4.

Tcnicas Espectroscpicas

Faremos uma introduo sobre tcnicas espectroscpicas utilizando os livros textos que constam nas referncias: Lakowicz, 1983 e Freifelder, 1976.

4.1 Espectroscopia de Absoro Molculas absorvem luz. Os comprimentos de onda que so absorvidos e a eficincia da absoro dependem tanto da estrutura da molcula como do meio onde est a molcula, fazendo da espectroscopia uma ferramenta til para
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caracterizar pequenas e grandes macromolculas. 4.1.1 Teoria simples da absoro da luz por molculas Luz, em seu aspecto ondulatrio, consiste de campos eltrico e magntico mutuamente perpendiculares, que oscilam senoidalmente medida que se propagam pelo espao. (Fig 4.1).

Figura 4.1

Propagao de uma onda eletromagntica, mostrando que o campo

eltrico (E) e o campo magntico (B) so mutuamente perpendiculares.

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Mas a luz tambm se comporta como um feixe de partculas, ftons. A energia E do fton E = hc/ = h, sendo h a constante de Planck, c a velocidade da luz, o comprimento de onda e a freqncia. Quando uma onda eletromagntica encontra uma molcula, ela pode ser espalhada (sua direo de propagao muda) ou pode ser absorvida (sua energia transferida molcula). A probabilidade relativa da ocorrncia de cada processo uma propriedade particular da molcula encontrada. Se a energia eletromagntica da luz absorvida, a molcula dita estar excitada ou em um estado excitado. Uma molcula ou parte de uma molcula que pode ser excitada pela absoro chamada de cromforo. Esta energia de excitao usualmente convertida em calor (energia cintica) pela coliso de molculas excitadas com outras molculas (por exemplo: uma molcula do solvente). Com algumas molculas esta energia reemitida
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como fluorescncia (o que veremos na prxima seo). Em ambos os casos, a intensidade da luz transmitida por um conjunto de cromforos menor que a intensidade da luz incidente. Uma molcula excitada possuir uma das possveis quantidades discretas de energia descritas pelas leis da mecnica quntica, os nveis de energia da molcula. Os nveis de energia, em maioria, so determinados pelas possveis distribuies espaciais dos eltrons e so chamados nveis eletrnicos de energia; sobre estes nveis existem os nveis vibracionais, que indicam os vrios modos de vibrao da molcula (o estiramento e dobra de vrias ligaes covalentes). H tambm, subdivises menores chamados de nveis rotacionais, que apresentam uma importncia menor na espectroscopia de absoro. Todos estes nveis de energia so geralmente descritos por um diagrama de nveis de energia (Fig. 4.2). O mais baixo nvel eletrnico chamado de estado fundamental e todos os outros so estados excitados.

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Figura 4.2

Tpico diagrama de nveis de energia mostrando o estado fundamental e

o primeiro estado excitado. Os nveis vibracionais so mostrados como linhas horizontais mais finas (www.chemkeys.com).

A absoro da energia possvel somente se a quantidade absorvida corresponde a diferena entre nveis de energia. Isto pode ser expresso pela expresso que correlaciona o comprimento de onda da luz () com o nvel de energia da molcula antes da absoro (E1) e o nvel de energia alcanado aps a absoro (E2): = hc /(E2 - E1) . A mudana entre nveis de energia chamada de transio. Uma transio entre nveis eletrnicos de energia representa a energia requerida para mover um eltron de uma rbita a outra. As transies so representadas por setas verticais no diagrama dos nveis de energia. (todas as transies no ocorrem com alta probabilidade, so determinadas pelas regras de seleo da mecnica quntica). A representao da probabilidade de absoro versus o comprimento de onda chamado espectro de absoro e a espectroscopia de absoro tem por objetivo obter e analisar os dados de absoro. Se todas as transies esto somente entre o

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nvel vibracional mais baixo do estado fundamental e o primeiro estado excitado, ento o espectro de absoro consistir de uma seta, linhas discretas. No entanto, como as transies so possveis do estado fundamental para qualquer dos nveis vibracionais e rotacionais do primeiro estado excitado e porque as linhas tm largura finita, o espectro aparecer como uma curva relativamente suave. Para a maioria das molculas, os comprimentos de onda correspondentes as transies entre o estado fundamental e qualquer nvel vibracional do primeiro estado excitado estaro no intervalo da luz ultravioleta e da luz visvel. Transies de baixa energia tambm so possveis entre nveis vibracionais no interior de um mesmo nvel eletrnico. Estas transies estaro na faixa do infravermelho. A Fig. 4.3 mostra o espectro eletromagntico.

