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Rev Esp Patol. 2012;45(2):67--75 -

Patologa
R E V I S TA E S PA O L A D E

www.elsevier.es/patologia

ORIGINAL

Tumor de Wilms con diferenciacin muscular. Histologa, inmunofenotipo y anlisis molecular de tres casos
Jess Prez-Garca a , Isidro Machado b,c , Silvia Calabuig-Farias b , Samuel Navarro b n y Antonio Llombart-Bosch b,c,
a

Docente de Patologa, Facultad de Medicina, Universidad Libre; Laboratorio de Patologa Clnica General del Norte, Barranquilla, Colombia b Departamento de Patologa, Facultad de Medicina, Universidad de Valencia, Valencia, Espaa n c Departamento de Patologa, Instituto Valenciano de Oncologa, Valencia, Espaa n Recibido el 5 de octubre de 2011; aceptado el 29 de noviembre de 2011 Disponible en Internet el 22 de febrero de 2012

PALABRAS CLAVE
Tumor de Wilms; Nefroblastoma; Nefroblastoma con diferenciacin muscular; Blastema; Inmunohistoqumica; WT1

Resumen El nefroblastoma o tumor de Wilms (WT) es una neoplasia de origen embrionario de histologa trifsica que simula estadios diferentes de la nefrognesis, y est constituido tanto por clulas blastemales indiferenciadas como por clulas epiteliales y estromales bien diferenciadas. El predominio de uno de sus componentes en ms de dos terceras partes permite clasicar al WT en blastemal, epitelial, estromal o mixto cuando no hay predominio de uno de ellos. Los tumores con predominio de elementos estromales con un 30% o ms de diferenciacin muscular se reconocen como de variante rabdomioblstica o con diferenciacin muscular. El presente trabajo comunica los hallazgos histolgicos, inmunohistoqumicos y moleculares de tres casos de nefroblastoma con diferenciacin muscular en nios menores de 5 aos. La n n inmunotincin se realiz seleccionando bloques de tejido con representacin de todos los componentes tumorales. Dos de los tres tumores presentaron masas slidas y uno fue poliqustico. En todos se observ franco predominio estromal con expresin variable del componente blastemal y de rabdomiognesis. El blastema demostr positividad para marcadores mesenquimales y epiteliales identicando el componente germinal a partir del cual se diferencian los otros dos. La expresin citoplsmica de la -catenina se correlacion con la ausencia de mutacin en el gen WT1, que se maniesta habitualmente por una positividad nuclear para este anticuerpo. Adems, no se encontraron mutaciones de los genes E-cadherina, -catenina y APC, lo cual sugiere la existencia de mecanismos alternativos de activacin de la va Wnt. 2011 SEAP y SEC. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados.

Autor para correspondencia. Correo electrnico: antonio.llombart@uv.es (A. Llombart-Bosch).

1699-8855/$ see front matter 2011 SEAP y SEC. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados. doi:10.1016/j.patol.2011.11.007

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J. Prez-Garca et al

KEYWORDS
Wilms tumour; Nephroblastoma; Nephroblastoma with muscular differentiation; Blastema; Immunohistochemistry; WT1

The histopathological, immunohistochemical and molecular characteristics of three cases of Wilms tumour with muscular differentiation
Abstract Wilms tumour (WT), or nephroblastoma, is a neoplasm of embryonic origin with a triphasic histology reproducing the different stages of nephrogenesis. The tumour reveals an undifferentiated blastemal component associated with a well-differentiated epithelial and stromal counterpart. The predominance of any one of these elements in more than two thirds of the tumour allows the subclassication of WT into blastemal, epithelial, stromal or mixed variants. WTs with a high proportion of stromal component and rhabdomyogenesis are recognized as rhabdomyoblastic variants. The present study describes the histopathological, immunohistochemical and molecular characteristics of three WTs with myogenic differentiation in children under 5 years of age. The immunohistochemical study was performed on parafn block sections containing all three tumour components (epithelial, blastemal and stromal). A solid tumour mass was observed in two cases and polycystic formation in the other. The stromal component predominated in all cases with variable expression of blastemal and rhabdomyoblastic elements. The blastemal component revealed mesenchymal and epithelial immunoexpression, suggesting that blastemal elements are probably the origin of the mesenchymal and epithelial components in WT. -catenin cytoplasmic immunoexpression correlated with the absence of WT1 gene mutation in all cases, as would be expected given that WT1 mutation is typically associated with -catenin nuclear immunoexpression. Molecular biology failed to detect E-cadherin; -catenin or APC gene mutation in all three cases, suggesting an alternative mechanism for Wnt pathway activation. 2011 SEAP y SEC. Published by Elsevier Espaa, S.L. All rights reserved.

