Metodos de purificacin

Basado en las siguientes propiedades proteicas:

Tamao Solubilidad Carga Adsorcin Afinidad

CAROLINA VITA

Caracterstica

Procedimientos
Dialisis ultrafiltracin Electroforesis en gel Cromatografia de exclusin molecular Ultracentrifufacion Precipitacin con Sales Solventes organicos por pH Cromatografia de absorcin C. En papel C. En fase reversa C. De interaccion hidrofbica Cromatografia de intercambio inico Electroforesis Isoelectroenfoque Cromatografia de afinidad

Tamao

Solubidad

Polaridad

Carga

Selectividad

Cromatografias de exclusin molecular

Separan por tamao Las columnas rellenas polimeros inertes Insolubles pero muy hidratados
Sephadex: polimeros de dextrano Sepharose: agarosa Superose: agarosa entrecruzada Sephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano

Exclusin molecular
1.La columna se equilibra con el buffer de corrida 2. Aplicacin de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna) 3. Elucin.

Exclusin molecular
1. 2. 3. 4.

Separa mezclas de protenas por tamao De macromolculas diferente De grandes estructuras celulares como ribosomas Determinacin de PM

Volumen de exclusin

Protenas de gran tamao no penetran los poros permaneciendo en el volumen de exclusin de la columna

Vo

Determinacion de PM
Se determina Vo con Blue Dextran Ve se determina para cada protena Vt se calcula de la frmula r 2 x h Kav =Ve-Vo / Vt-Vo Kav

Log Mw

CARGA
Los grupos R en las protenas globulares se encuentran sobre la superficie exterior de la molcula, aunque tambin pueden tener grupos ocultos o participando de puentes de H Carga depende de las propiedades cido base de los grupos R

Cromatografa de intercambio inico

Un intercambiador inico consiste en una matriz porosa con grupos cargados unidos covalentemente. Estos grupos se asocian con iones de la fase mvil (contraiones), estos pueden intercambiarse por otros iones de las misma carga sin alterar la matriz. La matriz generalmente es un compuesto inorgnico, resinas sintticas o polisacridos.
Matriz Dextrano Agarosa Celulosa Nombre Sephadex Sepharose CL-6B Sephacel

Grupos cargados
Son una propiedad fundamental del intercambiador. Determina el tipo y la fuerza del intercambiador

El nmero total y su disponibilidad determinan la capacidad del intercambiador

Los de carga negativa adsorben cationes mientras que los de carga positiva adsorben aniones. As se llaman intercambiadores catinicos y aninicos respectivamente.

Cromatografa de intercambio inico(IEX)

Mecanismo de separacin
Separa a molculas por carga neta. Grupos cargados unidos a la matriz adsorben muestras de carga opuesta(reversible) La desorcin se logra a travs el cambio del pH o aumentando la concentracin de sal del eluyente.

Fig 1.1. las molculas cargadas se absorben en los en los intercambiadores de carga opuesta. La interaccin es un equilibrio dinmico que puede estar influenciado por pH como por la concentracin de las sales.

Adsorcin
Protenas poseen aa cargados en su superficie, se adsorben sobre el intercambiador

Protenas con carga neta negativa se absorben a I. catinicos, La fuerza de adsorcin aumenta con el aumento de carga neta. La carga de los aa depende del pH. la carga neta depender del pH de una manera que es bastante especfica para cada protena individual. Fig 1.2. El tamao de la fecha representa la fuerza de la adsorcin

Desorcin
Existen 2 posibilidades Reducir la carga neta cambiando el pH. Agregar un in que compita por las cargas del intercambiador En IEX se utiliza una sal monovalente como NaCl, ya que tiene poco efecto sobre el pH de la corrida.

Fig 1.3. A mayor carga neta, mayor es la adsorcion y mayor la concentracion de sales que se necesita para desorber la muestra

Separacin de protenas usando gradiente de NaCl

1. El buffer se bombea por la columna hasta que la [salina] y el pH lleguen a un equilibrio
2.

La muestra se aplica , se adsorbe y se lava con buffer

Elution order:

3. El gradiente comienza y los componentes adsorbidos de la muestra comienzan a eluir en funcin de su carga neta.

Regeneracin de los componentes cargados hasta remocin completa.

4.

CARGA
Los grupos R en las protenas globulares se encuentran sobre la superficie exterior de la molcula, aunque tambin pueden tener grupos ocultos o participando de puentes de H Carga depende de las propiedades cido base de los grupos R

Electroforesis
Transporte de partculas a travs de un campo elctrico.

