UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA

DIVISIN DE CIENCIAS BIOLGICAS Y DE LA SALUD. DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLIGA.

Contribucin al estudio bioqumico del zigomiceto

IDONEA COMUNICACIN DE RESULTADOS Que para obtener el grado de Especializacin en Biotecnologa. PRESENTA

I.B.I Hctor Hugo Len Santiesteban.

ASESORA: Dra. Araceli Tomasini Campocosio.

Enero 2008.

DEDICATORIA

A MIS PADRES. Martha Alicia Santiesteban Mesa y Jos Guillermo Len Lara.
Por todos los sacrificios que han hecho para que yo pueda realizar mis metas y por todo el amor que siempre me han brindado.

A MIS ABUELOS. Margarita Lara Machuca, Rosenda Len Contreras y Ardelio Len Contreras.
Por su apoyo incondicional, por su comprensin, por su invaluable amor, por impulsarme a seguir adelante en la vida y principalmente, por nunca dejar de creer en m.

A MIS HERMANOS. Ana Laura Len Santiesteban y Guillermo Len Santiesteban.

Por brindarme innumerables horas de felicidad cuando ms lo necesitaba.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a la doctora Araceli Tomasini Campocosio, por asesorar esta tesis, compartir su conocimiento conmigo y por confiar en m.

Al doctor Francisco Jos Fernndez Perrino, por la asesora en la parte de Biologa Molecular de esta tesis.

Al doctor Octavio Loera Corral, por su disposicin e invaluable aportaciones en la revisin de este trabajo.

A Tania, Maura, Roxana, Sandra, Jess y Jaime, por su amistad y por todos los consejos que me han dado desde el momento en que llegu al laboratorio.

RESUMEN

Con el paso del tiempo el hombre ha buscado la manera de satisfacer ciertas necesidades, creando productos a partir de compuestos qumicos sintticos que no se encontraban normalmente en la naturaleza, los llamados xenobiticos. Los compuestos xenobiticos tambin pueden formarse eventualmente durante algunos procesos industriales y son eliminados al ambiente como desechos. En los ltimos aos el uso indiscriminado de xenobiticos a causado la contaminacin del medio ambiente, debido a que muchos de estos xenobiticos presentan propiedades txicas para muchos organismos, incluyendo al hombre; de ah la necesidad de eliminarlos. Unos de los mtodos ms eficientes para la eliminacin de los compuestos xenobiticos ha sido la degradacin con microorganismos que cuenten con sistemas enzimticos capases de degradar este tipo de txicos. Entre los xenobiticos ms recalcitrantes y txicos se encuentra el pentaclorofenol (PCF). El PCF pertenece a la familia de los clorofenoles, fue el primer producto usado como conservador de maderas, tambin ha sido utilizado como agente bactericida, fungicida y alguicida e insecticida y se forma en los de efluentes de la industria de la pulpa y el papel. Se han encontrados hongos pertenecientes a la familia de los basidiomicetos capaces de degradar compuestos fenlicos, gracias a que tienen sistemas enzimticos constituidos por peroxidasas (MnP, LiP, VP) y fenoloxidasas (lacasas) extracelulares, mostrando rendimientos altos de degradacin pero muy bajas velocidades de crecimiento. Sin embargo, se han encontrado otro tipo de hongos filamentosos capaces de degradar compuestos fenlicos, con velocidades de crecimiento mayores a los basidiomicetos, estos hongos pertenecen a la familia de los zigomicetos. En los zigomicetos los principales complejos enzimticos responsables de la degradacin del compuestos fenlicos son las fenoloxidasas (tirosinasa y lacasa) y no presentan actividades de peroxidasas. Podra pensarse, por lo tanto, que un zigomiceto que presentara actividad enzimtica extracelular de peroxidasas podra ser ms eficiente en la degradacin de compuestos fenlicos; como el PCF.

En este trabajo se utiliz a un zigomiceto aislado de un efluente de un aserradero de Puebla, que poda tolerar y degradar del 80 al 90% PCF inicial (12.5 mg ml-1, concentracin inicial de PCF) en las primeras 48 horas. A este zigomiceto se le nombr como . Pruebas iniciales de tipo cualitativas mostraron que el zigomiceto mostraba actividad enzimtica de tirosinasa y LiP extracelular.

Se identific molecularmente al zigomiceto como Rhizopus oryzae ENHE. Se demostr mediante fermentaciones sumergidas en medio sinttico Merlin-Norkrans (modificado), que el PCF tiene un efecto txico en el crecimiento de R. oryzae ENHE, igualmente el PCF tiene un efecto negativo en la actividad de tirosinasa extracelular, disminuyendo su actividad en 3.33 veces y un efecto nulo en la actividad de tirosinasa intracelular. Tambin se demostr que la Tyr induce el crecimiento de R. oryzae ENHE en un 11% a las 24 h en los cultivos con 0.05 g L-1 Tyr, se increment la actividad de tirosinasa extracelular alrededor de 14% a las 48 h de cultivo con Tyr y se aument 1.37 veces la actividad de tirosinasa intracelular en los cultivos con 0.05 g L-1 Tyr en las primera 24 h. Por ltimo, se demostr que R. oryzae ENHE tiene actividad enzimtica de LiP y se observ que el PCF induce la actividad de LiP. No se encontr actividad de MnP.

NDICE.
CAPITULO.
PGINA

INTRODUCCIN.
Generalidades o marco terico. Clorofenoles. Efectos txicos del PCF. Degradacin del PCF. 1 1 2 2 6 7

ANTECEDENTES. HIPTESIS Y OBJETIVOS. MATERIALES Y METODOS.

Microorganismo. Propagacin del zigomiceto . Suspensin de esporas. Conservacin del zigomiceto . Extraccin del ADN del zigomiceto . Electroforesis de ADN en geles de agarosa. Identificacin molecular del zigomiceto . Reaccin en cadena de la ADN polimeraza (PCR). Purificacin de la Banda de ADN. Fermentacin sumergida. Cintica de degradacin de PCF.

8 8 8 8 8 11 12 13 16 17 17

TECNICAS ANLITICAS.
Crecimiento. Extraccin del PCF. Cuantificacin del PCF residual. Cuantificacin de la actividad enzimtica intra y extra celular. Determinacin de protena soluble. 18 18 19 19 23

RESULTADOS Y DISCUSIN.
Identificacin molecular del zigomiceto . Efecto del PCF en el crecimiento y en la actividad de Tirosinasa. Efecto de la Tirosina (Tyr) en el crecimiento y en la actividad de Tirosinasa. Actividad enzimtica de peroxidasas extracelulares. Relacin de la LiP en la degradacin del PCF. 25 26 30 33 35 37

CONCLUSIONES.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. ANEXO.

38 42

INTRODUCCIN.

GENERALIDADES O MARCO TERICO. En los ltimos aos se han desechado fenoles y compuestos derivados de ste al medio ambiente de forma descontrolada. Algunos clorofenoles son xenobiticos, es decir no existen naturalmente, han sido creados por el hombre para algn uso especfico, por ejemplo como pesticidas, o bien son desechos de procesos industriales, como en los efluentes de la industria de la pulpa y el papel. La mayora de estos compuestos fenlicos son txicos para diversos sistemas biolgicos. Por lo tanto, los investigadores han estudiado microorganismos que los degraden.

CLOROFENOLES. Dentro de la familia de los clorofenoles se encuentra el pentaclorofenol (PCF, Figura 1); que fue el primer producto usado en los aos 30s como conservador de maderas y ha sido utilizado por muchos aos como agente fungicida, bactericida, alguicida e insecticida (Crosby, 1981). El uso indiscriminado del PCF ha causado la contaminacin de suelos, mantos acuferos y aguas subterrneas (Takashi et al., 2004.); que pueden llevar est txico a contaminar flora y fauna del medio, as como al hombre. Su degradacin es difcil ya que este compuesto tiene en su estructura un anillo aromtico estable y alto contenido en cloro (Xiao-yun et al., 2006).

Figura 1. Molcula del pentaclorofenol (PCF).

EFECTOS TXICOS DEL PCF. El PCF es considerado como uno de los contaminantes de mayor prioridad en algunos pases (Arcand et al., 1995) y es calificado por el USEPA como un probable cancergeno humano (Karamanev et al., 1997). La caracterstica hidrofbica que presenta el PCF le permite atravesar la membrana plasmtica y penetrar a las clulas. Existen evidencias de que el mecanismo txico de este compuesto se ejerce al desacoplar la fosforilacin oxidativa en las mitocondrias (Igisu et al., 1993). Tambin provoca otras alteraciones de las membranas como son la disminucin en los niveles de ciertos fosfolpidos, cambios en la permeabilidad a los iones H+ y prdida de la resistencia elctrica. En exposicin accidental al PCF, en bajos niveles, produce quemaduras en la piel e irritacin en la nariz y garganta (Crosby, 1981). El pentaclorofenol se absorbe bien a travs de la piel, el pulmn y el tracto gastrointestinal. En animales la dosis letal (DL50) drmica es de la misma magnitud que la oral. En exposiciones agudas, es rpidamente excretada, principalmente en la orina, como PCF inalterado y como PCF glucurnico. En exposiciones crnicas, se ha informado que su vida media de eliminacin ha sido muy prolongada, de hasta 20 das. El PCF es ampliamente distribuido a otros tejidos del cuerpo, incluyendo riones, corazn, y glndulas suprarrenales (Marcial et al., 2002).

