Columna uso biorreactor para la optimizacin de la produccin de pectinasa en el cultivo de sustrato slido

RESUMEN

Este estudio tuvo como objetivo determinar la influencia de variables de proceso y produccin de poligalacturonasa (PG) y polymetylgalacturonase (PMG) por el cultivo en sustrato slido utilizando un biorreactor de lecho de la columna fija. Un diseo factorial fraccional (FFD) para estudiar el efecto de las variables siguientes: microorganismos (Aspergillus oryzae y Aspergillus niger), sustrato (salvado de trigo y salvado de arroz sin grasa), aireacin (40 y 60 h ml -1 g -1) , pectina (5 y 10 gg -1) y nitrgeno (urea y sulfato de amonio). Microorganismo, la aireacin y la pectina inicial se identificaron en FFD como variables significativas (p <0,05) en la produccin de PG. Un diseo compuesto central para optimizar el PG y producciones PMG indic que Aspergillus niger presenta una mayor produccin de PG; sustrato y el nitrgeno no afectar la produccin de PG, la tasa de aireacin afecta positivamente la produccin de PG y negativamente en la produccin de PMG y la concentracin de pectina inicial afecta positivamente tanto PG y la produccin de PMG. El punto ptimo de la aireacin y la concentracin de pectina inicial para la produccin de PG son 66.13 h ml -1 g -1 y 12,8 gg -1, respectivamente, y para la produccin de PMG son 40 h ml -1 g -1 y 15,0 gg -1, respectivamente.
MATERIALES Y MTODOS

Preparacin de inculos: Aspergillus niger y Aspergillus oryzae se mantuvieron en agar papa dextrosa (PDA) a 4 C. Los inculos se realizaron despus de que el crecimiento de estos microorganismos en un PDA durante 7 das a 30 C, hasta la esporulacin del hongo completo. Las esporas fueron suspendidas en solucin acuosa esterilizada (121 C durante 15 min) con Tween% 0,2-80 detergente. la concentracin de esporas se determin por conteo directo en una celda-contador cmara de Neubauer, segn Hasan et al. (9). Diseo experimental:Un diseo factorial fraccionario 2 5-1 (FFD) para identificar las variables que afectan a (p <0,05) la produccin de PG en el cultivo de sustrato slido. Las variables estudiadas en el FFD se aireacin en el volumen de aire por el tiempo y la masa seca de la media (h ml -1 g -1), la concentracin de la pectina de la masa de la pectina aadido por unidad de masa seca de la media (gg -1), las fuentes de nitrgeno agregado para obtener 0,03 moles de nitrgeno por medio de la masa (g mol -1), microorganismos desecados (Aspergillus niger yAspergillus oryzae), y el salvado (de trigo o de arroz). Las pistas, las variables y los valores codificados en estudio para FFD se muestran en la Tabla 1 . De acuerdo con los resultados de la financiacin para el desarrollo, un diseo central compuesto (CCD) se llev a cabo para optimizar las condiciones de cultivo para producir PG y PMG. Las pistas, las variables y los valores codificados en estudio para el diseo compuesto central se muestran en la Tabla 2 . .