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Figura 4.3

Parte do espectro eletromagntico com destaque para os comprimentos

de onda da luz visvel.

A probabilidade de absoro para um nico comprimento de onda caracterizada pelo coeficiente de absoro molar para aquele comprimento de onda. Isto mais facilmente definido em termos de como ele medido. Se luz de intensidade I0 passa atravs de uma substncia (que pode estar em soluo) de espessura d e concentrao molar c, a intensidade I da luz transmitida obedece a lei de Beer-Lambert: I = I 0 10 d c ou log (I / I0) = d c

em que o coeficiente de absoro molar. Os dados de absoro podem ser colocados em porcentagem (%) de transmisso (T = 100 I / I0) ou, mais comu-

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mente, como a absorvncia A = log (I0 / I). Quando d = 1 cm, A comumente chamado de densidade tica (OD), em que o ndice informa o comprimento de onda em que a medida foi feita. A densidade tica conveniente, pois igual a c. Em alguns casos, se c alto, aparece como uma funo de c e pode ser dito que a lei de Beer-Lambert foi violada. Isto pode resultar do espalhamento ou das mudanas estruturais (por exemplo: dimerizao, agregao, ou mudanas qumicas) para concentraes altas. 4.1.2 Instrumentao para medio da absorvncia no visvel e ultravioleta As medidas de absorvncia so feitas em um espectrofotmetro. Como a maior parte dos estudos com biomolculas so feitos com molculas em soluo, nos ateremos a amostras desse tipo. Apesar de variarem em desenho, todos os
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espectrofotmetros consistem de uma fonte de luz, um monocromador (para a seleo dos comprimentos de onda), um porta-amostra transparente chamado de cubeta, um detector de luz, e um registrador para acumular os dados de sada do detector. A Fig. 4.4 mostra o esquema do espectrofotmetro HP-8452A , com deteco por arranjo de diodos. Em uma tpica operao, feita uma medio da luz transmitida somente pelo solvente (que pode ser um tampo ou uma soluo de molculas pequenas), seguida por uma medio da luz transmitida pela amostra quando dissolvida no mesmo solvente. O primeiro valor , ento, subtrado do segundo para se ter a absorvncia do soluto. Isso feito ao mesmo tempo para cada comprimento de onda da luz, de 2 em 2 nm, que atinge cada diodo do arranjo aps ter passado por uma rede de difrao. O instrumento ajustado para fazer a operao eletronicamente ou atravs de software, mostrando o espectro na tela de um computador.

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Figura 4.4

Esquema do espectrofotmetro HP-8452A. A luz da lmpada passa

atravs da amostra e solvente contidos em uma cubeta. Em seguida passa pela rede de difrao, para seleo do comprimento de onda, e atinge o arranjo de diodos para a deteco (da Silva, Tese de mestrado, PUC-Rio).

4.1.2 Parmetros medidos em espectroscopia de absoro

Figura 4.5

Exemplos de espectros de absoro. A partir de diferenas entre

espectros de amostras, freqentemente possvel identificar seus componentes moleculares (www.chemkeys.com).

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A Fig. 4.5 mostra espectros na regio UV-visvel para duas molculas biolgicas. Os parmetros usualmente medidos so DO (densidade tica) ou (coeficiente de absoro molar). O comprimento de onda correspondente ao pico de absoro mxima chamado mx , e para este comprimento de onda que geralmente medido. Algumas das bandas de absoro consistem de mltiplos picos e os comprimentos de onda correspondentes a esses picos tm coeficiente de absoro molar menores que o do mx e so freqentemente registrados.