DEGRADACIN DE PCF. El mtodo biolgico para la degradacin del PCF ha sido ampliamente estudiado, pueden emplearse plantas, bacteria y hongos. Los hongos son capaces de degradar compuestos aromticos y algunos compuestos xenobiticos txicos, los ms estudiados han sido los basidiomicetos que son capaces de degradar compuestos aromticos txicos, como el PCF entre los cuales encontramos a el Phanerochaete crhysosporium, Lentinus, Pleurotus, y Trametes, (Reddy et al., 1995; Okeke et al., 1996; Fahr et al., 1999), siendo el ms estudiado el Phanerochaete crhysospurium (Reddy et al., 1995). Se observ que estos hongos pueden degradar a la lignina, el polmero aromtico ms abundante en la

naturaleza; esta lignina puede ser despolimerizada y mineralizada eficientemente por basidiomicetos, principalmente los de pudricin blanca (Papinutti y Forchiassin., 2003).

Las oxidasas (lacasa (E.C:1.10.3.2)) y peroxidasas extracelulares tienen un papel principal en la degradacin de la lignina (Ha et al., 2001). Las principales peroxidasas encontradas en basidiomicetos son: Lignina peroxidasa (LiP) (E.C:1.11.1.14), Manganeso peroxidasa o manganeso dependiente de peroxidasa (MnP) (E.C:1.13.1.13) y peroxidasa verstil (VP). Entre los basidiomicetos ms estudiados productores de peroxidasas extracelulares se encuentra Phanerochaete chrysosporium (Aitken e Irvin, 1989; Lisov et al., 2007) que tiene la capacidad de degradar clorofenoles (Durn et al., 2002), colorantes tipo azo (Christian et al., 2005), compuestos aromticos policclicos (Rothschild et al., 2002), por mencionar algunos. La oxidacin se da en gran parte debido a la poca especificidad que tienen estas enzimas por los sustratos, se ha encontrado que no necesariamente LiP y MnP tienen que expresarse al mismo tiempo, la expresin enzimtica depende principalmente de la composicin del medio por ejemplo por la limitacin de nitrgeno, (Lin y Wang, 1990) y puede variar dependiendo del basidiomiceto (Ha et al., 2001). Desde los aos 80s la idea de utilizar peroxidasas y lacasas para la oxidacin y degradacin de xenobiticos se ha llevado acabo teniendo dos formas potenciales de detoxificar las aguas: 1) Despus de la oxidacin de los compuestos fenlicos, estos forman radicales que pueden polimerizarse formando polmeros no solubles que pueden ser removidos por filtracin o precipitacin (Kauffmann et al., 1999). 2) Los compuestos fenlicos son oxidados por una serie de pasos enzimticos hasta posiblemente su mineralizacin (Rabinovich et al., 2004). La degradacin del PCF no ha sido exclusiva de los basidiomicetos se han encontrado otro tipo de hongos filamentosos pertenecientes a los zigomicetos capases de degradar PCF. En algunos casos la ventaja de estos hongos radica en una mayor velocidad de crecimiento por lo tanto el proceso de degradacin puede ser ms corto y por ende ms econmico. Se ha visto tambin que los zigomicetos 3

degradan compuestos aromticos debido a sus sistemas enzimaticos constituido principalmente de fenoloxidasas (Tomasini et al., 1996), entre la que destaca la tirosinasa. Amylomyces rouxii es uno de los zigomicetos capaces de degradar el PCF en primera instancia por medio de tirosinasa (Montiel et al., 2004), degrada el 86% del PCF inicial (12.5 mg L-1) en 96 h. La tirosinasa (Tyros) (monofenol, o-difenol-oxgeno oxidoreductasa; polifenol oxidasa; EC1.14.18.1) cataliza dos reacciones dependientes de oxgeno las cuales ocurren consecutivamente:

La o-hidroxilacin de monofenol a o-difenol, actividad cresolasa o monofenolasa, y la subsiguiente oxidacin de o-difenol a o-quinona, actividad catecolasa o difenolasa, (Figura 2). (Durn et al., 2002, Boshoff et al., 2003, Haghbeen y Tan., 2003). El sitio activo de la tirosinasa consta de un par de complejos bi-nucleares de cobre y tres estados met (Em), deoxy (Ed), y oxi (Eo)

Figura 2. Reaccin catalizada por fenol oxidasa (Haghbeena y Tan., 2003)

La produccin de melanina es la principal responsable de color de epidermis en humanos y mamferos. La sntesis de melanina comienza con la conversin del aminocido L-tirosina a 3,4-dihidroxifenilalanina (L-dopa) y la subsiguiente oxidacin de la L-dopa a dopaquinona por la accin de tirosinasa (Figura 3), (Ohguchi et al., 2003).

Figura 3. Conversin de L-tirosina a pigmentos biolgicos catalizada por tirosinasa (Rodriquez. y Flurkey, 1992.)

La tirosinasa tambin es responsable de catalizar la oxidacin de compuestos fenlicos a sus correspondientes quinonas y provocar el obscurecimiento de frutas y vegetales; cambiando el color y sabor (Yu., 2003). En estudios recientes se ha encontrado la posibilidad de tratar aguas contaminadas con compuestos fenlicos con tirosinasa provenientes de microorganismos. Los compuestos fenlicos son oxidados a quinonas las cuales al ser muy reactivas forman radicales fenlicos que se polimerizan fcilmente (Lee et al., 1996); eliminando la contaminacin por precipitacin o filtracin de polmeros aromticos de alto peso molecular.

ANTECEDENTES.

En el laboratorio de ingeniera gentica y metabolismo secundario se aislaron aproximadamente 20 cepas de hongos filamentosos a partir de suelo de un aserradero de Puebla. De estas cepas se seleccion un zigomiceto, nombrado como que demostr capacidad para tolerar y crecer en concentraciones iniciales de PCF de hasta 100 mg L-1 (Bernal, 2005). Los estudios realizados por Len-Santiesteban, (2006) demostraron que el zigomiceto puede degradar en las primeras 48h de fermentacin el 90.6% del PCF presente en el medio, conteniendo 12.5 mg PCF ml-1 inicial, obtenindose as una tasa de degradacin de 0.34 mg PCF (mg biomasa h)-1. Esto estudios se realizaron con medio Merlin-Norkrans modificado y diluido a la mitad (Len-Santiesteban, 2006). Se demostr que en el medio diluido se obtiene una degradacin del PCF ms rpida y eficiente en comparacin con los estudios de degradacin de PCF realizados con medio Merlin-Norkrans sin diluir (Bernal, 2005), donde se demostr que esta cepa degrada el 80.6% de PCF presente en el medio (12.5 mg PCF ml-1 inicial) a las 72h, con una tasa de degradacin del 0.14 mg PCF (mg biomasa h)-1.

Tambin se determin cualitativamente la presencia de actividad enzimtica extracelular de peroxidasas (Manganeso y Lignina) y de fenoloxidasas (Lacasas y tirosinasas) producidas por el zigomiceto . Las pruebas dieron resultado positivo para Lignina peroxidasa (LiP) y para tirosinasa. La actividad de lacasa no se observ con la prueba empleada. Por lo que se sugiere montar otra tcnica cualitativa para confirmar si efectivamente el zigomiceto produce o no lacasa extracelular.

HIPOTESIS.
El zigomiceto intracelulares. produce mayor actividad de fenoloxidasas y peroxidasas extracelulares que

OBJETIVO GENERAL.
Identificar al zigomiceto y comparar las actividades intra y extracelulares de peroxidasas y tirosinasa.

OBJETIVOS PARTICULARES.
Identificar al zigomiceto , por tcnicas moleculares. Cuantificar la actividad intra y extracelulares de la(s) fenoloxidasa(s) producidas por el zigomiceto . Cuantificar la actividad extracelular de lignina peroxidasa (LiP) y manganeso peroxidasa (MnP) producida por el zigomiceto .

METODOLOGA.

MICROORGANISMO. La cepa del zigomiceto , fue aislada de suelos contaminados de un aserradero en puebla.

PROPAGACIN DEL zigomiceto . La cepa se propag en agar PDA (Agar Dextrosa y Papa) 39 g L-1. Se colocaron 40 ml de PDA en matraces Erlenmeyer de 250 ml, los cuales se inocularon con 0.5 ml de suspensin de esporas de zigomiceto y se incub a 30C hasta su esporulacin (3 a 4 das).

SUSPENSIN DE ESPORAS. A los matraces ya esporulados se les aadi una solucin de tween 80 al 1% en agua estril, se les someti a agitacin suave y lenta con una barra magntica el tiempo necesario para suspender la mayora de las esporas.

CONSERVACIN DE zigomiceto . La suspensin concentrada de esporas se guard en viales de 1.5 ml con glicerol al 40% y se mantuvieron en congelacin a -20C.

EXTRACIN DE ADN DEL zigomiceto . Este procedimiento se inici desde el crecimiento del hongo para obtener micelio. La extraccin del ADN se hizo de acuerdo a la metodologa de Fernndez (1997).

Se inocularon 250 ml de medio PMY con 1x106 esporas del zigomiceto ml-1 y se incubaron durante 48 h a 30C y 200 rpm. Despus del crecimiento del micelio, se filtr el medio a travs de tela Nytal estril. El micelio obtenido despus del filtrado se lav con 250 ml de solucin fisiolgica (NaCl estril al 0.9%) y posteriormente con 250 ml de tampn A.

MEDIO PMY. Para un litro de medio se adicion: 40g de glucosa, 3g de NaNO3, 2g de extracto de malta, 0.2g de KCl, 0.5g de MgSO47H2O y 0.01g de FeSO47H2O. Se ajust el pH a 6.0.

