosa causada por bacterias encuadradas taxonmicamente en el Gnero Brucella. En Espaa, la Brucelosis bovina es una enfermedad que suele estar causada por Brucella abortus y menos frecuentemente por B. melitensis mientras que el agente etiolgico de la Brucelosis ovina y caprina es la B. melitensis.

De acuerdo con el Manual de Pruebas de Diagnstico y Vacunas de la OIE, clnicamente, la enfermedad se caracteriza por uno o ms de los sntomas siguientes: aborto, retencin de placenta, orquitis, epididimitis y, raramente artritis, con excrecin de los microorganismos en las descargas uterinas y en la leche. El diagnstico depende del aislamiento de Brucella del material infeccioso de los abortos, de las secreciones de la ubre y de tejidos analizados post-mortem. En las campaas oficiales de erradicacin se realiza un diagnstico preliminar determinando la respuesta serolgica frente a los antgenos de Brucella. Cuando la prevalencia es muy baja en una regin, el aislamiento y caracterizacin taxonmica, de biovariedades y de secuenciacin, constituyen una herramienta epidemiolgica de gran valor. Igualmente, los presuntos falsos reaccionantes positivos en zonas libres han de investigarse en profundidad (ver Gua).

El diagnstico de la brucelosis debe siempre centrarse en la unidad epidemiolgica, que debe ser el referente en la planificacin de las labores de diagnstico. El diagnstico etiolgico de la enfermedad permite confirmar la infeccin, aunque debido a su limitada sensibilidad el resultado negativo no permite excluir la presencia de la infeccin en la unidad epidemiolgica.

Retencin placentaria

El xito en la investigacin etiolgica del Gnero Brucella depende de la naturaleza y frescura de las muestras, el adecuado acondicionamiento y conservacin durante el transporte de las mismas, y de las Buenas Prcticas de Laboratorio para su aislamiento. En la medida de lo posible, las bacterias del Gnero Brucella deben aislarse en medios simples o selectivos, por cultivo a partir de flujos uterinos, placenta, fetos abortados, secreciones mamarias, semen o tejidos seleccionados, como linfondulos y rganos reproductores masculinos y femeninos. Las tcnicas de PCR directo todava no son tan sensibles como el aislamiento bacteriolgico estndar

Toma de muestras, acondicionamiento e identificacin

Como norma general, las muestras se tomarn bajo unas mnimas condiciones de asepsia, se acondicionarn en tubos o frascos apropiados estriles que se desinfectarn externamente. Los tapones de rosca de los frascos se sellarn con cinta de carrocero o similar y se almacenarn en neveras isotermas con dispositivos acumuladores de fro o en condiciones de refrigeracin (+2-8C). En cada envase debe indicarse la identificacin completa del animal, tipo de muestra biolgica y fecha de recogida.

Transporte de muestras al laboratorio

Las muestras para la investigacin etiolgica se congelarn (-20C) (no as la sangre sin anticoagulante para estudios serolgicos), si no se prev la llegada al Laboratorio el mismo da en que se toman. Igualmente, se congelarn (-20C, y si es posible, -80C) a la llegada al Laboratorio si no se analizan en dos das.

Condiciones de Seguridad biolgica

Durante todo el proceso se observar la normativa vigente, incluso en materia de seguridad e higiene en el trabajo, y de transporte de sustancias con riesgo biolgico.

La documentacin que acompae a las muestras no debe estar en contacto con las mismas y se debe adherir en sobre cerrado al exterior del paquete de envo.

Las probabilidades de aislamiento se incrementan a medida que se muestrea un mayor nmero de rganos y linfondulos del animal infectado. En el caso del cadver, por razones prcticas y de seguridad, es necesario ceirse a los tipos de muestras que a continuacin se relacionan, teniendo presente que la toma de las mismas en el ganado bovino es en el matadero, y en el caso del ganado ovino y caprino puede ser en la propia explotacin, y en otras ocasiones el matadero.

B.1. Muestras en el animal vivo:

Sangre sin anticoagulante (tubo estndar de 5 ml). Sangre con anticoagulante (heparina de litio) (tubo estndar de 5 ml). Escobilln vaginal en tubo con medio de trasporte (Amies). En el caso de hembras en lactacin, leche (2 tubos estndares de 5 ml).

B.2. Muestras en el cadver:

Sangre sin anticoagulante (tubo estndar de 5 ml). Sangre con anticoagulante (heparina de litio) (tubo estndar de 5 ml). Escobilln vaginal en tubo con medio de trasporte (Amies). Linfondulos supramamarios, o inguinales en el caso del macho (frascos con tapn de rosca de 50-100 ml de capacidad). Parnquima mamario colindante con la cisterna al pezn (frascos con tapn de rosca de 50-100 ml de capacidad) Leche (tubo estndar de 5 ml), cuando sea posible. En el caso de bovinos sacrificados en matadero, tambin linfondulos retrofarngeos (frascos con tapn de rosca de 50-100 ml de capacidad). Estos ltimos se toman durante la inspeccin sanitaria de la cabeza. Bazo (frascos con tapn de rosca), cuando sea posible. En el caso de bovinos gestantes, un tubo de lquido amnitico obtenido por puncin directa o cotiledones placentarios.