4.1.3 Fatores que afetam as propriedades de absoro de um cromforo. O espectro de absoro de um cromforo primariamente determinado pela estrutura qumica da molcula. Entretanto, um grande nmero de fatores
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relacionados ao meio produz mudanas detectveis em mx e . Fatores relacionados ao meio consistem em mudanas no pH (que produzem mudanas na estrutura da molcula), na polaridade do solvente ou de molculas vizinhas, e a orientao relativa de cromforos vizinhos. So estes efeitos do meio que do as bases para o uso da espectroscopia de absoro na caracterizao das macromolculas. As caractersticas gerais desses efeitos relativos ao meio so os seguintes: Efeitos do pH. O pH do solvente determina o estado de ionizao de cromforos ionizveis (protonao e desprotonao pelo H+). Efeitos da polaridade. Depende da estrutura do cromforo e do tipo de transio. Para cromforos polares, freqente (especialmente se a molcula contm O, N, ou S) que mx ocorra para um comprimento de onda menor em solventes polares hidroxlicos (H2O, lcoois) que em solventes no polares. Efeitos da orientao. Caractersticas geomtricas (simetria, organizao) freqentemente tm fortes efeitos sobre mx e . O melhor exemplo o hipocromismo de cidos nuclicos. Como resultado de um grande nmero de estudos envolvendo compostos biolgicos e macromolculas cujas estruturas so bem conhecidas em vrias condies, um conjunto de fatos empricos levou construo de regras para a

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interpretao de espectros de absoro de biomolculas. As regras mais comuns so: 1. Se os aminocidos triptofano, tirosina, fenilalanina e histidina so desviados para um meio menos polar, mx e aumentam. Ento: a. Se o espectro de um destes aminocidos em uma protena em um solvente polar mostra que mx e so mais altos que os valores para os aminocidos livres no mesmo solvente, ento os aminocidos devem estar em uma regio interna da protena e cercados por aminocidos no polares. b. Se o espectro de uma protena sensvel a mudanas na polaridade do solvente, o aminocido mostrando as mudanas em mx e deve estar sobre a superfcie da protena (se no induzir mudanas conformacionais que exponham o aminocido).
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2. Para aminocidos, mx e sempre aumentam se um grupo titulvel (o OH da tirosina, o imidazol da histidina, e o SH da cistena) estiver carregado. Ento: a. Se nenhuma mudana espectral for observada para um desses cromforos e se o pH for tal que ocorra a titulao do aminocido livre, o cromforo deve estar localizado em uma regio no polar da protena. b. Se a mudana espectral como uma funo do pH indica que o grupo protonvel tem o mesmo pK como teria se estivesse livre em soluo, ento o aminocido est sobre a superfcie da protena. c. Se a mudana espectral como uma funo do pH indica um pK muito diferente, ento o aminocido deve estar em um meio fortemente polar ou cercado por grupos carregados (por exemplo: uma tirosina cercada por grupos carboxlicos ). 3. Para purinas e pirimidinas, diminui medida que seus sistemas de anis tornam-se paralelos e empilhados.

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4.2 Fluorescncia no Estado Estacionrio Em algumas molculas, a absoro de um fton seguida por emisso de luz de um comprimento de onda maior (menor energia). Esta emisso chamada de fluorescncia, transio de estado singleto para singleto (ou fosforescncia, se a transio for de estado tripleto para singleto). Como na espectroscopia de absoro, h muitos fatores que alteram o espectro de fluorescncia, portanto a eficincia da fluorescncia dependente desses fatores relacionados ao meio em que a amostra est inserida. As medidas de fluorescncia so mais sensveis que as medidas de absorvncia, apesar da espectroscopia de absoro ser mais simples de se realizar. As medidas de fluorescncia de macromolculas podem nos dar informaes sobre: conformao, stios de ligao, interaes com solventes, grau de flexibilidade, distncias intermoleculares e coeficiente de difuso rotacional de
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macromolculas. A teoria da fluorescncia no ainda adequada para permitir uma correlao positiva entre o espectro de fluorescncia e as propriedades do meio da amostra emissora. Mais uma vez a utilidade da tcnica baseada em princpios experimentais estabelecidos a partir de estudos com compostos modelos. 4.2.1 Teoria da Fluorescncia Como j mencionado na seo anterior, as molculas tm nveis discretos de energia. Os nveis de energia de uma molcula so descritos pelo diagrama de nveis de energia da Fig. 4.6. No diagrama so mostrados dois nveis eletrnicos, o de menor energia ou estado fundamental (G) e um de maior energia ou primeiro estado excitado (S1) e alguns dos nveis vibracionais de cada um.