TAMPN A: EDTA 100 mM pH 8.0, NaCl 150 mM y Tris-HCl 50 mM pH 8.0

Despus del lavado, se elimin la humedad del micelio con papel filtro estril. Ya retirada la humedad se coloc el micelio seco en una caja Petri desechable estril, se refriger a -80C hasta conseguir la congelacin total.

Una vez congelado el micelio, se liofiliz para eliminar humedad. El micelio despus de liofilizado se pulveriz en un mortero estril. El polvo obtenido se guard en tubos Eppendorf de 1.5 ml hasta un volumen de 0.5 ml del tubo (aproximadamente 100 mg de micelio pulverizado), conservndose a -20C hasta su uso.

Para la extraccin de ADN se agreg a los tubos con polvo de micelio 0.5 ml de tampn de ruptura I, se homogeniz la muestra y posteriormente se aadi 0.5 ml de fenol neutro y 0.5 ml de CIA. Se mezclaron con suavidad, y se incubaron a 50C durante 20 minutos. A los diez minutos de incubacin se mezcl con suavidad de nuevo la mezcla.

TAMPN DE RUPTURA I: EDTA 100 mM pH 8.0, SDS al 1% (p/v) y Tris-HCl 0.2M. Se ajust el pH a 8.2 con HCl.

FENOL CIDO. Se mezclaron 500 ml de fenol slido con 500 ml de H2Od, se agit y se dej reposar 24 horas en un frasco mbar a 4C, posteriormente se retir la fase superior acuosa.

FENOL NEUTRO. Se mezclaron 4 volmenes de fenol cido con un volumen de Tris-HCl 1M pH 8.0. Se mantuvo la mezcla en reposo hasta que se separ la fase acuosa de la fase fenlica. Los lavados con Tris-HCl 1M pH 8.0 se realizaron hasta obtener un pH cercano a 7.0. Este fenol se conserv a 4C en recipientes protegidos de la luz.

CIA: Por cada 24 volmenes de cloroformo se puso 1 volumen de alcohol isoamlico. Transcurrido el tiempo de incubacin, se centrifugaron las muestras a 14,000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. Despus de la centrifugacin se formaron dos fases, una acuosa (superior) y una fenlica (inferior). Se recuper la fase acuosa para ser desproteinizada mediante extracciones sucesivas con fenol-CIA hasta que se obtuvo una fase limpia (se necesitan de 6 a 7 extracciones). Posteriormente se hizo una nueva extraccin con CIA al mismo volumen de la fase acuosa, se mezcl, centrifug y se extrajo la fase acuosa, que se coloc en un tubo Eppendorf nuevo y estril. A la fase acuosa recuperada se agregaron 0.7 volmenes de isopropanol y se incub a 4C durante 1 da. Despus de este tiempo se centrifugaron las muestras a 14,000 rpm durante 15 minutos a 4C, se tir el sobrenadante y al precipitado se le agreg 1 ml de etanol al 70% (v/v). Finalmente se mezcl y centrifug el precipitado con el etanol a 14,000 rpm durante 5 minutos, se tir el sobrenadante y se dej secar el precipitado. Al precipitado seco se le agreg 20 L de TE y se conserv a -20C. 10

Fenol-CIA: Se mezclaron volmenes iguales de fenol neutro y de CIA

TE: EDTA 1mM (pH 8.0) y Tris-HCl 10 mM (pH 8.0)

ELECTROFORESIS DE ADN EN GELES DE AGAROSA. La electroforesis es una tcnica analtica de separacin de macromolculas. La separacin tiene lugar debido a la diferente movilidad que presentan las macromolculas cargadas cuando son sometidas a la influencia de un campo elctrico. Los cidos nucleicos son macromolculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura por lo que migraran a travs de un gel hacia el polo positivo cuando se establece una corriente elctrica. Se emplearon geles de agarosa (Promega), en concentraciones de entre el 0.3 y el 2 % (p/v), disueltas en tampn TEA 50x por calentamiento en microondas y vertidas para su gelificacin en cmaras del tamao adecuado. La concentracin de agarosa utilizada depende del tamao del fragmento de ADN a separar y se describen en la siguiente tabla:
CONCENTRACIN DE AGAROSA ( %) TAMAO DE LOS FRAGMENTES DE ADN SEPARADOS

0.3 0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0

5-60 kpb 1-30 kpb 0.8-12 kpb 0.5-10 kpb 0.4-7 kpb 0.2-3 kpb 0.05-2 kpb

TEA 50x: 57.1 ml de cido actico glaciar, 100 ml de EDTA 0.5 M (pH 8.0), 242 g de Tris base y H2Od hasta completar un litro. Las muestras de ADN se mezclaron con agua destilada estril (para ajustar el volumen final a 20 L) y un dcimo del volumen fina de tampn de carga concentrado. Los volmenes de ADN, tampn de carga y H2Od fueron:

11

MUESTRA

H2OD

ADN

TAMPN DE CARGA 6X

VOLUMEN FINAL

Marcador

15 L 13 L

3 L 5 L

2 L 2 L

20 L 20 L

Tampn de carga 6x: Azul de bromofenol al 0.25% (p/v), Sacarosa al 40% (p/v) y Xileno cianol al 0.25% (p/v). Se esteriliz durante 20 minutos.

Las muestras de ADN preparadas se calentaron durante 10 minutos a 65C, enfrindose posteriormente en bao de hielo y agua durante 3 minutos. Las muestras de ADN fueron cargadas en los pocillos del gel y la electroforesis se llev acabo en tampn TEA mediante la aplicacin de una diferencia de potencial de entre 1 y 5 voltios cm-1. El ADN se ti con una solucin de bromuro de etidio (BrEt) en una concentracin final de 0.5 g ml-1.

Bromuro de etidio: Se prepar una solucin de 10 mg ml-1 en agua y se conserva a 4C. Para un litro de agua se requieren 50 L de esta solucin.

El bromuro se intercala en la doble cadena del ADN y emite fluorescencia tras iluminarse el gel con luz ultravioleta, utilizando un equipo de foto-documentacin Gel Doc II (Bio-Rad).

Se utiliz ADN del fago digerido con la enzima EcoRI como marcador.

IDENTIFICACIN MOLECULAR DEL zigomiceto . Para la identificacin molecular del zigomiceto se amplificaron los genes ribosomales y sus espacios transcritos internos (ITS) (Carvahalho., 2005); ya que estas regiones tienen una organizacin conservadora en el genoma de todos los eucariontes, tiene un gran nmero de copias (lo que facilita su amplificacin) y tiene regiones muy conservadas en los genes: 18S, 5.8S y 28S (Kenneth et al., 1998)

12

(Figura 4) que estn separadas por secuencias divergentes, muy variables, polimorfitas en longitud y en secuencia, por lo tanto, son muy informativas y representan una huella genmica para cada hongo.
ITS5

18 S

ITS1

5.8 S

ITS2

28 S
ITS4B

Figura 4. Esquema de la regin del ADN para los genes del rRNA que fueron amplificados por PCR para la identificacin del zigomiceto . Los genes codificantes del rRNA se representan dentro de los rectngulos y las zonas en blanco representan las regiones de los espacios transgnicos internos. Las flechas simbolizan la localizacin y los cebadores utilizados para la amplificacin.

Se ha demostrado que la variabilidad en la secuencia observada en las dos regiones ITS de los genes ribosomales que separan la pequea subunidad ribosomal 5.8S, han sido determinantes para distinguir un hongo de otro. Esta zona, para hongos tiene un tamao de 650 a 900 pb (incluye al gen 5.8S) (Rodrguez-Tovar et al., 2004). La secuencia obtenida del gen ITS, se puede buscar en el banco de genes (GenBanK), o en la base de batos de nucletidos del EMPL (European Molecular Biology Laboratoty) con el fin de identificar a hongos dentro de una especie o al menos en un grupo de especies (Rodrguez-Tovar et al., 2004).

REACCIN EN CADENA DE LA ADN POLIMERASA (PCR). Esta tcnica se basa en la separacin de ambas hebras de ADN, la posterior unin de pequeos fragmentos (denominados primers) y la extensin de estos fragmentos usando de molde el ADN de la muestra. As se obtienen dos copias idnticas por cada molcula en cada ciclo de reaccin. Para llevar a cabo esta reaccin se requiere de una enzima polimerasa que sea capaz de soportar la alta temperatura del proceso de desnaturalizacin. Esta enzima es una ADN-polimerasa especial obtenida de una bacteria termfila llamada Thermus aquaticus.

13

La mezcla de reaccin se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalizacin, una de hibridacin o alineacin y una de elongacin.

1. Desnaturalizacin: La desnaturalizacin permite la separacin de las dos hebras del ADN, mediante el calentamiento a una temperatura elevada (92-96C), que debe ser superior a la temperatura de fusin de la regin del ADN que se requiere amplificar. 2. Hibridacin de los cebadores: Permite, mediante la disminucin de temperatura (37 a 67 C), la reaccin de las hebras sencillas tras la desnaturalizacin trmica. Se requiere un enfriamiento rpido por debajo de la temperatura de fusin del ADN, de forma que permita la hibridacin de las hebras sencillas del ADN con los oligonucleotidos cebadores. Los cebadores o primers (oligonucleotidos sintticos) tienen secuencias complementarias, respectivamente, a los dos extremos 3 de la regin del ADN diana, uno en cada hebra. La distancia entre ellos en el conjunto ADN-cebadores determinar la longitud de la secuencia de ADN amplificada. 3. Elongacin (o replicacin) a partir de los cebadores: Esta es la etapa de amplificacin de las hebras sencillas de ADN por una ADN polimerasa termoestable a partir de los cebadores (72 a 75C). La enzima ms empleada se llama Taq polimerasa, por proceder de la bacteria Thermus aquaticus , que vive en manantiales de agua caliente. El sustrato para la sntesis de las innumerables copias del ADN son los cuatro dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), que deben ir acompaados de Mg2+ como cofactor.