Introduccin
El nefroblastoma o tumor de Wilms (WT) es una neoplasia de origen mesodrmico embrionario con expresin morfolgica trifsica que representa el tumor slido ms frecuente en nios. Se presenta universalmente con una incidencia n estable en todas las regiones geogrcas y se considera que afecta a 1 de cada 8.000 nios, advirtindose una mayor incin dencia en la raza negra1-3 . Histolgicamente simula estadios diferentes de la nefrogensis, lo que indica diferenciacin aberrante de clulas multipotenciales del mesnquima renal4 . En su histologa, la mayora de los WT expresan una mezcla de componentes celulares blastemales indiferenciados con clulas epiteliales y estromales bien diferenciadas, y de acuerdo con el componente predominante en ms de 2 terceras partes se clasican en: blastemal, epitelial, estromal o mixto5 . Cada tipo tumoral expresa celularidad y patrones histolgicos diferentes con igual heterogeneidad en lo molecular y en lo gentico2,4,6 . Los tumores con predominio de elementos estromales bien diferenciados y rabdomiognesis son reconocidos como la variante morfolgica rabdomioblstica o con diferenciacin muscular1,4,7,8 . En el denominado tumor rabdoide, inicialmente considerado como variante miosarcomatosa, se ha demostrado ausencia de expresin inmunohistoqumica (IHQ) de marcadores expresados en el WT9-11 , y adems carece de expresin de INI1 por inactivacin proteica debido a deleciones y/o mutaciones del gen INI1, por lo que se considera una entidad independiente12 . Como variables principales en el pronstico del nefroblastoma, tradicionalmente se han aceptado los hallazgos histolgicos y el estadio tumoral. Sin embargo, actualmente se admite que estas variables por s solas no son sucientes para evaluar el riesgo de recurrencias, por lo

que se han incorporado: la edad en la fecha del diagnstico, el peso del espcimen, la respuesta histolgica a la quimioterapia y la prdida de la heterocigosidad de los cromosomas 1p y 16q como complementarias y prerrequisitos para denir el tratamiento posquirrgico, particularmente en ensayos clnicos del National Wilms Tumor Study (NWTS) pero no en los protocolos de tratamiento de la Sociedad Internacional de Oncologa Peditrica (SIOP), en los que no se contempla esta informacin13 . Los nefroblastomas con diferenciacin muscular tienen pobre respuesta a la quimioterapia, aunque un comportamiento favorable con el tratamiento quirrgico4,14-16 . El perl IHQ del nefroblastoma no ha sido sucientemente caracterizado. No obstante, en la literatura mdica aparecen descritos numerosos trabajos realizados con el objetivo de encontrar un perl gentico e inmunohistoqumico que caracterice al nefroblastoma17---21 . En el presente trabajo comunicamos los hallazgos histolgicos, moleculares y la expresin IHQ en tres casos de nefroblastoma con diferenciacin muscular, diagnosticados en piezas quirrgicas obtenidas previo tratamiento con quimioterapia de acuerdo con el esquema de la SIOP22 .