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Figura 4.6

Diagrama de nveis de energia de um cromforo. G e S1 indicam o

estado fundamental e o primeiro estado excitado, respectivamente. Os estados vibracionais so representados pelas linhas finas horizontais. Esta molcula absorve luz pelas transies indicadas no diagrama. Depois da excitao, h perdas vibracionais para o nvel mais baixo do primeiro estado excitado e ento capaz de emitir luz por fluorescncia a partir desse estado (www.chemkeys.com).

Quando a energia da luz absorvida, a molcula passa de um nvel de energia mais baixo para um mais alto (nem toda transio possvel, as transies possveis so definidas pelas regras de seleo da mecnica quntica). Cada transio est indicada no diagrama por linhas verticais. Se a molcula est inicialmente no excitada (no seu estado fundamental, G) e a energia absorvida maior que aquela necessria para passar ao primeiro estado eletrnico excitado, S1, o excesso de energia pode ser absorvido como energia vibracional e a molcula estar em um dos nveis vibracionais mostrados na Fig. 4.6. Esta energia vibracional rapidamente dissipada como calor pelas colises com as molculas do solvente (se a molcula excitada est em soluo), e a molcula passa ao nvel vibracional mais baixo de S1. A molcula excitada, ento, retorna a G pela emisso de luz (fluorescncia) ou por uma transio no-radiativa. Como parte da energia perdida para o nvel mais baixo de S1, a luz emitida ter menos energia

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(maior comprimento de onda) que a luz absorvida. Assim, a luz de fluorescncia ter sempre um comprimento de onda maior que a luz de excitao. No entanto, ao retornar para G, a molcula pode ficar em um nvel vibracional que no seja o fundamental absoluto; esta energia vibracional ser, tambm, dissipada em forma de calor. Se existirem diferentes absorvedores, a luz emitida ser composta de diferentes comprimentos de onda (todos maiores que aqueles da luz absorvida); a probabilidade de decaimento do primeiro estado excitado para cada nvel vibracional do estado fundamental determina a forma do espectro de fluorescncia. Na Fig. 4.7 so mostrados espectros tpicos de absoro, de excitao e emisso de fluorescncia (A), bem como espectros de excitao e emisso de fluorescncia do triptofano (B).

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(A)

(B)
Figura 4.7 Espectros tpicos de absoro (tracejado), excitao (pontilhado) e

emisso (contnuo) de fluorescncia (A), bem como espectros de excitao e emisso de fluorescncia do triptofano (B) (www.chemkeys.com).

Como visto antes, uma molcula excitada nem sempre fluoresce. A probabilidade da fluorescncia descrita pelo rendimento quntico, Q, que a

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razo entre o nmero de ftons emitidos e o nmero de ftons absorvidos. Muitos fatores determinam Q, alguns deles so propriedades da prpria molcula (fatores internos) e outros so devidos ao meio em que se encontra (ambiente). Os fatores internos derivam principalmente da distribuio dos nveis vibracionais entre G e S. Por exemplo, se um nvel vibracional (VG) do estado fundamental tem a mesma energia de um nvel vibracional de ordem mais baixa do primeiro estado excitado (VS), pode ocorrer uma transio no-radiativa de VS para VG, seguido da converso da energia de VG em calor. Isto o que normalmente acontece com molculas flexveis, devido aos muitos nveis vibracionais altos de G. Este o meio mais comum para dissipar a energia de excitao e devemos considerar que as molculas fluorescentes (fluorforos) so raras e que so quase invariavelmente compostas por anis aromticos rgidos ou por sistemas de anis. Os fatores internos no so geralmente de interesse para estudos de propriedades das macromolculas. Os fatores do meio so mais importantes. O
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efeito do meio , primariamente, fornecer processos no-radiativos que competem com a fluorescncia e dessa forma reduzem o rendimento quntico Q; esta reduo de Q chamada de supresso da fluorescncia . Em sistemas biolgicos, a supresso normalmente o resultado dos processos de coliso (desde uma reao qumica at uma simples coliso com troca de energia) ou um processo radiativo mais longo chamado transferncia ressonante de energia. Estes trs fatores so expressos em uma situao experimental, envolvendo solues e compostos dissolvidos que interagem com o fluorforo (chamados supressores de fluorescncia), da temperatura, do pH, dos grupos qumicos vizinhos, ou da concentrao do fluorforo. O fluorforo isolado no apresenta processos noradiativos para perda de energia, mas somente fluorescncia. 4.2.2 Instrumentao para Medio da Fluorescncia A Fig. 4.8 mostra um arranjo padro para medidas de fluorescncia. Um feixe de luz de alta intensidade passa atravs de um monocromador para a seleo de um comprimento de onda de excitao (um comprimento de onda eficientemente absorvido pelo fluorforo). O feixe de luz de excitao passa atravs de uma clula contendo a amostra. Para evitar a deteco do feixe incidente, pode-se fazer a observao da fluorescncia em ngulo reto com o feixe