Medios de cultivo y biorreactor :Los medios de cultivo de financiacin para el desarrollo y la CLD se prepara mezclando 150 g de arroz o salvado de trigo con la pectina comercial de naranja (Braspectina con alto grado de metoxylation) como se muestra en la Tabla 1 para la financiacin para el desarrollo y en la Tabla 2 de la CLD. La humedad en el medio de cultivo se ajust a 50% y 0.018 g de KH 2 PO 4 y 0,09 g de MgSO4 se agregaron por gramo de secado medio. La esterilizacin de los medios de comunicacin se llev a cabo a 121 C durante 15 min. El pH se ajust a 3,5 con HCl (N 2) y, a continuacin soluciones de nitrgeno se agregaron para obtener 0,03 moles de nitrgeno por gramo de secado medio. Todas las soluciones se esterilizaron por filtracin (0,22 micras de tamao de poro del filtro). Los medios de cultivo se inocularon con la concentracin de 4x10 6 esporas por gramo de medio seca. Cada medio de cultivo inoculado fue transferido aspticamente a un biorreactor de lecho de la columna fija. El biorreactor consisti de un tubo de vidrio con un dimetro interno de 50 mm y una longitud de 300 mm, flujo de agua rodeados por otro tubo de vidrio (5 mm entre los tubos de vidrio) para mantener la temperatura exterior del biorreactor a 30 C. La entrada de agua saturada de aire dentro del biorreactor fue controlado por un sistema descrito por Hassan et al. (9), que se muestra en la figura. 1 . Actividad enzimtica y la extraccin:El extracto crudo se realiz con 5 g de medio de cultivo fermentado mixto (1:10) con solucin tampn acetato (pH 4.4). La mezcla se agita a 100 rpm durante 30 min a 35 C y filtrado a continuacin. El extracto crudo se utiliz para determinar azcares reductores (NIF) y la actividad enzimtica de PG y PMG, de acuerdo con Castilho et al. (5). Para determinar FRS un dinitrosaliclico cido 3,5-mtodo se utiliz con la glucosa como estndar (15). El FRS se expresa como la masa de la glucosa por masa seca de la media (mg g -1). masa seca se determin con base en el principio de secado hasta peso constante a 105 C, segn AOAC (1). Para la actividad PG 5 ml de cido poligalacturnico (0,5% elaborados a diario en el pH 5.0 con tampn cido ctrico-fosfato) fue introducido en un tubo de ensayo con 1 ml de extracto enzimtico crudo (1:50 diluida). La reaccin enzimtica se produjo durante 60 minutos a 37 C. El D-galacturnico cido liberado se cuantific como la reduccin de azcar con el cido 3,5-dinitrosaliclico a 540 nm y cido Dgalacturnico como estndar (15). Una unidad de actividad enzimtica (U) se define como la cantidad de enzima que libera un mol de cido galacturnico por minuto a 37 C (12,14). produccin de PG se expres como unidad de actividad enzimtica por masa de medio seco (U g -1).

Para la medicin de la actividad enzimtica de PMG, 2 ml de extracto crudo enzimtico (1:25 diluida) se mezcl con 8 ml de la pectina de naranja de Sigma en el 0,63% en tampn acetato, pH 4,0. La solucin se mantuvo en un bao de agua a 30 C durante 30 min. La reduccin de la viscosidad de la mezcla se midi con un viscosmetro rotacional Brookfield. Una unidad enzimtica se define como la cantidad de enzima que reduce la viscosidad inicial de la solucin al 50% en 30 min (12). produccin de PMG se expres como unidad de actividad enzimtica por masa de medio seco (U g -1). RESULTADOS Y DISCUSIN Identificacin de las variables que la produccin de PG afectados en el diseo factorial fraccional (FFD) De acuerdo a la condiciones de financiacin para el desarrollo experimental ( Tabla 1 ) se calcul los efectos de las variables en la produccin de PG presentan en la Tabla 3 . Los efectos de mostrar una pequea parte de cada variable afectada la produccin de PG cmo. La variable "microorganismo" presentaron mayor efecto sobre la produccin de PG. A las 60 h de cultivo, el Aspergillus niger aumento de la produccin de PG en 368,9 U g -1 ( Cuadro 3 ), lo que representa un 46,1%, en comparacin con Aspergillus oryzae. Este resultado es similar a Baracat et al. (4) y Castilho et al. (5), que inform de las actividades de alto pectinasa producidos por cepas de Aspergillus niger. La A. niger se ha utilizado como productor de pectinasas (18,26). Patil y Dayanand (21) utilizaron una tcnica de paso de deteccin multi-basado en el coeficiente de pectolysis y la capacidad de produccin de pectinasa para aislar microorganismos con alto potencial para producir pectinasas. Encontraron A. niger como el mejor productor, entre los microorganismos ensayados. Adems de que los extractos enzimticos de A. niger se han utilizado con seguridad en los alimentos (10) y los piensos 17) industria (y otras aplicaciones como modelo para estudiar la interaccin entre la protena y 11) y para promover la proteccin de las plantas (hidratos de carbono (2). As, el uso de A. niger fue elegido para la prxima fase experimental, y una variable fue descartada.