ELECTROFORESIS en Papel de filtro o acetato de celulosa

Revela la presencia de protenas con colorantes especficos No existe interaccin con el soporte Resolucin muy baja Rpido

ELECTROFORESIS EN GELES
Separa por CARGA Y TAMAO El material soporte interacciona con las protenas actuando como matriz retardando a las protenas ms grandes Geles agarosa Geles poliacrilamidas Condicin nativa(PAGE) o desnaturalizante(SDS-PAGE)

Geles poliacrilamida

SDS-Page
Condiciones desnaturalizante Utiliza en la corrida: -mercaptoetanol reducidas SDS desnaturalizadas

Las proteinas se separan slo por su PM El SDS interacciona con las protenas por interacciones hidrofbicas cumple 2 funciones crticas: Recubre las proteinas con carga negativa proporcional a su PM Desnaturaliza la estructura nativa de la protena -mercaptoetanol rompe los puentes disulfuros

Se puede entonces determinar el peso molecular aparente de cualquier protena por comparacin con un patrn de protenas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las protenas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular.

SDS PAGE of Purification

1. 2. 3. 4. 5. Complete mix of proteins High Salt Ion exchange Gel-filtratio Affinity

10micrograms loaded in each lane

USOS
DETERMINACIN DE PI DETERMINACIN DE PM # DE PROTENAS DE UNA MUESTRA # DE SUBUNIDADES de PROTENA

Isoelectroenfoque
Es un tipo de electroforesis
Se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molculas anfotricas(aa) se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La regin del nodo es cida La regin del ctodo es alcalina. Se establece un gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tengan su pI dentro del rango.

Isoelectroenfoque
Las sustancias que estan en regiones de pH < pI tendran carga y migraran hacia el ctodo Las que se encuentran en medios con pH > pI tendrn carga - y migrarn hacia el nodo La migracin las conducir a una regin donde el pH coincidir con su pI neta nula y se detendrn De esta forma las molculas anfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su pI con el pH

IEF

IEF

Electroforesis bidimensional
La electroforesis bidimensional se basa en separar las protenas en una mezcla segn sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensin. El procedimiento ms usado se basa en la separacin Primera dimensin mediante ief Segunda dimensin segn PM mediante electroforesis en poliacrilamida SDS-Page

Electroforesis bidimensional

1. 2.

Se tien los geles se adquieren las imgenes de los geles con un escner de alta resolucin se analizan con un software especializado. As se pueden comparar geles y observar cambios en el patrn de manchas: variacin de intensidades, aparicin y/o desaparicin de manchas.

La electroforesis 2D, englobada en un estudio de protemica, va seguida del anlisis de manchas concretas hasta llegar a la identificacin de les protenas correspondientes.

Electroforesis 2D

Primera dimensin: IEF, rango de pI 3-10 Segunda dimensin: SDS-PAGE 12%

Las aplicaciones de la protemica

Identificacin de nuevos marcadores para el diagnstico de enfermedades Identificacin de nuevos frmacos Determinacin de mecanismos moleculares involucrados en la patogenia de enfermedades Anlisis de rutas de transduccin de seales

Cromatografia hidrofbica
Separacion de las protenas por diferente hidrofobicidad Interaccon reversible entre la protena y la superficie hidrofbica del medio cromatogrfico La interaccion con alt fuerza inica Desorcin: decreciente de [salina]

Cromatografia hidrofbica

Cromatografia hidrofbica
Distintos ligandos: fuerza: Eter< isopropil<butil<octil<fenil No se puede predecir el comportamiento de la protena Kit test

Cromatografia hidrofbica
HiTrap HIC Selection Kit -Seleccionar el ligando apropiado y las condiciones experimentales 5 medios con distintas caractersticas hidrofbicas para screening y seleccin a pequea escala Phenyl Sepharose High Performance Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (low sub) Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub) Butyl Sepharose 4 Fast Flow Octyl Sepharose 4 Fast Flow

Cromatografia hidrofbica

Adsorcin
En agua pura los efectos hidrofbicos son muy dbiles para causar la interaccin de la protena con el ligando. Ciertas sales aumentan las interacciones hidrofbicasse pegan al ligando
Fig 1.7. HIC deals with the relation between water shells around hydrophobic surfaces, bulk water clustersand salts enhancing hydrophobic interaction.

Las siguientes sales aumentan la interaccin hidrofbica: Na2SO4 > K2SO4 > (NH4)2SO4 > NaCl > NH4Cl > NaBr > NaSCN

Para lograr una desorcin selectiva la concentracin de sal se disminuye de forma gradual y los componentes eluyen en orden de hidrofobicidad

Fig 1.8. The adsorption of hydrophobic molecules is a reversible reaction whose equilibrium is controlled by the salt concentration.

Cromatografia hidrofbica

Cromatografa de afinidad

Cromatografa de afinidad