En la tcnica de reaccin en cadena de ADN polimerasa cada conjunto de estos tres pasos (desnaturalizacin, hibridacin, replicacin) constituye un ciclo (Figura 5).

14

Figura 5. Esquema de la reaccin en cadena de ADN polimerasa.

A medida que aumenta el nmero de ciclos el producto de la elongacin pasa a ser la molcula diana a las que debe unirse perfectamente las molculas del cebador presentes en la mezcla, conduciendo a una acumulacin terica del producto. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. Se prepararon en tubos Ependorf de 200 L la siguiente mezcla de reaccin, en un bao de hielo y agua:
CONCENTRACIN INICIAL (SOLUCIN STOCK) ADN molde ADN polimerasa Buffer Mg2Cl dNTPs Cebador ITS4b Cebador ITS5 dH2O Volumen final CONCENTRACIN FINAL MASTER MIX VOLUMEN DE REACCIN

----50 unidades L-1 10x 50 mM 10 mM 20 M 20 M ---------

----2.5 unidades L-1 1x 2.5 mM 200 M 1 M 1 M ---------

----2 L 20 L 10 L 4 L 10 L 10 L 140 L 196 L

1 L* 0.5 L 5 L 2.5 L 1 L 2.5 L 2.5 L 35 L 50 L

1 L 0.5 L 5 L 2.5 L 1 L 2.5 L 2.5 L 35 L 50 L

1 L 0.5 L 5 L 2.5 L 1 L 2.5 L 2.5 L 35 L 50 L

*Dilucin del ADN 1/100 (1 L de ADN en 99 L de dH2O). Dilucin del ADN 1/50 (1 L de ADN en 50 L de dH2O). ADN concentrado. 15

A las mezclas de reaccin ya preparadas se les someti primero a 1 ciclo a 94C durante 2 minutos, posteriormente se les someti a 30 ciclos como se describen a continuacin:

1. 2. 3.

Desnaturalizacin: 94C 45 segundos. Hibridacin: 55C 45 segundos. Elongacin: 72C 45 segundos.

Despus de los 30 ciclos descritos anteriormente; se realiz un ciclo ms de 5 minutos a 72C y por ltimo un ciclo de 3 minutos a 4C.

Para ver el segmento de banda codificado se realiz una electroforesis en gel de agarosa al 0.7%, con un marcador comercial 1 kb ADN Ladder (Promega) de 250 a 10,000 pares de bases, como el que se muestra en la siguiente figura:

PURIFICACIN DE BANDA DE ADN. La purificacin de ADN se realiz con el kit Wizard SV and PCR Clean-Up System de Promega.

16

FERMENTACIN SUMERGIDA. Se prepar medio sinttico Merlin-Norkrans modificado. Se adicionaron 50 ml de medio Merlin-Norkrans (modificado) estril a matraces Erlenmeyer de 250 ml previamente esterilizados y se inocularon con 1x106 esporas ml-1. Los matraces inoculados se mantuvieron en incubacin a 30C con agitacin de 200 rpm. Despus de las primeras 24 horas de incubacin se adicion PCF a una concentracin inicial de 12.5 mg L-1. Paralelamente se prepararon cultivos control, libres de PCF.

MEDIO MERLIN-NORKRANS (MODIFICADO) Composicin del medio Merlin-Norkrans en g L-1: 10g de glucosa, 2g de extracto de Malta, 1g de extracto de levadura, 0.5g de KH2PO4, 0.15g de MgSO47H2O y 0.5g de (NH4)2HPO4. Se adicion al medio una solucin buffer de citratos (pH 5.5) (Bernal, 2005). Para un litro de medio es necesario 500 ml de H2O y 500 ml de buffer de citratos (pH 5.5) (relacin 50:50).

SOLUCIN BUFFER DE CITRATOS (pH 5.3-5.8) Solucin A: cido ctrico monohidratado 0.1M Solucin B: Citratos de sodio 0.1M

Para llegar a pH 5.3-5.8 se adicionaron 13.7 ml de la solucin A, 36.3 ml de la solucin de B, y se afor a 100 ml con agua destilada

CINETICA DE DEGRADACIN DE PCF. La cintica de degradacin de PCF se realiz en una a la fermentacin sumergida. Se tomaron muestras cada 24 horas hasta las 72 horas. A las muestras obtenidas se les determin: pH, biomasa, se cuantific PCF residual y se tomaron extractos libres de biomasa (medio de cultivo) y extractos de biomasa para la determinacin de las actividades enzimticas.

17

TECNICAS ANLITICAS.

CRECIMIENTO Cada muestra se filtr al vaci para separar el medio de cultivo del micelio (biomasa). El medio de cultivo se consider como extracto libre de biomasa. La biomasa se sec a 75C durante 24 horas, por diferencia de peso se cuantific el peso seco de la biomasa.

EXTRACCIN DE PCF

EXTRACTO LIBRE DE BIOMASA (DIRECTO) Se tomaron 40 ml de medio de cultivo, libre de biomasa, se le ajust el pH a 7.0 y este extracto de utiliz para determinar el PCF residual que queda en el medio de cultivo.

EXTRACTO DE BIOMASA El micelio recuperado se resuspendi en 25 ml de una solucin buffer de carbonatos pH 10.6, se sonic en un Sonicador Branson Ultrasonics 1210 durante 25 minutos para los tiempos 0, 24, 48 horas y 90 minutos para las 72 horas. El micelio sonicado se volvi a filtrar al vaco. Al extracto sonicado, libre de biomasa, se le ajust el pH a 7.0 y se utiliz para determinar el PCF residual adherido a la pared celular de zigomiceto .

SOLUCIN BUFFER DE CARBONATOS (pH 10.6) Solucin I: Carbonato de sodio anhidro 0.2M Solucin II: Bicarbonato de sodio 0.2M

18

Para llegar a un pH 10.6 es adicionaron 42.5 ml de solucin I, 7.5 ml de solucin II y se afor a 200 ml con agua destilada.

CUANTIFICACIN DE PCF RESIDUAL Para la determinacin cuantitativa de PCF residual se centrifugaron durante 15 minutos los extractos directos y libres de biomasa a 1400 rpm. Los extractos se filtraron en una membrana de 0.22m de tamao de poro y se inyectaron al HPLC. Se utiliz una columna C-18 en fase reversa, -Bondapack WATERS empacada con Rusil C-18 (18nm), el PCF se separ en la columna con una solucin de 1% de cido actico en agua milliQ y una solucin de 1% de cido actico en acetonitrilo (75:25) con un flujo de 1.5 ml min-1. El PCF fue detectado por UV, en un Detector de UV 996 WATERS, a 240nm y los resultados obtenidos fueron analizados por computadora empleando el paquete

Millenium-WATERS.

CUANTIFICACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA INTRA Y EXTRACELULAR

EXTRACTO LIBRE DE BIOMASA (DIRECTO) Se tomaron 5 ml de medio de cultivo, libre de biomasa, de las muestras problema y se llevaron a una concentracin de 0.1mM de PMSF (phenylmethanesulphonyil fluoride) con una solucin Stock de 100 mM y se mantuvieron dentro de un bao de hielo (0-5C). Esta fraccin su utiliz para determinar las actividades enzimticas extracelulares.

OBTENCIN DE ENZIMAS INTRACELULARES El micelio recuperado despus de filtrar el medio de cultivo se resuspendi en 5 ml de buffer de fosfato de sodio 0.1M (pH 6.8) con 0.65M Sorbitol y 1mM de PMSF (Halaouli et al., 2005), mantenindose en un bao de hielo (0-5C). El micelio resuspendido se rompi con un Potter 19

(Homogenizador), posteriormente el micelio roto se centrifug a 7500 rpm por 1.5 horas. El sobrenadante obtenido, libre de micelio, fue el extracto intracelular.

SOLUCIN BUFFER DE FOSFATO DE SODIO 0.1M (pH 6.8) Solucin a: Fosfato de sodio monobsico 0.1M Solucin b: Fosfato de sodio bibsico 0.1M

Para llegar a un pH 6.8 es adicionaron 51 ml de solucin a, 49 ml de solucin b y se afor a 100 ml.

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD MONOFENOLSICA (TIROSINASA). Despus de obtener los extractos extracelulares e intracelulares se determin la actividad de tirosinasa (monofenolasa) con el mtodo espectrofotomtrico de hidrazona de Besthorn (Mazzocco and Pefferri, 1976). Este mtodo se basa en la condensacin de la hidrazona de Bensthorn con la quinona obtenida por la oxidacin enzimtica de pirocatecol.

La curva de calibracin se obtuvo por la oxidacin del fenol 0.5M con diferentes concentraciones molares de I2 (1x10-4 hasta 12x10-3M) en presencia de la hidrazona de Besthorn (MBTH) a pH 4.2 (solucin buffer de fosfato-ctrico 0.4M). Finalmente despus de un minuto de reaccin, sta se detuvo con cido sulfrico al 5% y acetona, midindose la absorbancia en un espectrofotmetro a 459nm. El volumen de reaccin fue de 1.5 ml y el volumen final fue de 3.25 ml.

