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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA BIO 225 Queridos Alumnos: Como ya les comente la primera clase, este ao las prcticas se realizaran

como una parte de la teora, en este sentido les entrego la gua de laboratorio, que consta de 4 prcticas. Estas 4 prcticas se las realizar en 3 clases. Haciendo al final un informe individual. S que es un grupo bueno y dedicado por lo que quiero desearles un buen comienzo y a la vez recordarles que las 4 prcticas son complementarias de la teora y bsicas para el trabajo con microorganismos. Luego de realizar estas clases prcticas, se tiene que hacer el trabajo de investigacin que tiene por objetivo aplicar los conocimientos que adquirieron, con temas ya elegidos por ustedes Respecto a las normas de laboratorio: Puntualidad; la asistencia al laboratorio es obligatoria para todos los estudiantes, se tendr una tolerancia mxima de 10 minutos de atraso pasado este tiempo el alumno no podr ingresar a la practica. Se elegir 5 personas al azar para que den un examen oral previo. Traer los cuestionarios por escrito e individualmente. (no se aceptara cuestionarios hechos en computadora) y se deber entregarlos al ingresar al laboratorio. El informe lo harn al final de los 4 laboratorios, mediante el mtodo cientfico e individualmente Los informes deben estar correctamente citados bibliogrficamente. Los trabajos de investigacin se harn mediante el Mtodo Cientfico

A continuacin les menciono el material que no deben olvidar y las normas de seguridad de un laboratorio de microbiologa MATERIAL QUE NO DEBE OLVIDAR EL ALUMNO guardapolvo limpio toalla, jaboncillo y detergente un trapo para la limpieza del rea de trabajo asa microbiolgica aguja microbiolgica marcador indeleble algodn papel higinico papel madera papel aluminio alcohol 70% barbijo guantes de ltex cordel o pita Nota; el estudiante que no porte los materiales solicitados al ingresar al laboratorio no podr realizar la prctica.
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NORMAS BASICAS DE SEGURIDAD EN UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA 1. Esta prohibido, comer, beber, fumar, tomar mate, mascar chicle, coca o tabaco , almacenar alimentos, aplicarse cosmticos y cambiarse lentes de contacto en el rea de trabajo. Los lentes de contacto solo deben utilizarse cuando no puedan usarse otro tipo de lentes. 2. Est prohibido pipetear con la boca. (cualquiera sea el liquido con el que se este trabajando) 3. Deben lavarse las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y cada vez que se sospeche contacto con material contaminado. 4. Debe trabajarse de manera tal de minimizar la creacin de aerosoles. 5. Siempre debe usarse mandil y este debe estar abrochado. 6. El pelo largo debe llevarse atado. 7. Deben usarse lentes de seguridad, cuando sea necesario proteger la cara de salpicaduras, sustancias corrosivas, luz UV y otras radiaciones. 8. El laboratorio debe mantenerse ordenado y limpio. Debe minimizarse el material que no sea pertinente al trabajo, en las mesadas. 9. Todo material contaminado debe descontaminarse (incluido el autoclavado de medios sucios) antes de desecharse 10. Las superficies de trabajo deben limpiarse y descontaminarse con desinfectantes adecuados al final del trabajo y en caso de haberse volcado material contaminado. 11. Todos los accidentes o vuelcos de material deben ser comunicados inmediatamente al docente encargado de grupo.

PRCTICA I PREPARACIN DEL MATERIAL DE VIDRIO Y ESTERILIZACIN

1. INTRODUCCIN.El trabajo con microorganismos no se realiza con clulas aisladas, sino con poblaciones extensas y homogneas del microorganismo a estudiar, Por lo tanto, el microbilogo utiliza tcnicas que permiten obtener un cultivo puro. Para obtener cultivos puros es preciso utilizar instrumentos estriles, es decir, libres de otros microorganismos contaminantes. La destruccin de microorganismos indeseables en los medios de cultivo y en los recipientes tiles en bacteriologa, es condicin especial para asegurar la pureza de los cultivos y poder estudiar a los microorganismos sin contaminantes. Se utilizan dos tipos principales de esterilizacin: Por mtodos fsicos: Calor (autoclave, estufa, pasteurizacin, tindalizacin) Radiacin (UV, Ionizante) Filtracin (de profundidad, membrana, nucleacin) Por mtodos qumicos Osmosis
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Desinfectantes Antispticos

2. OBJETIVO. Familiarizar al alumno con los principales mtodos de esterilizacin en microbiologa. Entender las principales normas para el uso de desinfectantes.