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incidente, pois a amostra ir emitir em todas as direes. A luz emitida (fluorescncia) passa atravs de um monocromador para a anlise do comprimento de onda e depois vai para um detector fotossensvel (tubo fotomultiplicador). Programas de computador automaticamente varrem os comprimentos de onda detectados e apresentam a intensidade de emisso como uma funo do comprimento de onda da luz emitida.

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Figura 4.8

Esquema de um sistema de fluorescncia semelhante ao utilizado no

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presente trabalho. A fluorescncia emitida em todas as direes pela amostra, mas a maioria dos sistemas analisa somente a que emitida a 90 em relao luz de excitao (www.chemkeys.com).

A intensidade da luz uma medida da energia E por unidade de rea por unidade de tempo. Devido resposta dos detectores de luz (tubos fotomultiplicadores) ser dependente do comprimento de onda e sendo E = hc/, a razo das sadas (correntes eltricas) produzidas pelo fotomultiplicador quando dois comprimentos de onda diferentes chegam nele, no so as mesmas que a razo das intensidades. No entanto, na maioria dos experimentos, uma simples medida da sada do fotomultiplicador suficiente, porque somente intensidades relativas para cada comprimento de onda esto sendo medidas por exemplo, a

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medida de fluorescncia na presena e na ausncia de um agente, se o agente no afeta a eficincia de absoro da luz de excitao. Entretanto, em alguns experimentos, necessrio medir Q ou determinar a distribuio da energia absoluta de um espectro de fluorescncia; ambos requerem medidas de intensidade absolutas. Para medir Q devemos fazer a contagem dos ftons, pois: Q = ftons emitidos / ftons absorvidos. Q uma quantidade adimensional. Como a energia, E, de um fton relacionada freqncia, , da luz pela relao E = h, uma medida do nmero de ftons requer a medida da energia da radiao e a correo pela freqncia. Medir o rendimento quntico absoluto um processo difcil e tedioso e raramente feito. O mtodo usual para determinar Q requer a comparao com um fluorforo de Q conhecido; duas solues so preparadas uma da amostra e outra do fluorforo padro e, com a mesma fonte de excitao, a fluorescncia integrada (a rea do espectro) de cada uma medida. Muito freqentemente, os espectros so mostrados como intensidade de
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fluorescncia (em unidades arbitrrias) versus . De fato, raro medir-se Q. 4.2.3 Medidas de fluorescncia intrnseca para estudo de protenas Dois tipos de fluorforos so usados em anlise de fluorescncia de macromolculas fluorforos intrnsecos (contidos nas macromolculas) e fluorforos extrnsecos (adicionados ao sistema, normalmente ligados a um de seus componentes). Para protenas, h somente trs fluorforos intrnsecos triptofano, tirosina e fenilalanina (em ordem de maior para menor Q). A fluorescncia de cada um deles pode ser distinguida pela excitao e observao em comprimentos de onda apropriados. Na prtica, a fluorescncia do triptofano a mais comumente estudada, porque a fenilalanina tem um Q muito baixo e a fluorescncia da tirosina freqentemente muito baixa devido supresso. A fluorescncia da tirosina quase totalmente suprimida se ela estiver ionizada, ou prxima de um grupo amino, um grupo carboxil, ou um triptofano. Em situaes especiais, no entanto, pode-se detect-la com excitao de 280 nm. A principal razo para estudar a fluorescncia intrnseca de protenas obter informaes sobre sua conformao. Isto possvel porque a fluorescncia tanto