Material y mtodos
Se estudiaron histolgica e inmunohistoqumicamente 3 especmenes quirrgicos de rin con WT correspondienn tes a nios menores de 5 aos con diagnstico por imagen de n n masas renales a quienes, tras tratamiento con quimioterapia, segn protocolo de la SIOP, se les practic nefrectoma. En todos los casos se procedi a determinar el peso de las piezas quirrgicas y a la medicin de la masa tumoral. Previo procesamiento con jacin en formalina neutra

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Tumor de Wilms con diferenciacin muscular. Histologa, inmunofenotipo y anlisis molecular de tres casos
Tabla 1 Panel de anticuerpos realizados con las diluciones y fuente Anticuerpo EMA CK AE1/3 CK8 Ezrina CD56 CD57 (HNK-1) CD99 Vimentina Desmina Actina Caldesmon S100 E-cadherina B-catenima WT1 Dilucin 1:200 1:100 1:20 1:50 1:50 1:50 1:50 1:200 1:200 1:400 1:50 1:1000 1:20 1:500 1:40 Fuente Dako Novocastra Bochringer Manheim Santa Cruz Novocastra Dako Dako Dako Dako Dako Dako Dako Novocastra Santa Cruz Novocastra

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Figura 1 Hallazgos macroscpicos del caso 1: tumoracin slida con nodulaciones amarillentas y crecimiento expansivo en la periferia del polo renal superior. El parnquima renal se aprecia conservado, con buena denicin de los clices.

al 10% e inclusin en parana se realizaron cortes histolgicos de 5 micras que se colorearon con hematoxilina y eosina (HE) para su estudio microscpico y su clasicacin histolgica. Adicionalmente se practicaron estudios de IHQ para pan-CK, CK8, ezrina, CD56, CD57, CD99, vimentina, desmina, actina de msculo liso, H-caldesmon, S100, E-cadherina, -catenina y WT1. La valoracin de la reaccin de los inmunomarcadores se expres en mtodo semicuantitativo considerando la ausencia de coloracin como negativo (--), la coloracin en menos del 10% de las clulas tumorales como positividad focal (+); la coloracin entre el 10 y 50% de la clulas tumorales como positividad moderada (++), y la coloracin mayor del 50% de las clulas tumorales como positividad difusa (+++). La interpretacin la realizaron de manera independiente tres patlogos (IM, JPG, ALlB), manejando la discordancia diagnstica por consenso. En todos los casos se realiz IHQ con marcadores para caracterizar los componentes tisulares de las neoplasias por medio de la tcnica de inmunoperoxidasa de acuerdo con las indicaciones del fabricante (tabla 1). Adems se analiz el estatus mutacional de los genes WT1, E-cadherina, -catenina y APC mediante la reaccin en cadena de la polimerasa y posterior secuenciacin. Tambin se analiz el estatus mutacional de las regiones con mayor frecuencia de mutacin en los genes WT1, E-cadherina, -catenina y APC. Para ello se emplean unos cebadores descritos anteriormente21 y se realiza una amplicacin mediante reaccin en cadena de la polimerasa, conrmando la amplicacin en un gel de agarosa al 2%. Posteriormente, los fragmentos amplicados sern puricados y marcados con Big Dye 1.1 (Applied Biosystems) para ser secuenciadas en un ABI 310. Una vez secuenciados, sern estudiados mediante un BLAST con los genes de referencia.

tumoral hacia el polo superior de 11 8 6 cm. A la supercie de corte se demostr masa slida de color blanco grisceo con aspecto trabecular y ndulos amarillentos de crecimiento expansivo, aparentemente dependiente de la cpsula (g. 1). El estudio histolgico demostr tumoracin predominantemente estromal, de fondo broconectivo denso y leiomiomatoso en el que resaltaban bras musculares estriadas con rabdomioblastos, as como estructuras tubulares aisladas y en racimos, tapizadas por epitelio cuboidal con tendencia seudoestraticada. Se observ un 50% de diferenciacin muscular. Adicionalmente se reconocieron grupos de clulas blastemales con citoplasma plido y ncleos redondeados de cromatina laxa rodeadas de tejido broconecitvo. La coloracin de tricrmico de Masson resaltaba el fondo de colgeno estromal y bras musculares estriadas (g. 2).