3. MATERIALES - Cajas petri de 10 y 12 cm. de dimetro - Pipetas de 1, 2 y 10 ml - Tubos de ensayo de tamao mediano - Balones y matraces de 250, 500 y 1.000 ml - Viales - Picetas 250 ml - bisturi - Papel filtro - Papel madera - Cordel (pita) - Algodn - Tijeras - Papel aluminio - Bolsas plasticas - 10g de carne de res - Agua contaminada 250ml. Equipo Estufa Autoclave Cmara de radiacin UV Reactivos NaCl Hipoclorito de sodio en solucin 100ml 4. MTODOS. Primeramente todo el material de vidrio como cajas Petri, matraces, tubos, pipetas, y otros se lavan con agua corriente y detergente, luego sern enjuagados 3 veces con agua corriente para finalmente ser enjuagados una ultima vez con agua destilada. Se deja en una estufa, durante un tiempo determinado, o se seca con un pao limpio que no deje pelusas.
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Esterilizacin por radiacin Luego se clasificara el material volumtrico y aquel sensible a la temperatura para realizar su esterilizacin mediante radiacin UV, para llevar a cabo esto se acomodara el material en la cmara de sembrado de tal manera que todas las superficies de cada uno de los instrumentos queden expuestas a la luz UV, que proviene de la lmpara de mercurio que se encuentra en la parte superior, finalmente se cubrir la cmara con un pao negro y se irradiara durante 30 minutos observando que el ambiente se mantenga ventilado por las emanaciones de ozono de la lmpara. En ningn momento se debe mirar la luz ultravioleta sin contar con las gafas de proteccin adecuadas. Esterilizacin por calor seco El resto del material se dividir en dos grupos al primero se lo preparara de la siguiente manera: Los tubos de ensayo se taponan perfectamente con algodn y con capuchones de madera. Las cajas petri deben envolverse con papel madera. Las pipetas tienen que llevar un tapn de algodn en la parte superior y para su esterilizacin son envueltas individualmente, enrollndolas con tiras de papel. Los balones y matraces se taponan firmemente con algodn y con capuchones de papel madera o papel aluminio. Otros materiales como jeringas hipodrmicas, tubos de vidrio o utensilios metlicos se envuelven con papel madera, despus de haber sido lavados y secados. El material as preparado esta listo para la esterilizacin con calor seco llevndolo a la estufa a una temperatura de 150C durante 60 minutos. El tiempo se empieza a contar cuando la temperatura alcanza los 150C y se mantiene el tiempo elegido. Despus se deja que el esterilizador se enfre paulatinamente. Esterilizacin por calor hmedo El segundo grupo de material cajas petri, viales y picetas (con agua destilada no mas de la mitad de su capacidad) se lo introducir en bolsas plsticas para luego llevarlas a la autoclave cuando la temperatura de esta haya alcanzado los 121C se comenzaran a contabilizar 15 minutos, luego se apaga la autoclave y se dejara que la presin disminuya lentamente. Esterilizacin por filtracin. Primeramente el rea de trabajo ser, descontaminada usando desinfectantes para superficie a la concentracin recomendada (siguiendo las normas para el buen uso de desinfectantes sealadas en la charla previa) luego se armara el equipo para filtracin que debe estar previamente esterilizado y se lo conectara a la bomba de vacio, el agua contaminada se colocara en la parte superior y se proceder a la filtracin para esterilizar el liquido. Esterilizacin por smosis. Trabajando en una superficie descontaminada los 10g de carne de res sern cortados con el bistur estril en delgadas laminas y se las dispondr en dos cajas petri estriles, en una de ellas a los trozos d carne se les aadir NaCl solido en suficiente cantidad para lograr evitar la descomposicin del material, y se dejara las dos cajas petri tapadas durante una semana a temperatura ambiente.