Los volmenes usados para realizar la curva fueron:

20

REACTIVO

BLANCO (ml)

MUESTRA (ml)

Fenol 0.5 M 0.25 0.25 Buffer fosfato-ctrico pH 4.2 0.75 0.75 MBTH 0.25 0.25 I2 (1x10-4 hasta 12x10-3M) 0.25 0.25* H2SO4 5% 0.25 0.25 Acetona 1.5 1.5 *Volumen del extracto directo (actividad extracelular) o volumen del extracto de biomasa (actividad intracelular)

Con el fin de perfeccionar el mtodo empleado por Mazzocco and Pefferri (1976) se utiliz fenol como sustrato para la reaccin enzimtica, en lugar de catecol. Cada dilucin se realiz por triplicado (Anexo). SOLUCIN BUFFER FOSFATO-CITRATO 0.1M (pH 4.2). Solucin C: cido ctrico monohidratado 0.1M Solucin D: Fosfato de sodio dibsico 0.2M

Para llegar a un pH 4.2 es adicionaron 29.4 ml de solucin C, 20.6 ml de solucin D y se afor a 100 ml con agua destilada.

INCREMENTO DE LA ACTIVIDAD MONOFENOLASA DE TIROSINASA CON TIROSINA DISUELTA EN EL MEDIO. Se diluy en el medio Merlin-Norkrans diferentes concentraciones de tirosina (Tyr) con el fin de observar el posible incremento de la actividad monofenolasa de tirosinasa por est aminocido, debido a que se cree que acta como un potenciador de la tirosinasa. Las concentraciones de Tyr fueron: 0.025, 0.05 y 0.1 g L-1. Se utiliz como control el medio de cultivo sin Tyr.

ACTIVIDAD ENZIMTICA EXTRACELULARES DE LIGNINA PEROXIDASA (LiP). La actividad de lignina peroxidasa (LiP) se evalu por espectrofotometra UV a 310 nm (Maganhotto et al., 2005), mediante la deteccin del veratraldehdo (TM310=9300 M-1cm-1) producido 21

durante la oxidacin del alcohol vertatrlico (Figura 6). La mezcla de reaccin contena 375 L de buffer de tartato de sodio 0.33M (pH 3.0); 125 L de alcohol veratrlico 4mM; 50 L de perxido de hidrogeno 10 mM; 450 L de H2Od y 250 L de extracto directo, para tener un volumen final de 1250 L.

Figura 6. Oxidacin del alcohol veratrlico por LiP produciendo veratraldehido.

SOLUCIN BUFFER DE TARTATO DE SODIO 0.33M (pH 3.0). Para llegar a un pH 4.2 se adicionaron 3.911g de trtato de sodio, 2.401g de cido tartrico y se afor a 100 ml con agua destilada.

ACTIVIDAD ENZIMTICA DE MANGANESO PEROXIDASA (MnP). Se midi la actividad enzimtica de manganeso peroxidasa a 610 nm (TM610=4460 M-1cm-1) usando la metodologa descrita por Kuwahara et al., (1987). La mezcla de reaccin contena: 500 L de extracto directo; 100 L de rojo de fenol al 0.01 %; 100 L de lactato de sodio 250mM; 200 L de albmina bovina 0.5 %; 50 L de sulfato de magnesio 2mM y 50 L de peroxido de hidrgeno preparado en buffer succinato de sodio 20mM (pH 4.0).

22

Las reacciones de lignina y manganeso peroxidasa se mantuvieron en incubacin a 30 C durante 5 minutos y se interrumpieron la reacciones con adiccin 40 L de NaOH 2N.

SOLUCIN BUFFER DE SUCCINATO DE SODIO 20mM (pH 4.0). Solucin E: cido succinico 0.2M Solucin F: NaOH 0.2M

Para llegar a un pH 4.0 es adicionaron 25 ml de solucin E, 10 ml de solucin F y se afor a 100 ml con agua destilada.

DETERMINACIN DE PROTENA SOLUBLE A los extractos extracelulares e intracelulares se les cuantific la protena soluble por medio del microensayo de Bradford (Bradford, 1976). El mtodo de Bradford se basa en la unin no covalente del Azul de Coomassie a las protenas. El azul de Coomassie es un compuesto que presenta diferentes espectros de absorcin segn el estado de protonacin en el que se encuentra: la forma catinica es de color rojo-marrn (mximo de absorbancia a 470 nm), la neutra es verde (mximo a 650 nm) y la aninica es azul (mximo a 595 nm). La presencia de protenas favorece el desplazamiento del equilibrio hacia la forma aninica debido a la interaccin de los grupos sulfnicos del Coomassie con los grupos catinicos y las cadenas laterales de algunos residuos de aminocidos de las protenas (principalmente Arg y Lys), producindose entonces la coloracin azul que puede medirse a = 595 nm. La curva de calibracin se realiz con diferentes concentraciones de seroalbmina bovina, partiendo de una solucin Stock de 100 g ml-1. Las concentraciones de seroalbmina y los volmenes de dilucin fueron:

23

CONCENTRACIN FINAL DE PROTENA SEROALBMINA BOVINA (g ml-1)

VOLUMEN DE SOLUCIN STOCK DE SEROALBMINA BOVINA (L)

AGUA DESIONIZADA (L)

VOLUMEN DE ANLISIS (L)

0 2 4 6 8 10 12

0 20 40 60 80 100 120

800 780 760 740 720 700 680

800 800 800 800 800 800 800

Cada dilucin se realiz por triplicado. A cada tubo de las diluciones se le adicionaron 200 L del reactivo de Bradford (Bio-Rad), se homogenizaron con un vrtex y se dejaron reposar durante 5 minutos. Despus de terminado el tiempo de reposo se ley su absorbancia en un espectrofotmetro a 595 nm. Con las absorbancias obtenidas y las concentraciones de seroalbmina bovina de la curva de calibracin se pudo obtener los parmetros de la ecuacin de la recta

y = mx + b
Donde: y = Absorbancia x = Concentracin de protena (g ml-1) b = Ordenada al origen m = Pendiente de la recta. Para la determinacin de protena soluble de los extractos directos se agregaron 40 L del extracto libre de biomasa y se diluyeron en 760 L de agua desionizada en tubos de ensayo de 5 ml de capacidad adicionndoles 200 L del reactivo de Bradford. Posteriormente, se agitaron los tubos en un vrtex y se dejaron reposar por 5 minutos para despus medir su absorbancia a 595nm. La determinacin protena total en los extractos intracelulares se realiz de manera semejante a la descrita anteriormente, salvo que, en ste caso se tomaron solamente 10 L de stos extractos y se diluyeron en 790 L de agua desionizada (Anexo).

24

RESULTADOS Y DISCUSIN.

1. IDENTIFICACIN MOLECULAR DEL zigomiceto .

1.1 EXTRACCIN DE ADN DEL zigomiceto Se realiz como se describi en el apartado de metodologa. En la figura 1 se muestra una imagen del gel que contiene el ADN total del zigomiceto , junto con marcador molecular EcoRI.

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa 0.7 % del ADN total del zigomiceto . (1) Marcador de peso molecular EcoRI y (2) ADN total zigomiceto .

Despus de la extraccin de ADN total del zigomiceto , est se conserv a -20C, disuelto en TE.

1.2 AMPLIFICACIN POR PCR DE LA SECUENCIA ITS DEL rADN DEL zigomiceto . Las secuencias ITS se obtuvieron como se describi en el apartado de metodologa. La figura 2 muestra el gel de agarosa al 0.7% con los fragmentos de los productos del PCR, se obtuvo un fragmento de aproximadamente 700 pb, segn el marcador ADN Ladder 1kb.

25

750 pb 500 pb

Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa al 0.7 % con los productos del PCR del rADN del zigomiceto con los primer ITS4B e ITS5 para la amplificacin de las secuencias ITS que flanquean a los genes ribosomales. (1) Marcador de tamao 1kb ADN Ladder. (2) ADN de (concentrado). (3) Dilucin 1/50 del ADN total de .

1.3 PURIFICACIN DE BANDA DE ADN PARA LA SECUENCIACIN. Se cort la banda de aproximadamente 700 pb. Posteriormente se hizo la purificacin con el kit Wizard (SV and PCR Clean-Up System de Promega). Una vez purificada la banda de ADN, se mand secuenciar en el laboratorio de Biologa Molecular de la Universidad Autnoma Metropolitana campus Iztapalapa.

1.4 SECUENCIACIN DEL ADN DEL zigomiceto . El zigomiceto fue identificado fue identificado molecularmente como Rhizopus oryzae ENHE, con una identidad de 100% en 604 nucletidos.