Caso 2
Varn de 3 aos con imagen de gran masa renal izquierda y n ndulo en el hilio de aspecto metastsico, cuya pieza quirrgica de nefrectoma radical pes 1.320 g. A la supercie de corte present masa slida rme de 15 11 cm en el polo superior con crecimiento expansivo y compresivo, con buena delimitacin del parnquima renal, de supercie de color blanco y tendencia trabecular, con zonas perifricas de necrosis y pequeas reas quisticadas. Separadamente n acompa ndulo slido y rme que meda 5,5 5 4 cm, n con supercie de corte blanca, trabecular y slida (g. 3). El estudio histolgico se correspondi con tumoracin predominantemente estromal de celularidad bromiomatosa bien diferenciada con grupos aislados de clulas blastemales, con diferenciacin neural y muscular (45%), entre las que se identicaron estructuras tubulares de luces amplias y revestimiento epitelial cbico simple. Las reas qusticas mostraban espacios tapizados por epitelio cbico y plano simple, separados por nos septos conectivos laxos (g. 4).

Resultados
Caso 1
Nia de 3 aos que present a la TC una masa renal. Se n n realiz nefrectoma, que pesaba 360 g y mostraba masa

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Figura 2 Arriba a la izquierda se aprecia la caracterstica estromal de tipo broleiomiomatoso con frecuentes bras musculares estriadas (HE, 40). Arriba a la derecha, estructura tubular arracimada de revestimiento epitelial columnar bajo seudoestraticado (HE, 200). Abajo a la izquierda, agrupacin nodular de clulas blastemales claras rodeadas por el componente estromal (HE, 200). Abajo a la derecha se resalta con la coloracin de tricrmico de Masson la presencia de numerosas clulas rabdomiomatosas en un fondo de colgeno (HE, 200).

Caso 3
Nia de 4 aos con tumoracin renal derecha. La pieza quin n rrgica de nefrectoma pes 680 g, midi 14 9,5 9 cm y era de consistencia heterognea y nodulaciones en su supercie externa. Al corte, hacia el borde interno la supercie

estaba extensamente comprometida en un rea de 14 8 cm por tumoracin multiqustica de cavidades variables, septos brosos delgados y zonas ndulo-trabeculares blancas de crecimiento expansivo que desplazaba al parnquima renal, el cual se apreciaba comprimido y separado por espacios pielocaliciales dilatados (g. 5).

Figura 3 A la izquierda, la imagen de RM (caso 2) muestra una gran masa dependiente del polo superior del rin izquierdo con n crecimiento expansivo que desciende y comprime el techo vesical, asociando imagen nodular slida parartica derecha. A la derecha, la pieza quirrgica de la nefrectoma muestra la masa de crecimiento expansivo en el polo superior renal y el correspondiente ndulo extirpado del hilio renal.

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Figura 4 Los cortes histolgicos en HE demuestran un componente estromal bromuscular con proliferacin capilar (arriba izquierda), diferenciacin neural (arriba derecha), elementos tubulares tapizados por epitelio columnar bajo (abajo izquierda) y reas de quisticaciones con septos delgados y revestimiento epitelial plano (abajo derecha).

Los hallazgos histolgicos demostraron una tumoracin multiqustica de septos estromales vascularizados tapizados por epitelio cbico simple y que contena material eosinlo granular. En las reas nodulares se identicaron estructuras tubulares de epitelio columnar bajo, tumefacto con luces estrechas, asociadas a grupos de clulas blastemales. Tambin se identicaron zonas con mayor densidad estromal y diferenciacin muscular (50%). Se apreciaron estructuras tubulares con metaplasia escamosa y queratinizacin (g. 6).

Figura 5 Hallazgos macroscpicos del caso 3: pieza quirrgica de nefrectoma con masa de supercie poliqustica y crecimiento expansivo compresivo hacia el borde interno, comprimiendo el sistema pielocalicial y el parnquima renal.