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CUESTIONARIO 1. 2. Defina los siguientes conceptos: Asepsia, esterilizacin, desinfeccin, germicida, bacteriostasis. Qu se entiende por presin de vapor de un lquido? y qu relacin tiene con el funcionamiento de la autoclave? 3. Cules son los fenmenos que ocurren en la clula bacteriana a medida que aumenta la temperatura que llevan finalmente a su destruccin? 4. Cul de los mtodos para la esterilizacin es el mas efectivo para asegurar una esterilizacin total? 5. Qu es el punto trmico letal? 6. Cul es la diferencia entre radiacin ionizante y no ionizante de ejemplos de cada una de ellas? 7. Realice una tabla en que se muestre la temperatura, presin y los tiempos de exposicin, necesarios en autoclave, para esterilizar los diferentes materiales de vidrio (pipetas, tubos de ensayo, erlenmeyers, etc.) 8. Qu es la esterilizacin fraccionada (Tindalizacin) la pasteurizacin y cuando se la aplican cada uno de estos mtodos? 9. Por qu la resistencia a antibiticos puede ser objeto de transmisin gentica horizontal y no as la resistencia a la luz UV o a otro tipo de radiacin? 10. Problema: la concentracin recomendada para desinfectar superficies con hipoclorito de sodio es 0,1M explique como preparara 250ml de esta solucin a partir de una solucin comercial que tiene una concentracin 8% P/V justifique su respuesta con clculos.

PRCTICA II MEDIOS DE CULTIVO Y MTODOS DE SIEMBRA 1. INTRODUCCIN. Las bacterias en la naturaleza, segn sus necesidades nutricionales, ocupan distintos nichos ecolgicos que satisfacen las mismas. En el laboratorio, para conseguir que una determinada especie bacteriana se desarrolle adecuadamente es necesario proporcionarle un ambiente artificial que las satisfaga igualmente. Esto se consigue mediante el uso de los llamados medios de cultivo Un medio de cultivo es cualquier sustancia lquida o slida que puede utilizarse en el laboratorio para que crezcan los microorganismos. Los medios de cultivo contienen como mnimo: carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras. Las exigencias nutricionales de los microorganismos varan segn su naturaleza, de ah que los medios de cultivo sean tan diversos. El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriolgicos. Se disuelve completamente a 100C y se solidifica al enfriarse a 40C. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: - Agar. - Azcares.
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Extractos. Peptonas. Fluidos corporales. Sistemas amortiguadores. Indicadores de pH. Agentes reductores. Agentes selectivos.

De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en: Lquidos: o caldos de cultivo no tienen agar en su formulacin. Semislidos: Contienen 0.5% de agar Slidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar De acuerdo a su composicin en: Definidos: (medios mnimos) Complejos: De acuerdo a su funcin: Medios selectivos Medios diferenciales Medios de enriquecimiento Medios enriquecidos: MTODOS DE SIEMBRA: Siembra en medios slidos.Cajas Petri- En la superficie del medio de cultivo de las cajas Petri, los microorganismos son inoculados con el asa en lnea zig-zag, procedimiento que se conoce con el nombre de "siembra en estra". Existen diversas variantes que pueden ser usadas para la siembra mediante estra en placas. Vaciado en placas- Consiste en mezclar el inculo (muestras de diferentes diluciones) en el agar en proceso de enfriamiento, es decir cuando el agar est todava lquido, se vierte 1 ml de la muestra y se mezcla mediante la "tcnica del ocho", cuando el agar se solidifica, las bacterias aisladas se encuentran atrapadas en diferentes sitios, donde se desarrollan dando lugar a colonias puras y separadas. En tubo de agar inclinado (tubos de ensayo)- Se procede a la siembra de bacterias tomando el tubo con la mano izquierda, se retira el tapn con el meique de la mano derecha y se introduce el asa hasta el fondo del tubo, se extiende la muestra con movimiento de zig-zag, el agar no debe ser perforado durante la siembra. Tambin se puede inocular muestras en "tubos de agar inclinado" mediante la siembra por punto En tubo de agar en pie- La inoculacin se realiza mediante picadero o puncin. Siembra en medios lquidos.- Tambin se maneja el tubo con mano izquierda y se procede a la siembra, introduciendo el asa de platino hasta el fondo del tubo, se disgrega la muestra en el lquido con un pequeo movimiento del asa. Nota.- Las inoculaciones se las realiza en un ambiente estril, esto se consigue con un mechero que tiene un rea aprovechable de 20 cm3. A cada tubo o caja se debe marcar debidamente, anotando la fecha, naturaleza de la muestra y nmero de dilucin, si es que hay.
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2.