2. EFECTO DEL PCF EN EL CRECIMIENTO Y EN LA ACTIVIDAD DE TIROSINASA.

2.1. Crecimiento. En el grfico 1 se muestra el perfil de crecimiento de R. oryzae ENHE en medio Merlin-Norkrans (modificado) con 12.5 mg L-1 de PCF; adicionndolo a las 24 h de fermentacin, despus de germinadas las esporas. Se tom como control el crecimiento de R. oryzae ENHE en Merlin-Norkrans (modificado) pero sin PCF. 26

4 3,5 3 mg Biomasa / ml 2,5 2 1,5 1 0,5 0 24 Tiempo (h) 48 72 Grfico 1. Cintica de crecimiento de R. oryzae ENHE en medio Melin-Norkrans (modificado) con y sin PCF. ( ) Control sin PCF, () con PCF. 0

La mxima produccin de biomasa fue de 2.87 mg ml-1 en el control y de 2.44 mg ml-1 en el cultivo con PCF, a las 24 h. Mostrando 1.17 veces mayor crecimiento en el cultivo control en comparacin con el cultivo con PCF. Resultados parecidos a los obtenidos con A. rouxii (Tomasini et al., 2001) en donde se observaba que el PCF tiene un efecto txico sobre el crecimiento. La tabla 1 resume los resultados obtenidos.
Tabla 1. Biomasa de R. oryzae ENHE cuantificada por peso seco en mg ml-1 con y sin PCF (control).
Biomasa (mg ml-1) Tiempo (h) CONTROL (sin PCF) Con 12.5 mg PCF L-1

0 24 48 72

0 2.87 2.98 3.31

0 2.44 2.45 2.82

2.2 Actividad especfica de tirosinasa extracelular e intracelular. Las actividades especfica de R. oryzae ENHE se calcularon relacionando la actividad volumtrica de tirosinasa de los extractos control (sin PCF) y los extractos directos (con PCF) con la cantidad total de protena soluble obtenida y se defini a lo largo del tiempo. 27

2.2.1 Actividad especfica de tirosinasa extracelular. La cintica de actividad extracelular que se obtuvo se muestra en el grfico 2.

1,8 1,6 1,4 U/mg protena 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 24 48 72 Tiempo (h) Grfico 2. Cintica de actividad especfica de tirosinasa extracelular producida por R. oryzae ENHE en medio sinttico

Merlin-Norkrans (modificado) con y sin PCF. () Control sin PCF, () con PCF.

En el grfico 2 se puede observar que la actividad de tirosinasa extracelular disminuy despus de agregar el PCF en el medio de cultivo (24 h). La mayor actividad de tirosinasa extracelular se present a las 48 h en los cultivos control y con PCF (Tabla 2). Se observ 3.33 veces ms actividad de tirosinasa extracelular en los cultivos control en comparacin a los cultivos con PCF, a las 48 h. Posteriormente la actividad de tirosinasa extracelular disminuy en presencia y ausencia del PCF. Con base en estos resultados se demuestra que la actividad mxima de tirosinasa extracelular se presenta a las 48 h cultivo con y sin PCF. Para R. oryzae ENHE el estrs producido por el PCF afecta negativamente la actividad de tirosinasa extracelular; caso contrario a lo reportado por Montiel et al., (2004) quienes mostraron que la actividad de tirosinasa extracelular se ve inducida por el PCF.

28

Tabla 2. Valores de la cintica de actividad de tirosinasa extracelular producida por R. oryzae ENHE en el medio Merlin-Norkrans (Modificado) con y sin PCF.
TIEMPO (h) CONTROL U mg-1 Desv star protena Con PCF U protena mg-1 Desv star

0 24 48 72

0 0.410 1.479 0.834

0 0.015 0.052 0.079

0 0.081 0.444 0.215

0 0.025 0.024 0.035

2.2.2 Actividad especfica de tirosinasa intracelular. Para determinar la actividad de tirosinasa intracelular se recuper el micelio de R. oryzae ENHE despus de filtrar al vaco el medio de cultivo. Se resuspendi 500 mg de micelio en peso hmedo (excepto a las 48 horas con PCF, ya que R. oryzae ENHE no alcanz a producir 500 mg de micelio en peso hmedo, por lo que, solo se tom 250 mg de micelio en peso hmedo) en 5 ml de de buffer de fosfato de sodio 0.1M (pH 6.8) con 0.65M Sorbitol y 1mM de PMSF. La cintica que se obtuvo se muestra en el grfico 3.
0,25

0,2 U/m g de protena

0,15

0,1

0,05

0 48 72 Tiempo (h) Grfico 3. Cintica de actividad especfica de tirosinasa intracelular producida por R. oryzae ENHE en medio 0 24

Merlin-Norkrans (modificado) con y sin PCF. ()Control sin PCF, () con PCF.

El grfico 3 muestra que no existe una diferencia estadsticamente significativa entre la actividad de tirosinasa intracelular en los cultivos control y con PCF. La mayor actividad intracelular se present a las 24 h y fue de 0.205 0.015 U mg-1. Los resultados se resumen en la tabla 3. 29

Tabla 3. Valores de la cintica de actividad de tirosinasa intracelular producida por R. oryzae ENHE en el medio Merlin-Norkrans (modificado) con y sin PCF.
TIEMPO (h) CONTROL (sin PCF) U mg-1 Desv star protena Con PCF U mg-1 Desv star protena

0 24 48 72

0 0.205 0.157 0.178

0 0.015 0.020 0.006

0 0.193 0.153 0.168

0 0.020 0.013 0.008

3. EFECTO DE LA TIROSINA (Tyr) EN EL CRECIMIENTO Y EN LA ACTIVIDAD DE TIROSINASA

3.1 Crecimiento. En el grfico 4 se muestra la produccin de biomasa obtenida de los cultivos de R. oryzae ENHE con 0.1 y 0.05 g Tyr L-1 en el medio Merlin-Norkrans (modificado) y como control la biomasa de R. oryzae ENHE si el efecto de la Tyr.
4 3,5 3 mg Biomasa / ml 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 24 Tiempo (h) 48 72

Grfico 4. Cintica de crecimiento de R. oryzae ENHE en medio Melin-Norkrans (modificado) con diferentes concentraciones de Tyr en el medio de cultivo. ( )Control sin Tyr, () 0.05 y () 0.1 g tyr L-1.

Del grfico 4 se observa que la biomasa producida a las 24 h en los cultivos control y con 0.1 g L-1 de Tyr es muy similar, no hay diferencias significativas. Sin embargo, existe un aumento estadsticamente 30

significativo en el crecimiento del 11% para los cultivos con 0.05 g L-1 de Tyr en comparacin con el cultivo control (tabla 4). El incremento del crecimiento de R. oryzae ENHE en presencia del Tyr, es

debido probablemente a que el aminocido est actuando como factor de crecimiento para el zigomiceto, provocando un aumento en la actividad metablica del hongo, que tienen como consecuencia un incremento en la produccin de biomasa.
Tabla 4 . Biomasa de R. oryzae ENHE cuantificada por peso seco en mg ml-1 con diferentes concentraciones de Tyr en el medio de cultivo.
Biomasa (mg ml-1) Tiempo (h) CONTROL (sin Tyr) 0.05 g Tyr L-1 0.1 g Tyr L--1

0 24 48 72

0 2.87 2.98 3.31

0 3.19 3.36 3.58

0 2.99 3.17 3.06

3.2 Actividad especfica de tirosinasa extracelular e intracelular.

3.2.1 Actividad especfica de tirosinasa extracelular.

1,8 1,6 1,4 U/mg de protena 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 24

Grfico 5. Cintica de actividad especfica de tirosinasa extracelular producida por R. oryzae ENHE en medio Merlin-Norkrans (modificado) con Tyr. () Control sin Tyr, () 0.05 y () 0.1 g tyr L-1.

Tiempo (h)

48

72

Del grfico 5 se puede observar que la Tyr tiene un efecto positivo en la actividad de tirosinasa extracelular; incrementando la actividad en todos los tiempos de muestreo. La mxima actividad de 31

tirosinasa extracelular producida por R. oryzae ENHE se obtuvo a las 48 h de cultivo; en este periodo no existe una diferencia estadsticamente significativa de la actividad de tirosinasa en los cultivos con 0.1 y 0.05 g Tyr L-1, sin embargo, se incrementa la actividad de tirosinasa en estos cultivos alrededor de un 14% de la actividad en comparacin con los cultivos control. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 5.
Tabla 5. Valores de la cintica de actividad de tirosinasa extracelular de R. oryzae ENHE con 0.1 y 0.05 g L-1 Tyr en medio Merlin-Norkrans (modificado) y como control el medio de cultivo sin Tyr.
TIEMPO (h) CONTROL (sin Tyr) U mg-1 Desv star protena Con 0.1 g Tyr L-1 U mg-1 Desv star protena Con 0.05 Tyr g L-1 U mg-1 Desv star protena

0 24 48 72

0 0.410 1.479 0.834

0 0.015 0.052 0.079

0 0.538 1.707 1.483

0 0.144 0.037 0.059

0 0.635 1.659 1.299

0 0.046 0.105 0.115

3.2.2 Actividad especfica de tirosinasa intracelular. El grfico 6 muestra la actividad de tirosinasa intracelular de los extractos de biomasa de R. oryzae ENHE con 0.1 y 0.05 g L-1 de Try en medio Merlin-Norkrans (modificado) y como control, los extractos de biomasa de cultivos sin Tyr.
1 0,9 0,8 0,7 U/mg de protena 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 24 Tiempo (h) 48 72

Grfico 6. Cintica de actividad especfica de tirosinasa intracelular producida por R. oryzae ENHE en medio Merlin-Norkrans (modificado) con Tyr. () Control sin Tyr, () 0.05 y () 0.1 g Tyr L-1.

32

En el grfico 6 se observa que la Tyr tambin tiene un efecto positivo en la actividad de tirosinasa intracelular. La mxima actividad de tirosinasa con 0.05 g L-1 Tyr en el medio se present a las 24 h, esta actividad es 1.37 veces mayor que la actividad de los cultivos control. La mayor actividad de tirosinasa con 0.1 g L-1 Tyr en el medio se present a las 72 h, siendo 4.71 veces mayor que la actividad de los cultivos control. Los resultados se resumen en la tabla 6.