El estudio de IHQ de los componentes de las neoplasias se realiz, en los tres casos, mediante la seleccin de bloques representativos para la tipicacin, y sus resultados se resumen en la tabla 2. La expresin positiva de la IHQ en los tres casos fue mayor con los marcadores mesenquimales, relacionndose con el predominio de elementos de dicho componente. La vimentina present positividad difusa en los tres casos. La desmina demostr positividad focal en el blastema (g. 7) de los tres casos y moderada a difusa en el estroma y zonas de diferenciacin muscular en los tres casos, con negatividad epitelial. La actina de msculo liso (SMA) mostr coloracin positiva difusa en las zonas de diferenciacin muscular de los tres casos; focal y moderada en el estroma de dos casos y focal en el blastema de uno (g. 7). La protena S100 fue positiva solo en uno de los tres casos estudiados, con expresin focal nuclear en el blastema y expresin moderada nuclear en el componente estromal. En los tres casos, en el componente epitelial hubo positividad para EMA, pan-CK, CK 8 y en dos para ezrina. El blastema expres en los tres casos negatividad para EMA y positividad difusa para vimentina, conrmando el origen mesenquimal de este componente. Adicionalmente en el componente blastemal se observ expresin positiva para desmina y coexpresin de marcadores epiteliales como citoqueratinas y E-cadherina. La expresin positiva para -catenina se demostr en los componentes blastemal, epitelial y mesenquimal (g. 8). La expresin de ezrina fue heterognea en los 3 casos. Esta protena participa en la migracin, la sealizacin, la regulacin del crecimiento y la n diferenciacin celular, y su positividad puede estar relacionada con la progresin de algunas neoplasias embrionarias peditricas23 .

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Figura 6 El estudio histolgico con HE muestra septos bromusculares con estructuras tubulares tapizadas por epitelio cbico (arriba izquierda), rea con diferenciacin escamosa queratinizante del componente epitelial (arriba derecha), componente blastemal entremezclado con rabdomioblastos (abajo izquierda), y otra rea en la que los tres componentes (estromal, blastemal y epitelial) se asocian a numerosas clulas rabdomioblsticas (abajo derecha).

A nivel mutacional no se demostr la presencia de mutacin en ninguno de los cuatro genes estudiados (WT1, E-cadherina, -catenina y APC).

Discusin
Los hallazgos histolgicos conrman el predominio estromal con diferenciacin muscular en los tres casos, y su perl

inmunohistoqumico la condicin plurifenotipica propia de los tumores embrionarios. En los tres casos de WT se demostraron las caractersticas histolgicas informadas en descripciones clsicas con representacin variable de elementos constitutivos de diferentes estadios de la nefrognesis1-4 . Los elementos estromales predominaron en los tres tumores y la diferenciacin muscular constituy un rasgo caracterstico en los tres casos. Esta diferenciacin se manifest de manera variable con

Tabla 2 Marcador

Perl inmunohistoqumico en tres casos de nefroblastomas con diferenciacin muscular Nmero del caso Caso 1 Blas Mus ----+++ +++ ++ -++ ---+ ++ -NV Epi ++ ++ ++ ++ ----++ ----++ -NV Estro -+ -++ +++ ---++ -++ -+ +/--NV Blas -+ --+++ -+ + ++ ++ -----NV Mus ----+++ ++ + + ----+ + -NV Caso 2 Epi + + +++ -----/+ --/+ ++ --+ -++ -NV Estro ----+++ + --++ --+ --/+ +/--NV Blas ----+++ + + + ++ + --+ ---Caso 3 Musc ----+++ +++ +++ +++ +++ ---++ ++ --Epi +++ +++ +++ ++ ----++ ++ ---++ --Estro ----+++ +++ +++ +++ +++ + -++ + +/----

EMA CK AE1/3 CK8 Ezrina Vimentina AML Desmina Caldesmon -catenina E-cadherina S100 CD34 CD56 CD57 WT1 GenWT1

-+ -++ +++ -+ -++ ---/+ -+ --NV

Blas: blastema; Mus: msculo; Epi: epitelio; Estro: estroma; NV: no valorable.

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Figura 7 El estudio de inmunomarcacin muestra la expresin positiva del blastema para actina de msculo liso (arriba izquierda), para vimentina (arriba derecha), para citoqueratinas (abajo izquierda) y para desmina (abajo derecha).

extensas reas de diferenciacin muscular con rabdomioblastos en el caso 1 y zonas aisladas con dicha diferenciacin en los otros dos. Al igual que los hallazgos informados por Anderson et al.24 , la diferenciacin muscular/rabdomioblstica en estos casos se asoci a tratamiento previo con quimioterapia. Esta diferenciacin est ligada a un comportamiento clnico favorable, y se postula como una resistencia del componente estromal a la accin de la quimioterapia, antes que a un fracaso teraputico por la pobre regresin radiolgica observada en estos tumores4,5,24,25 .