OBJETIVO. Establecer los fundamentos tericos para la preparacin de medios de cultivo. Dar a conocer los principales mtodos de siembra de microorganismos Practicar el mtodo de la siembra asptica MATERIALES

3.

- Cajas Petri estriles (10 y 12 cm de dimetro) - Tubos de ensayo de tamao mediano, con tapones de algodn o tapas de rosca. - Balones de 500 y 1 000 ml - Autoclave - Bao mara - Cocinilla - Mechero - Asa de Platino REACTIVOS - Caldo de Carne - Agar Bacteriolgico - Agua destilada - Extracto de carne - Peptona - Cloruro Sdico - Sacarosa 10g. - Fosfato de amonio 0,8g - Sulfato de amonio 0,4g - Nitrato potsico 1 g/l - Manitol 7,5 g/l - Rojo fenol 0,04 g/l - Cloranfenicol - oxitetraciclina 4. METODOS. Se prepararan los siguientes medios de cultivo.

a) MEDIOS DEFINIDOS. MEDIO PARA EL DESARROLLO DE LEVADURAS. Sacarosa 10g. Fosfato de amonio 0,8g Sulfato de amonio 0,4g Agua destilada 200m b) MEDIOS COMPLEJOS
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- EXRACTO DE CARNE O CALDO NUTRITIVO (Medio Lquido) Extracto de carne 0,3% Peptona 1,0% Cloruro Sdico 0,5% Agua destilada 1.000 ml Llevar a disolucin todos los ingredientes mediante calentamiento, ajustar el pH entre 7,6 y 7,8. Filtrar si es preciso con papel. Repartir en tubos de ensayo y esterilizar en autoclave. NOTA.- Cuando no se tiene extracto de carne se pone 500 g. de carne picada (de ternero o buey) en 1.000 m. de agua. Se deja macerar en el refrigerador de 12 a 24 horas. Luego se hace hervir vigorosamente durante media hora, se restaura el volumen de agua perdida, filtrar a travs de gasa para separar las partculas de carne. Despus se agregaran los dems ingredientes. - AGAR NUTRITIVO (Medio Slido) Agar Bacteriolgico 1,5% Peptona 1,0% Cloruro de Sodio 0,5% Caldo de Carne 1,000 cc. Una vez preparado el caldo de carne, entibiar y agregar el agar-agar, luego los dems ingredientes, agitar vigorosamente y llevar a ebullicin hasta que el agar este disuelto totalmente. Ajustar el pH entre 7,6 o 7,8. Despus se reparte en matraces y tubos de ensayo y se lleva a esterilizacin. Para obtener tubos de "agar en pie"; dejar que los tubos se solidifiquen en posicin vertical (despus de ser esterilizados). Para tubos de "agar inclinado", dejarlos solidificar inclinados sobre la mesa (puede apoyarse un extremo sobre un lpiz o cuaderno con espiral), el agar de los tubos no debe tocar el tapn de algodn. Una vez esterilizado el agar nutritivo, se reparte en las cajas Petri, previamente esterilizadas y se espera que se solidifiquen. c) MEDIOS SELECTIVOS. MEDIO AGAR SABOURAUD CON CLORANFENICOL.