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do triptofano quanto da tirosina dependem fortemente do seu ambiente (por exemplo: solvente, pH, a presena de um inibidor, uma molcula pequena ou um grupo vizinho na protena). O uso das medidas de fluorescncia intrnseca em protenas baseado em regras empricas obtidas de estudos de compostos modelos cujas estruturas e conformaes so bem conhecidas. As regras de uso mais comum so: 1. Toda fluorescncia de uma protena devido ao triptofano, tirosina e fenilalanina. 2. O mx. do espectro de fluorescncia do triptofano desvia-se para comprimentos de onda menores e a intensidade aumenta quando a polaridade do solvente diminui. a. Se mx. desviado para comprimentos de onda menores quando a protena est em um solvente polar, o triptofano deve estar internamente e em um
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ambiente no polar. (Um desvio do mx. em uma macromolcula em relao ao mx. do aminocido livre na gua). b. Se mx. desviado para comprimentos de onda menores quando a protena est em um meio no polar, ou o triptofano est na superfcie da protena ou o solvente induz uma mudana conformacional que traz o triptofano para a superfcie. 3. Se a substncia for um inibidor (se ela inibe a fluorescncia de um aminocido livre), como iodeto, nitrato ou ons de csio, suprimem a fluorescncia do triptofano ou da tirosina, os aminocidos devem estar na superfcie da protena. Se no ocorrer a supresso, ento: a. O aminocido pode ser interno. b. O aminocido pode estar em uma fresta de dimenses to pequenas que o inibidor no pode entrar em contato com ele. c. O aminocido pode estar em uma regio altamente carregada e a carga pode repelir o supressor. Por exemplo, o on iodeto (um inibidor negativo) falha em inibir a fluorescncia do triptofano se o triptofano estiver em uma regio carregada negativamente; o on Cs+ no atua se o fluorforo estiver em uma regio positiva. O supressor neutro, acrilamida, no afetado pela carga.

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4. Se a substncia no afeta o rendimento quntico do aminocido livre, mas afeta a fluorescncia da protena, ento deve estar ocorrendo uma mudana conformacional na protena. 5. Se triptofano ou tirosina esto em um meio polar, seus rendimentos qunticos (Q) diminuem com o aumento da temperatura, T, ao passo que, em um meio no-polar, ocorre uma mudana pequena. Conseqentemente, desvio do decrescimento padro (monotnico) de Q com aumento de T indica que o aquecimento est induzindo uma mudana conformacional, pois a polaridade das regies nas quais o triptofano est sendo exposto devem estar se modificando. Um aumento da dependncia de Q com a temperatura, quando a protena est em um solvente polar, como a gua, indica que mais molculas de triptofano esto sendo expostas ao solvente, ou seja, a protena est se desenovelando. 6. O rendimento quntico (Q) do triptofano e da tirosina decresce se o grupo PUC-Rio - Certificao Digital N 0321127/CA

carboxil destes aminocidos estiver protonado. 7. A fluorescncia do triptofano suprimida pela presena de grupos cidos protonados. Conseqentemente, se o pK medido por monitorao da fluorescncia do triptofano o mesmo que o pK de um grupo ionizvel conhecido (por exemplo: o imidazole de histidina ou a ligao SH de cistena), ento este grupo deve estar muito perto de um triptofano. No entanto, esta regra s se aplica se for possvel mostrar, de modo independente, que a mudana de pH no leva a mudana conformacional. 8. Se uma substncia qualquer liga-se a uma protena e a fluorescncia do triptofano suprimida, pode estar ocorrendo: i) mudana conformacional total devido ligao; ou ii) algum triptofano est no stio de ligao, ou muito prximo dele. Observaes: Dois pontos importantes devem ser ressaltados sobre as regras acima: 1- A fluorescncia muito sensvel a fatores do meio. Ento outras interpretaes devem sempre ser levadas em conta, para os resultados descritos nessas regras. 2- Se uma protena contm muitos triptofanos, como geralmente acontece, cada um pode ter um rendimento quntico diferente. Portanto, a magnitude absoluta das mudanas no pode ser usada para determinar a frao em um dado meio por exemplo, interno versus externo.