Algunos estudios de inmunohistoqumica en los nefroblastomas han demostrado el origen mesenquimal del blastema con expresin de vimentina y desmina. Droz et al.26 demostraron, adems de la expresin de vimentina en el blastema, distintos grados de diferenciacin epitelial con positividad para citoqueratina. Folpe et al.27 han sealado que la expren sin de desmina en clulas blastemales de WT se asocia a la negatividad de otros marcadores de diferenciacin muscular como actina y miogenina. Tambin Vasei et al.18 han demostrado positividad para CK8 y CK22 en el componente blastemal de WT.

Figura 8 La expresin positiva para (C) y estromal (D).

-catenina se demostr en los componentes: blastemal (A), muscular (B), epitelial

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74 En la inmunotipicacin de los tres casos se observ diferenciacin mesenquimal, miognica y epitelial en el blastema, con positividad para vimentina, desmina y CK-AE1/3, lo que sugiere que este componente es el elemento bsico a partir del cual se diferencian los tejidos expresados en el WT. En los tres casos estudiados la -catenina expres coloracin citoplasmtica positiva entre moderada a difusa en todos los componentes, a excepcin del muscular en un caso. La -catenina es una molcula de adhesin perteneciente a un grupo de protenas que participa en la va de sealizacin controlada por el morfogn WNT y regulada n por el gen WTX. Los tumores con mutacin en WT1 mantienen actividad sostenida de la mutacin de -catenina con acumulacin nuclear de la protena, que se asocia a un comportamiento ms agresivo28-31 . En el presente estudio, la expresin citoplasmtica asociada a la negatividad para WT1 guarda relacin con ausencia de mutacin en el gen WT14,29,30 . La ausencia de mutaciones en estos genes implicados en la diferenciacin mesenquimal sugiere que ni las mutaciones de E-cadherina ni -catenina ni APC han contribuido a la activacin de la va Wnt que depende de ellos, por lo que se supone que en estos tumores deben existir mecanismos alternativos de activacin de dicha va. La protena APC posee una funcin supresora de tumores en el colon humano gracias al papel desempeado en la va de n sealizacin WNT21,32---34 . Cuando la -catenina se acumula n en el citoplasma bien por sealizacin WNT, por inactivan cin de APC o por mutacin de la propia -catenina, forma un complejo con el factor de transcripcin LEF-1 (Tcf-4), penetra en el ncleo y activa la transcripcin de oncogenes diana como el c-myc y la ciclina D132---34 . Adems, APC interviene en la integridad del citoesqueleto mediada por actina mediante el puente con -catenina y con el dominio HDLG38, as como en la adhesin, en la migracin celular y en el mecanismo de transicin epitelial-mesenquimal que se describe en tumores bifsicos como el sarcoma sinovial, en tumores mullerianos y en algunos tumores de origen embrionario como el nefroblastoma32---34 . Adicionalmente, no encontramos mutacin en WT1, por lo que no se puede condicionar a este gen como mecanismo exclusivo de activacin del proceso oncognico.

J. Prez-Garca et al y que todos los pacientes incluidos en el estudio han recibido informacin suciente y han dado su consentimiento informado por escrito para participar en dicho estudio.

Derecho a la privacidad y consentimiento informado

Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes y/o sujetos referidos en el artculo. Este documento obra en poder del autor de correspondencia.

Conicto de intereses
Los autores declaran no tener ningn conicto de intereses.

Bibliografa
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Financiacin
Red de tumores Infantiles. *RD06/0020/0102 Instituto de Salud Carlos III, Madrid.

Responsabilidades ticas
Proteccin de personas y animales
Los autores declaran que los procedimientos seguidos se conformaron a las normas ticas del comit de experimentacin humana responsable y de acuerdo con la Asociacin Mdica Mundial y la Declaracin de Helsinki.

Condencialidad de los datos

Los autores declaran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicacin de datos de pacientes

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Tumor de Wilms con diferenciacin muscular. Histologa, inmunofenotipo y anlisis molecular de tres casos
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