Glucosa 2% Peptona 1% agar 1,5% cloranfenicol 50mg/L

MEDIOS CON ANTIBIOTICOS A 9 tubos con 25ml de caldo nutritivo se colocaran concentraciones de 200, 100, 75, 50, 25, 10, 5, 1mg/l de oxitetraciclina d) MEDIOS DIFERENCIALES. MEDIO MacCONKEY
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Medio 56g./L MEDIO MM

Peptona de caseina 10 g/l Nitrato potsico 1 g/l Manitol 7,5 g/l Rojo fenol 0,04 g/l Agar 3,5 g/l pH 7,6 nota: una vez preparado los medios se los llevara a la autoclave y luego usando la tcnica asptica se los distribuir en tubos y cajas petri esteriles.
Observacin del crecimiento exponencial en microorganismos. A los 200ml del medio para el desarrollo de levaduras se colocar 1g. de levadura fresca y se incubara a 30C cada dos horas a partir de la siembra se tomara 1ml del cultivo y se lo llevara al espectrofotmetro para medir su DO a 660nm. Esterilizacin por smosis parte II A las cajas petri que contenan trozos de carne (con y sin NaCl) se les adicionara 1ml de agua destilada estril y luego de dejar macerar 5 minutos se tomara 500ul. De cada una de las muestras y se sembrara por agotamiento en sendas cajas petri de agar nutritivo dejndolas incubar a 28C. Cultivo selectivo para hongos. se tomaran 500ul de la caja petri que contena el trozo de carne sin NaCl y se sembrara por agotamiento en una caja petri con Saboraud con cloranfenicol. Dejndolas incubar a 28C.

Determinacin de presencia de coliformes. Se tomara muestras de aguas residuales del campus de Cota Cota y se sembrara por estria en 3 cajas petri a) con agar nutritivo dejndolas incubar a 28C. b) con agar Mac Conkey dejndolas incubar a 37C.

Distincin entre organismos aerobicos y anaerbicos. En tres tubos en pie de agar nutritivo se sembrara sedimento en condiciones anaerobias por el mtodo de puncin y de la misma manera se proceder con disoluciones de muestras de suelo aireado. Dejndolas incubar a 28C.
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CUESTIONARIO 1. Qu se entiende cuando decimos que un organismo es auxtrofo para un compuesto, y que relacin tiene esto con la molcula p- aminobenzoico? 2. Qu se entiende por siembra asptica y como se la debe realizar? 3. Defina y de ejemplos de los siguientes medios de cultivo: definido, complejo, de amplio espectro, de enriquecimiento, enriquecido, selectivo y diferencial. 4. Qu s entiende por factor de reduccin decimal? 5. A cuntos grados centgrados se desarrollan las bacterias patgenas y las de vida libre en condiciones de laboratorio? 6. Cul es la razn por la que hacemos crecer hongos en un medio tan pobre como el agar papa dextrosa? 7. Qu precauciones se debe tener para realizar un medio de cultivo? 8. Qu son los macro y micro nutrientes y en que les son necesarios a las bacterias? 9. Qu es la cicloheximida? 10. Problema: usted quiere prepara 250ml de un medio que contenga Ketocotonazol 15mg./L y solo cuenta con la presentacin comercial del anti fngico, que son pastillas con 10% del producto y el resto son excipientes Cmo realizara la preparacin? PRACTICA III