La pectina Adems de los medios de cultivo inducido por la produccin de PG (p <0,05). A las 60 h de cultivo, un aumento en la concentracin de pectina inicial 5-10 gg -1 result en un aumento de la produccin de PG en 140,6 U g -1 ( Cuadro 3 ). La produccin de pectinasa inducida por la concentracin de pectina en el sustrato, que se encuentra en este estudio, fue similar a la reportada por Kashyap et al. (10) con Bacillus sp y por Fontana et al. (8) con A. niger. Fontana et al. (8) report que la pectina puede ser utilizado por A. niger como sustrato de crecimiento, adems de su papel como inductor. Estos resultados concuerdan con Maldonado y Strasser de Saad (13) que verifica el crecimiento del micelio y la produccin de pectinasas por A. niger con pectina como

nica fuente de carbono. Por lo tanto, la pectina fue seleccionado para ampliar la gama de estudio en el documento bsico.

La aireacin afectados (p <0,05) la produccin de PG. A las 60 h de cultivo de un aumento en la aireacin de 40 a 60 ml h -1 g -1 produccin de PG aument en 153,5 U g -1 ( Cuadro 3 ). Aumenta la tasa de ventilacin reduce la temperatura del medio de cultivo y por lo tanto reduce la desnaturalizacin enzimtica (16,22). Esto podra explicar por qu la aireacin variable afectada de manera significativa la produccin de PG. Por lo tanto, la aireacin fue seleccionado para ampliar la gama de estudio en el documento bsico para determinar el rango ptimo para la produccin de pectinasa. Pectinasa optimizacin de la produccin a travs del diseo compuesto central (CCD) De acuerdo con el CCD de condiciones experimentales ( Tabla 2 ) se calcul los efectos de las variables de PG y PMG producciones se presentan en la Tabla 4 y 5 . El mayor valor obtenido en el documento bsico para la produccin de PG fue 1.829 U g -1 a 48 h de cultivo. Este resultado fue 228% superior al valor ms alto obtenido en la financiacin para el desarrollo, que fue de 800 U g -1 en 60 h. Esta optimizacin de las variables de proceso muestra un valor ms alto de actividad de PG en un tiempo de cultivo ms corta. El aumento de la tasa de aireacin, en cualquier tiempo de cultivo, mostr un comportamiento inverso y PMG actividades PG ( tablas 4 y 5 ). Aumenta la tasa de ventilacin reduce la temperatura del medio de cultivo y por lo tanto reduce la desnaturalizacin enzimtica (16,22). En l se explica el aumento de la produccin de PG, pero no la disminucin de la produccin de PMG en este estudio. Es posible que la actividad de PMG y / o sntesis se ven fuertemente afectados por la concentracin de FRS en el medio de cultivo. Los resultados encontrados en este estudio muestran que los valores ms altos de actividad PMG ocurrido siempre cuando la concentracin de FRS fue menor de 110 mg g -1 . Esto significa que un aumento en la tasa de aireacin induce la actividad de PG que aumenta la concentracin de FRS y por lo tanto inhibe la actividad de PMG. . Teniendo en cuenta las condiciones y las metodologas utilizadas en este estudio se concluy que Aspergillus niger present mayor actividad poligalacturonasa de Aspergillus oryzae, el sustrato y la fuente de nitrgeno no afect la actividad poligalacturonasa, la tasa ms alta de aireacin afectado a la actividad poligalacturonasa positiva y polymetylgalacturonase, negativamente, la ms alta concentracin de la pectina inicial afect positivamente tanto y polymetylgalacturonase actividades poligalacturonasa, el punto ptimo para las variables de proceso para la actividad poligalacturonasa fue 66.13 h ml -1 g -1 para la aireacin y el 12,8 gg -1 para la pectina; los valores ms altos de actividad PMG se obtuvieron con 40.0 h ml -1 g -1 para la aireacin y el 15,0 gg -1 para pectina.