Al parecer con concentraciones relativamente grandes (0.1 g L-1) de Tyr en el medio de cultivo se incrementa la actividad de tirosinasa intracelular de R. oryzae ENHE. Mientras que en la actividad de tirosinasa extracelular no se observa incremento en la actividad, ya que la actividad mxima con 0.1 g L-1 Tyr no es estadsticamente diferente a la actividad de tirosinasa obtenida con 0.05 g L-1 Tyr, por lo que se consideran iguales; esto indica que el incremento en la actividad de tirosinasa extracelular no es tan sensible al incremento en la concentraciones de Tyr, como lo presenta la actividad intracelular.
Tabla 6. Valores de la cintica de actividad de tirosinasa intracelular producida por R. oryzae ENHE con 0.1 y 0.05 g L-1 de Tyr en Merlin-Norkrans (modificado) y como control el medio de cultivo sin Tyr.
TIEMPO (h) CONTROL (sin Tyr) U mg-1 Desv star protena Con 0.1 g Tyr L-1 U mg-1 Desv star protena Con 0.05 Tyr g L-1 U mg-1 Desv star protena

0 24 48 72

0 0.205 0.157 0.178

0 0.015 0.020 0.006

0 0.510 0.437 0.838

0 0.054 0.033 0.075

0 0.281 0.208 0.206

0 0.035 0.038 0.039

4. ACTIVIDA ENZIMATICA DE PEROXIDASAS EXTRACELULAR.

4.1 Actividad de Manganeso perxidasa (MnP). Para determinar la presencia de MnP producida por R. oryzae ENHE se realizaron tres fermentaciones con la metodologa ya mencionada, donde cada tiempo se hizo por triplicado. Los resultados obtenidos mostraron que R. oryzae ENHE no presenta actividad de MnP ya que no se logr obtener datos de absorbancia positiva que mostraran la actividad.

33

4.2 Actividad de Lignina perxidasa (LiP). Para determinar la actividad enzimtica volumtrica de lignina y manganeso perxidasa en R. oryzae ENHE se utiliz la siguiente formula:

U / ml = Donde: V = Volumen total de reaccin (ml). v = Volumen de extracto enzimtico (ml). e = Coeficiente de extincin (M-1cm-1). d = Dimetro de la cubeta (cm).

V v e d A min 1

Amin-1 = Cambio de la absorbancia por minuto. Para calcular las actividades especficas de LiP en R. oryzae ENHE, solo se dividi la actividad volumtrica entre la protena soluble extracelular (mg ml-1) cuantificada por el mtodo microenzayo de Bradford (Bradford, 1976). En el grfico 7 se muestra la actividad especfica de LiP con y sin PCF de R. oryzae ENHE en medio Merlin-Norkrans (modificado). Se tom como control a los cultivos control sin PCF.
3

2,5

U/mg de Protena

1,5

0,5

0 24 Tiempo (h) 48 72 Grfico 7. Cintica de actividad especfica de LiP producida por R. oryzae ENHE en medio sinttico Merlin-Norkrans 0

(modificado). LiP control () y LiP con PCF ()

34

Se observa en el grfico 7 que la mxima actividad de LiP se obtuvo a las 24 h en los cultivos con PCF, presentando 1.5 veces ms actividad de LiP que los cultivos control. Estos resultados indican que la actividad de LiP en R. oryzae ENHE es inducida en presencia del PCF, como ocurre con P. chrysosporium, donde se demostr que la actividad de LiP se ve inducida en presencia del PCF (Corts et al., 2001). Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 7.
Tabla 7. Valores de la actividad de LiP por Rhizopus orizae ENHE con y sin PCF.
TIEMPO (h) CONTROL (sin PCF) U mg-1 Desv star protena Con PCF U mg-1 Desv star protena

24 48 72

1.48 1.59 1.41

0.30 0.11 0.17

2.21 1.91 1.29

0.23 0.22 0.05

4.3 RELACIN DE LiP EN LA DEGRADACIN DEL PCF.

El incremento de actividad de peroxidasas por el PCF se ha reportado en diversos trabajos (Tien y Kirk, 1988; Lin y Wang, 1990) en el basidiomiceto P. chrysosporium bajo condiciones de limitacin de nitrgeno. En este hongo de pudricin blanca la principal peroxidasa identificada en la degradacin del PCF fue MnP debido a que en el medio de cultivo fue limitado en nitrgeno. Belinky et al., (2006) mostraron que independientemente de la limitacin de nitrgeno en el medio de cultivo, la adicin de Mn2+ y la reduccin de oxgeno disuelto en el medio favorecen a la actividad de MnP; los mismos investigadores mostraron que en P. chrysosporium la presencia de oxgeno por agitacin y la disminucin de Mn2+ en el medio inducen la actividad de LiP. Sin embargo, Rothschild et al., (2002) demostraron que para el basidiomiceto Irpex lacteus (Polyborus tulipiferae) la actividad de LiP se vea favorecida por la presencia de nitrgeno en el medio de cultivo, a dems de oxgeno disuelto.

En este trabaj se demostr que R. oryzae ENHE present actividad de LiP, siendo uno de los pocos trabajos que reportan que un zigomiceto produce peroxidasas, ya que la mayor parte de los reportes mencionan la produccin de peroxidasas por basidiomicetos. Se tendrn que hacer estudios con el fin

35

de determinar si la actividad de LiP producida por R. oryzae ENHE tambin es inducida en medios con limitacin en nitrgeno.

En el grfico 8 se muestra la cintica actividad de LiP producida por R. oryzae ENHE en medio de cultivo Melin-Norkrans (modificado) con 12.5 mg PCF L-1 adicionado a las 24 h de cultivo. As como la cintica de remocin del PCF. Se observa el PCF fue eliminado entre 90 y 100% en las primeras 24 h. Al momento en que se adicion el PCF se determin la mxima actividad de LiP. Falta hacer experimentos para determinar si hay una relacin entre actividad de LiP y remocin de PCF y tambin estudiar la relacin entre actividad de tirosinasa extracelular con respecto a la remocin de PCF. Sin embargo, es posible que la rpida degradacin del PCF por R. oryzae ENHE se deba a la accin conjunta de LiP y Tirosinasa; y probablemente la LiP sea de las principales enzimas encargada de la degradacin PCF, ya que con hongos que solo producen tirosinasa, como A. rouxii, la degradacin es menor.

14 12 10 8

2.5

1.5 6 1 4 2 0 0.5

24
Tiempo (h)

48

72

Grfico 8. Cintica de actividad de LiP y remocin de PCF por R. oryzae ENHE en medio Melin-Norkrans (modificado) adicionado con 12.5 mg PCF L-1. LiP con PCF () y () PCF residual.

U/mg de Protena

2 PCF residual

36

CONCLUSIONES.

Se identifico al zigomiceto como R. oryzae ENHE. El PCF no tiene ningn efecto sobre la actividad de Tirosinasa intracelular y extracelular de R. oryzae ENHE. La Tyr induce el crecimiento de R. oryzae ENHE debido probablemente a que este actuando como factor de crecimiento. La Tyr incrementa significativamente la actividad de Tirosinasa extracelular e intracelular producida por R. oryzae ENHE R. oryzae ENHE tiene actividad enzimtica de LiP, y esta actividad se incrementa por la presencia del PCF. R. oryzae ENHE es ms eficiente que Amylomyces rouxii, que remueve el 85% del PCF inicial (12.5 mg ml-1) en 96 h, mientras que R. oryzae ENHE lo remueve en 48 h.

37

BIBLIOGRAFA.

Aitken, M. D., Irvine, R. L. Stability testing of ligninase and Mn-peroxidase from Phanerochaete chrysosporium. Biotechnology and Bioengineering. 34: 1251-1260. 1989. Arcand, Y., Hawari, J. and Guiot, S. R. Solubility of pentachlorophenol in aqueous solution: The pH effect. Wat. Res. (29) 1: 131-136. 1995. Belinhy Paula A., Nufar Flikshtein, Carlos G. Dosoretz., 2006. Induction of lignin peroxidase via reactive oxygen species in manganese-deficient cultures of Phanerochaete chrysosporium. Enzyme and Microbial Technology. 39: 222-228.

Bernal RM, Tomasini A (2005) Seleccin de hongos filamentosos capaces de degradar pentaclorofenol. XI Congreso Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera. Mrida, Yucatn, Mxico

Boshoff A, M.H. Burton, S.G. Burton., 2003. Optimization of Catechol Production by Membrane-Immobilized Polyphenol Oxidase: A modeling Approach. Biotechnology and Bioengineering. 83 (1) 1, 1-7.

Bradford Marion M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of Protein-Dye binding. Analytical Biochemistry. 72:248-254.

Carvahalho C.M., Rocha A., M.L.F. Estevinho and Choupina., 2005. Identification of honey yeast species bases on RFLP analysis of the its region. Ciencia y Tecnologa Alimentaria. 5(001):11-17.

Christian Viral, Shrivastava Rohit, Shukla Dharmendra, Modi Hasmukh, Bharatkumar Rajiv Manuel Vyas., 2005. Mediator role of veratryl alcohol in the lignin peroxidase-catalyzed oxidative decolorization of Remazol Brilliant Blue R. Enzyme and Microbial Technology. 36: 327332

Corts DV, Bernal R, Tomasini A. 2001. Efecto de las condiciones de cultivo sumergido en la degradacin de pentaclorofenol por Rhizopus nigricans. Inf. Tecnol.12: 75-80. Crosby D.G 1981. Enviromental Chemistry of pentachlorophenol. Pere Appl. Chem 35: 10511080.