DESARROLLO DE LOS MICROORGANISMOS Y AISLAMIENTO DE COLONIAS 1. INTRODUCCIN. Para la identificacin de bacterias es de suma importancia el observar las caractersticas propias de cada tipo de colonia bacteriana y describirlas. Entre las caractersticas que se toman en cuenta para la descripcin se tienen: la forma, superficie, pigmentacin, tamao, borde, halo, aspecto, consistencia, turbidez y formacin de gas. Cuando se tiene un cultivo mixto, es decir con varias cepas microbianas, es frecuente el separar una de las cepas de inters al investigador y sembrarla en un nuevo medio de cultivo, realizndose de esta manera el aislamiento. Adems de identificar al organismos es tambien importante poder cuantifical el crecimiento bacteriano. El crecimiento microbiano se define como un incremento en el n de clulas, es decir, se refiere al crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento decada clula individual y su divisin celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como, el tipo de microorganismo, las condiciones de incubacin el medio de cultivo y otras. Existen diversos metodos para realizar esto, Mtodos directos que son aquellos en los que se cuenta el n total de clulas en un volumen conocido y as se estima el n total en la poblacin. Entre ello esta Recuento directo del n de clulas al microscopio, Contadores electrnicos, Recuento de clulas viables Y los mtodos indirectos que son aquellos que utilizan parmetros distintos del n de clulas, pero
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que pueden relacionarse de forma directa con ste (masa celular, actividad metablica, etc..). Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los constituyentes celulares y as la velocidad de crecimiento de la poblacin puede estimarse por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parmetros. Entre los mtodos indirectos se encuentran: Determinacin del peso seco, Determinacin del nitrgeno celular, Determinacin del DNA, Determinacin de una actividad metablica.

2.

OBJETIVOS. Familiarizar al alumno con las principales caractersticas para la identificacin de colonias de microorganismos. Cuantificar el crecimiento microbiano por mtodos directos e indirectos.

3.

MATERIALES.

- Tubos y cajas Petri de la prctica 2 - Cajas Petri con agar sembrado prctica 2 - Estereomicroscopio - Asa de Platino e isopos desechables - Lpices de color - Asa microbiolgica - Mechero - Espectrofotmetro - H2O2 3. MTODOS. 3.1. Lectura de medios: a) Lectura en medios lquidos. La superficie del medio puede tener la formacin de una pelcula o ausencia de sta, de caractersticas: delicada, frgil, apergaminada, espumosa, etc. El medio puede enturbiarse en forma homognea, granulosa, coposa, etc. El sedimento presenta aspecto fsico granuloso, homogneo, polvoroso, etc. La pigmentacin del sedimento puede ser amarilla, parda, incolora, etc. b) Lectura en medios slidos. - Para tubos en pie. Examinar el aspecto del desarrollo producido a lo largo de la puncin. Las formas de desarrollo pueden ser: Filiforme, en rosario, ramificado, absorbente, crateriforme, en embudo. - Para tubos inclinados. Se observa el aspecto general del desarrollo a lo largo de la estra, que puede ser discreto, abundante, pululante, etc. - Para cajas Petri. La descripcin de las colonias se las realiza de la siguiente manera: Forma: redondeada, irregular, melena de len, fusiforme, puntiforme. Dimensiones: desde dcimos de mm a varios cm.
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Bordes: aserrado, liso o entero, lacerado, ondulado, filamentoso o ciliado. Altura: Convexa, plana, cnica, convexa centro saliente (umbolonada), convexa centro entrante (umbilicada). Aspecto Fsico: Transparente, translucida, brillante, opaca. Consistencia: Butirosa, crea, polvorosa, cremosa, mucoide, viscosa, apergaminada, seca. Pigmentacin: Incolora, blanca, parda, amarilla, roja, azul, etc. Aislamiento de bacterias: Para el aislamiento de bacterias se utiliza un medio y un conjunto de condiciones de incubacin que sean selectivos para el organismo deseado. Con el asa microbiolgica se toma una pequea cantidad de una colonia microbiana de las placas anteriormente descritas y se siembra en la nueva placa por alguno de los mtodos descritos. Se lleva a incubar por 24 y 48 horas a 37C. Se observa el desarrollo de las colonias y si las caractersticas descritas son las mismas que se observ en la colonia inoculada. Se debe trabajar cerca del mechero para evitar la presencia de contaminantes. Recuento del nmero de bacterias por ml.UFC Uno de los mtodos que vamos a utilizar consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar despus cantidades conocidas de las mismas en una serie de placas de petri. Considerando que alguna de las diluciones ser tal que al distribuir una parte de ella en la placa, originar colonias separadas. Contando el nmero de colonias, el volumen sembrado en la placa y la dilucin correspondiente, podremos calcular el nmero de unidades formadoras de colonias presentes en la muestra inicial. A partir de la muestra hacer una serie de 4 diluciones decimales en condiciones de esterilidad. Extender 100 l de las diluciones 10-2, 10-4 , 10-6 y 10-8 en una placa e incubar toda la noche. A partir del nmero de colonias presentes en cada dilucin, calcular el nmero de bacterias por ml en el cultivo original. Elaboracin de la escala de Mc Farland. La finalidad, es establecer una relacin entre una precipitacin qumica y una suspensin bacteriana. Creamos 10 estndares (en la tabla aparece la composicin de estos) y por espectrofotometra, creamos una recta patrn, de forma que vamos a poder detectar la concentracin de nuestras diluciones bacterianas (de manera aproximada, ya que depende de factores como el tamao de la bacteria, la formacin de agregados, y otros). La escala se basa en la capacidad de precipitacin del cloruro de bario en presencia de cido sulfrico.