Si se trata del sacrificio de un nmero amplio de animales del mismo rebao o unidad epidemiolgica, se tomarn muestras de al menos 5 animales, preferentemente hembras gestantes o recin paridas con ttulos altos a la Reaccin de Fijacin del Complemento.

En el caso particular de los animales impberes las muestras de eleccin se centran en torno a la puerta de entrada del agente etiolgico (ver Anexo II):

Ganglios retrofarngeos Ganglios parotdeos Ganglios mandibulares

B.3. Muestras fetales

Si bien estas muestras presentan un elevado inters por la informacin potencial que pueden aportar, el enorme peligro de contagio y diseminacin a partir de las mismas pone de manifiesto la necesidad de ser conservadores a la hora de manipular muestras de los abortos. Se recomienda recoger para su anlisis las siguientes muestras sobre el feto:

Contenido estomacal, con jeringuilla. Bazo, mediante pequea incisin abdominal (pulmn si no se observa congestin en el bazo).

Aborto por B. melitensis

Verificaciones prcticas:
Las recomendaciones contenidas en este manual se han tomado de la bibliografa disponible, y de la prctica del da a da en el laboratorio. Por regla general, en animales infectados slo se produce un aborto. Sin embargo, la persistencia de la infeccin puede ser de por vida, y los partos sucesivos son generalmente asintomticos pero las hembras paridas pueden ser excretoras activas de Brucella. En cualquier caso, la excrecin del agente patgeno y por tanto su diseminacin en el medio ambiente y hacia el resto de los animales dura de hecho meses de manera continua, incluso durante casi toda la lactacin de manera intermitente a travs de leche y flujo vaginal (10, 11). En bovinos, se ha comprobado que esta intermitencia es extensible incluso a la serologa, de tal manera que un animal puede ser simultneamente portador del agente etiolgico y seronegativo. Por esa razn, cuando en una unidad epidemiolgica la incidencia es alta tras sucesivas tandas de serodiagnstico y sacrificio, una de las decisiones a tomar en la campaa puede ser el cambio de manejo o el vaciado sanitario. La informacin que la bacteriologa aporta en las campaas de erradicacin se muestra en los ejemplos prcticos de los Anexos I y II. En el Anexo I (8) se muestran ejemplos de los resultados de la bacteriologa en ovinos de diferentes situaciones epidemiolgicas,y en rebaos vacunados y no vacunados. Igualmente, en el Anexo II se muestran algunos ejemplos de los resultados de la bacteriologa en focos agudos y crnicos de bovinos no vacunados.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Anexo 2 del Real Decreto 2611/1996, modificado por Orden ARM/2166, que traspone la Directiva 64/432/CEE. Directiva 64/432/CEE, relativa a problemas de polica sanitaria en materia de intercambios intracomunitarios de animales de las especies bovina y porcina. Directiva 91/68/CEE, relativa a las normas de polica sanitaria que regulan los intercambios intracomunitarios de animales de las especies ovina y caprina. Office Internacional des Epizooties. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Pars. Francia. Alton, G.G., JONES, L.M., PIETZ, D.E. 1976. Las tcnicas de laboratorio en la brucelosis. Organizacin Mundial de la Salud. Ginebra. Alton, G.G., JONES, L.M., ANGUS, R.D., VERGER, J.M. 1988. Techniques for the Brucellosis Laboratory. Institut National de la Recherche Agronomique. Pars. Francia Miguel ngel Gonzlez Garca, Laboratorio de Sanidad Animal de Sevilla, Alberto Pacios, Servicio de Sanidad Animal de la Junta de Andaluca. Comunicacin Personal. lvarez, L., DURN, M., GMEZ, B., GARRIDO, F., YUSTES, C., VENDRELL, J., DOMINGUEZ, L., FERNNDEZ-GARAYZABAL, J.F., VELA, A.I., LATRE, M.V. 2010. Determinacin de los tejidos y medios de eleccin para la confirmacin microbiolgica de los resultados serolgicos de las campaas de control de Brucella melitensis en el ganado ovino. Arch. Med. Vet. 42 (43-49). Crespo, F.1985. Contribucin al estudio de la etiologa y la epidemiologa de la brucelosis en Espaa. Tesis Doctoral., Facultad de Veterinaria, UCM. Crespo, F. 1994. Brucelosis ovina y caprina. Office International des Epizooties, Paris, France. Animal Brucellosis. 1991. Ac. Press. Marn, C.M., JIMNEZ DE BAGS, M.P., BARBERN, M., BLASCO, J.M. 1996. Comparison of two selective media for the isolation of Brucella melitensis from naturally infected sheep and goats. Vet Rec 38 (409-411).

9. 10. 11. 12.

LABORATORIO CENTRAL DE SANIDAD ANIMAL DE SANTA FE

SUBDIRECCIN GENERAL DE SANIDAD DE LA PRODUCCIN PRIMARIA DIRECCIN GENERAL DE RECURSOS AGRCOLAS Y GANADEROS