38

Durn Nelson, Maria A. Rosa, Alessandro DAnnibale, Liliana Gianfrendra., 2002. Applications of laccases and tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports. Enzyme and Microbial Technology. 31:907-931.

Fahr, K., Wetzstein, H.G., Gry, R. & Schlosser, D. 1999 Degradation of 2,4-dichlorophenol and pentachlorophenol by two brown rot fungi. FEMS Microbiology Letters 175, 127-132. Fernndez Perrino, F. J. (1997). Caracterizacin de la expresin de los genes implicados en la biosntesis de penicilina: Reaccin enzimtica catalizada por el producto del ltimo gen (pen DE) de la ruta de biosntesis de penicilina. Tesis doctoral.

Ha H.-C., Honda Y., Watenabe T., Kuwahara M.., 2001. Production of manganese peroxidase by pellet culture of the lignin-drgradin basidiomycete, Pleurotus ostreatus. Appl Microbiol Biotechnol. 55: 704-711.

Haghbeen Kamahldin and Eng Wue Tan., 2003. Direct spectrophotometric assay of monooxygenase and axidase activities of mushroom tyrosinase in the presence of synthectic and natural substrates. Analytical Biochemistry. 312:23-32.

Halaouli S, Asther Mi., Kruus K, Guo L, Hamdi M, Sigoillot J.-C, M. Asther and A. Lomascolo., 2005. Characterization of a new tyrosinase from Pycnoporus species with high potential for food technological applications. Journal of Applied Microbiology. 98:332-343.

Igisu, H., Hamasaki, N. And Ikeda, M. 1993. Short Communications, Highly cooperative inhibition of acetylhcholinesterase by pentachlorophenolin human erythrocytes. Biochemical Pharmacology. 46: 1, 175 177.

Karamanev, G. D., Chvarie, C. End Samson, R. 1997. Soil Inmovilization: New concept for Biotreatment of soil contaminants. Biotech. Bioeng. 57: 4, 471- 476. Kauffmann C, B:R: Petersen, Morten J. Bejerrum., 1999. Enzymatic removal of phenols aqueous solutions by Comprinus cinereus peroxidase and hydrogen peroxidase. Journal of Biotechnology. 73: 71-74.

Kenneth W. Cullings and Detlev R. Vogler., 1998. A 5.8S nuclear ribosomal RNA gene sequence database: applications to ecology and evolution. Molecular Ecology. 7:919-923. Kuwahara M, Glenn JK, Morgan MA, Gold MH., 1987. Separation and characterization of two extracellular H2O2-dependent oxidases fron lignolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium. FEBS Lett.169: 247-250.

Lee Seung-Goo, Hong Seung-Pyo, and sung Moon-Hee., 1996. Removal and bioconversion of phenol in wastewater by a thermostable -tyrosinase. 19:374-377. 39

Len-Santiesteban HH 2006 Estudio bioqumico de un hongo filamentoso capaz de degradar pentaclorofenol Reporte de Servicio Social realizado en el Laboratorio de Ingeniera Gentica y Metabolismo Secundario.

Lin Jian-Er and Wang Henry Y., 1990. Degradation Kinectics of Pentachlorophenol by Phanerochaete chrysosporium. Biotechnology and Bioengineering. 35: 1125-1134. Lisov, A. V.; A. A. Leontievsky, and L. A. Golovleva (2007) Hybrid Mn-Peroxidases from Basidiomycetes. Applied Biochemistry and Microbiology, Vol. 43, No. 5, pp. 536543. Maganhotto de Souza Silva C.M, Itamar Soares de Melo, Plablo Roberto de Oliveira., 2005. Ligninolytic enzyme production by Ganoderma spp. Enzyme ang Microbial Technology. 37: 324-329.

Marcial Quino Jaime Evaluacin del efecto de la tirosina en la degradacin de pentaclorofenol por Rhizopus nigricans en cultivo sumergido".. Licenciatura en Biologa. Universidad Veracruzana. Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias. Examen de grado presentado el 25 de septiembre de 2002.

Mazzocco Fabio and Pifferi Pier Giorgio., 1976. An Improvement of the spectrophotometric Method for the determination of Tyrosinase Catecholase Activity by Besthorns Hydrazone. Analytical Biochemistry. 72: 643-647.

Montiel A.M, F.J Fernndez, J. Marcial, J. Soriano, J.Barrios-Gonzles & A.tomasini. 2004. A fangal phenoloxidase (tyrosinase) envolved in pentachlorophenol degradation. Biotechnology Letters. 26:1353-1357.

Ohguchi Kenji, Tanaka Toshiyuki, Kido Tadashi, Baba Kimiye, Linuma Munekazu, Matsumoto Kenji, Akao Yukihiro, and Nozawa Yoshinori., 2003. Effects of hydroxystilbene derivates on tyrosinase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 307:861-863.

Okeke, B. C., Smith, J.E., Paterson, A & Watson-Craik, I.A. 1996 Influence of environmental parameters on pentachlorophenol biotransformation in soil by Lentinula edodes and Phanerochaete chrysosporium. Applied Microbiology and Biotechnology 45, 263-266.

Papinutti V.L, Forchiassin Flavia., 2003. Optimization of manganese peroxidase and laccase production in the South American fungus Fomes sclerodermeus (Lv.) Cke. J Ind Microbiol Biotechnol. 30: 536-541.

Rabinovich M. L., A. V. Bolobova, and L. G. Vasilchenko., 2004. Fungal Decomposition of Natural Aromatic Structures and Xenobiotics. Applied Biochemistry and Microbiology Vol. 40(1):117. 40

Reddy C. Adinarayana, 1995. The potential for white-rot fungi in the treatment of pollutants. Current Opinion in Biotechnology: 6, 320-328. Rodrguez-Tovar A, Xoconostle-Csarez B, Valdez M., 2004. Molecular Ecology of ectomycorrhizal fungi. Rev. Fitotc.Mex. Vol 27(3): 267-278. Rodriquez, M. O. and Flurkey, W. H. A., 1992 .Biochemistry Project to Study Mushroom Tyrosinase. J. Chem. Ed. 69(9) 767-769. Rothschild Nathan, Cenek Novotn, Vclav Sasek, Carlos G. Dosoretz., 2002. Ligninolytic enzymes of the fungus Irpex lacteus (Polyporus tulipiferae): isolation and characterization of lignin peroxidase. Enzyme and Microbial Technology. 31: 627-633.

Takashi Nakamura, Takayuki Motoyama, Shuichi Hirono, Isamu Yamaguchi., 2004. Identification, characterization, and site-directed mutagenesis of recombinant pentachlorophenol 4-monooxygenase. Biochimica et Biophysica Acta. 1700:151-159.

Tien M, Kirk TK., 1988. Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium In Methods in Enzymology, p. 238-249. Tomasini A, H. R. Villareal-Arellano y J. Barrios-Gonzles., 1996. Resistencia de una cepa de R. oryzae ENHE Al crecer en medios conteniendo pentaclorofenol. Avances en Ingeniera Qumica. 6(1):36-40.

Tomasini A, Vernica Flores, Diana Corts and Javier Barrios-Gonzles., 2001. An isolate of Rhizopus nigricans capable of toleranting and rmoving pentachlorophenol. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 17:201-205.

Xiao-yun Jiang, Guang-ming Zeng, Dan-lian Huang, Yang Chen, Fang Liu, Guo-he Huang., 2006. Remediation of pentachlorophenol-contaminated soil by composting with immobilized Phanerochate chrysosporium. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 22:909-913.

Yu Liangli., 2003. Inhibitory effects of (S)-and (R)-6Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2carboxylic Acids on Tyrosinase Activity. J. Agric. Food Chem. 51:2344-2347.

41

ANEXO.

DETERMINACIN DE PROTENA SOLUBLE POR EL MTODO DE MICRO-ENZAYO DE BRADFORD.

Se realiz la curva de calibracin, utilizando diferentes concentraciones de seroalbmina bovina.

0.6
Absorbancia a 595 nm

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8 10 12

micromol / ml de Seroalbmina bovina

Grfico A. Curva de calibracin para el micro-ensayo de Bradford con un rango de concentraciones de 0 a 12 g ml-1 de Seroalbmina bovina.

Del grfico se obtuvo la siguiente ecuacin de la recta:

y = 47.158 x Con una r2 de 0.99 Donde: y = Absorbancia x = Concentracin de protena (mg ml-1)

42

CURVA PATRON PARA LA DETERMINACIN DE TIROSINASA POR EL METODO DE HIDRASONA DE BESTHORN.

La curva patrn para la determinacin de tirosinasa se realiz a diferentes concentraciones molares de I2 (1x10-4 hasta 12x10-3M), el sustrato fue fenol 0.5 M y el agente cromforo utilizado fue MBTH. La curva obtenida se muestra en el grfico B.
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.5 0.8 1.1 1.4 1.7 2 2.3 micromoles de quinona
Grfico B. Curva de calibracin para el mtodo de Hidrasona de Besthorn. Cada punto en la curva se realizo por triplicado.

De la curva estndar se obtuvo la ecuacin: y = 0.314 x 0.1509 Con una r de 0.98 Donde: y = Absorbancia a 495 nm. x = Concentracin de la enzima. Si consideramos que la absorbancia a 495 nm para 1 mol de enzima es 0.314 en 1 minuto, se puede saber la concentracin de las muestras en un minuto realizando la siguiente ecuacin:
x=
2

Absorbancia a 495 nm

( y )(1mol )
0.314

43

Donde x es igual a las unidades de actividad. La unidad de actividad (U) se defini como la cantidad de enzima que produjo un mol de quinona por minuto.

44