TUBO 1 2
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Cl2Ba 1% 0,1 0,2

SO4H2 1% 9,9 9,8

u.f.c/ml 3,0x108 6,0x108


12

3 4 5 6 7 8 9 10

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0

9,0x108 1,2x109 1,5x109 1,8x109 2,1x109 2,4x109 2.7x109 3,0x109

Nota: cuantificar numero de bacterias por ambos mtodos y comparar resultados. Prueba de la catalasa En un portaobjetos limpio se coloca una de las colonias aisladas para luego agregar una gota de perxido de hidrogeno, observar si existe produccin de oxigeno. Concentracin mnima inhibitoria. De uno de los cultivos aislados se realizara el repique en condiciones aspticas en los nueve tubos con oxitetraciclina para dejarlos incubar por 24 horas a 30C observando luego la turbidez del medio. CUESTIONARIO 1. El crecimiento exponencial se da solo en microorganismos? Si no es asi que otros ejemplos en la naturaleza tenemos de este tipo de crecimiento. 2. Cules son las caractersticas de las colonias de las bacterias del genero Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiela y Proteus? 3. Defina: clon, contaminante, inculo, cultivo polimicrobiano. 4. Durante la incubacin: aparecen primero los hongos o las bacterias? Por qu? 5. Como no es posible cuantificar un cultivo de hongos por el mtodo de unidades formadoras de colonias cual seria la manera de medir el crecimiento de estos organismos. 6. El crecimiento de una colonia individual representa el crecimiento de varios o de un organismo? Explicar haciendo nfasis en la constitucin gentica 7. Existen otras tcnicas ms sofisticadas para clasificar a los microorganismos? Mencione detalladamente alguna de ellas. 8. Esperara que un organismo anaerobio sea positivo para la prueba de la catalasa? 9. con que medio de cultivo se puede determinar si un organismo es anaerobio, anaerobio facultativo o aerbico? 10. Problema: en una caja petri con en donde se sembr 450ul. De la disolucin de un cultivo a la 10-8 aparecieron 7 colonias indique usted cual es el numero de bacterias por ml. Justifique su respuesta con clculos. PRTICA VI
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MTODOS DE OBSERVACIN MICROSCPICA 1. INTRODUCCIN. Los microorganismos solamente pueden observarse en forma individual bajo el microscopio. Mediante este procedimiento es posible mostrar alguna de las caractersticas morfolgicas de los microorganismos. Las preparaciones para estas observaciones pueden ser en fresco o mediante tinciones, Para realizar con xito un examen microscpico de microorganismos, es necesario que, el microscopio este correctamente ajustado. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, y otras. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente 2. 3. OBJETIVOS Desarrollar habilidades en el alumno en el campo de la observacin microscpica. Comprender los fundamentos bioqumicos para la tincin celular. MATERIALES.

- Microscopio compuesto, con objetivos de inmersin - Mechero de alcohol - Asa de inoculacin - Porta-objetos simples - Cubre-objeto - Azul de anilina - Colorantes para la tincin de Gram. - Colorantes para tincin de esporas(mtodo general) - Infusin de paja o tierra a temperatura ambiente por 4 das - Diferentes cultivos de microorganismos
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- Vaselina 3. PROCEDIMIENTO. A. Observaciones en fresco. La gota de muestra es depositada sobre el porta-objetos, si la muestra es slida hay que disolverla con agua destilada o suero fisiolgico, para que se obtenga una buena extensin sin contaminacin. Luego se coloca el cubre-objetos, y el preparado se coloca al microscopio para observar con poca luz. La observacin de la motilidad de las bacterias se efecta empleando vaselina para formar una , concavidad en el portaobjetos y se acomoda el cubre-objetos, con la gota con suspensin de bacterias (observacin en gota pendiente) (revisar bibliografa sobre tcnicas). Observaciones coloreadas. Extender la muestra con el asa estril sobre el porta-objetos, la extensin debe ser de grosor apropiado y abarcar un rea de un centmetro cuadrado aproximadamente. Si la muestra es slida diluirla con una gota de agua o suero fisiolgico, luego se utiliza el frotis. Despus se fija la muestra con aire o con calor (mechero), controlando la temperatura con el dorso de la mano (el porta-objetos no debe quemar).Luego de fijar la muestra se puede colorear por cualquier procedimiento.(tincin simple y tincin de Gram). La observacin se la realiza utilizando el objetivo de mnimo y mediano aumento, tambin se utiliza el objetivo de inmersin. C. Observaciones de otras estructuras: Coloracin de esporas: realizar el mismo procedimiento que en B., hasta obtener el frotis, luego aplicar la tincin de esporas. observar con un objetivo de mediano aumento, y con el objetivo de inmersin..

B.

4.

MTODOS DE COLORACIN. TINCIN SIMPLE 1. 2. 3. 4. Cubrir la preparacin con 2 o 3 gotas de azul de anilina o cristal violeta dejar actuar 3 minutos. Lavar con agua de grifo o sumergir en un recipiente. Secar con aire o calor. Observar al microscopio con mnimo aumento, despus con el de inmersin.

TINCIN DE GRAM O DIFERENCIAL 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Poner violeta de Genciana al 1%, sobre la preparacin ya fijada, dejar actuar por un minuto. Lavar con agua. Cubrir la preparacin con al solucin Yodada (lugol) de uno a dos minutos. Decolorar con alcohol de 95 durante 30 a 60 seg. Lavar con agua. Contrastar con fucsina fenicada o rojo de Safranina, por un minuto. Lavar con agua, secar con calor y observar.

MCR, febrero de 2012

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TINCIN DE ESPORAS 1. 2. 3. 4. 5. Teir con fucsina fenicada, calentar con llama de mechero durante 5 minutos hasta la emisin de vapores. Decolorar con cido actico al 5%, hasta que el frotis tome un ligero color rosa. Esto se logra en unos segundos. Teir durante 3 minutos con azul de metileno de Loffler. Lavar con agua. Secar al aire o con papel filtro.

Las bacterias quedan azules y las esporas rojas. CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Cules son los tipos morfolgicos principales de las bacterias en la observacin? Explique a detalle la tcnica de la gota pendiente. Cules son los pasos a seguir para el correcto manejo del lente de inmersin? afectara el proceso de fijacin la estimacin del tamao celular? Explique por que. la mayora de los hongos son Gram + o Gram- o esta tincin no se aplica a estos organismos? Justifique su respuesta Por qu se clasifican los tipos de tincin existentes en simple y diferencial? un colorante acidofilo tendr una carga positiva o negativa? por que? Cmo es la composicin de la envoltura bacteriana de una bacteria cido resistente? Cul es la estructura del pptido glicano? Cul es la ultrestructura de un flagelo? Y cual es la mejor manera de teirlos y observarlos.

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