Evaluacin del efecto de los parmetros fsicos y qumicos de crecimiento de microalgas en cultivo heterotrfico sobre su potencial como fuente

de cidos grasos de cadena larga polinsaturados Microorganismos La composicin bioqumica y la regulacin del ciclo celular de las microalgas est fuertemente influenciado por las condiciones de crecimiento (Chisti, 2007; Pascal y cols., 2002; Ratledge y Wynn, 2002; Wen y Chen, 2003). La relacin entre la composicin elemental del alga y su velocidad de crecimiento se ha estudiado extensivamente con especial nfasis en el contenido de carbn, nitrgeno y fsforo (Droop, 1983). La composicin elemental de una clula est en funcin de un nmero de variables, incluyendo la disponibilidad de nutrientes, irradiacin, duracin del perodo luminoso, y la temperatura. En las diatomeas otro elemento, es el silicn, que tiene un importante rol en el metabolismo, dado que la divisin celular vegetal no se puede llevar a cabo sin la formacin de vlvulas de las clulas madre y el crecimiento celular no puede ocurrir sin la formacin de la banda de silicato (Pascal y cols., 2002). En general, la acumulacin de lpidos en las clulas microalgaes, as como en otros organismos oleaginosos est asociada con el agotamiento de un nutriente clave, generalmente nitrgeno; sin embargo en microalgas como Cryptheconidium conhii y Chlorella sorokiniana la acumulacin de lpidos se considera dependiente de un exceso de carbono y no de la limitacin de nitrgeno. Se puede generalizar que la acumulacin de lpidos puede atribuirse a un consumo de azcares ms veloz que el crecimiento celular, lo cual en consecuencia promover la conversin de estos azcares a lpidos (Chen y Johns, 1991; de Swaaf y cols., 2003; Ratledge y Wynn, 2002). Leman (1997) sugiri que este proceso se lleva a cabo en dos etapas: divisin celular exponencial seguida de un descenso en la velocidad de crecimiento (debido a la limitacin de nutrientes) acoplado a la acumulacin de lpidos. No obstante, las limitaciones de nitrgeno pueden desviar el metabolismo hacia la acumulacin de carbohidratos, tal como se ha observado en las diatomeas Achnanthes brevipes y Tetraselmis spp. (Guerrini y cols., 2000; Gladue y Maxey, 1994), se ha establecido que este mecanismo est dirigido a sostener la sntesis de protenas hasta que el medio contenga una cantidad apropiada de nitrgeno (Granum y cols., 2002; Guerrini y cols., 2000; Wilhelm y cols., 2006). Por otro lado, la acumulacin de lpidos en diatomeas se ha asociado al agotamiento de la fuente de silicato dada la dependencia de las diatomeas de este componente para crecer (Roessler, 1988; Wen y Chen, 2000; Wen y Chen, 2003; Wilhelm y cols., 2006). Otro de los factores que se han estudiado como direccionadores del metabolismo microalgal para la acumulacin de lpidos es el modo de cultivo: autotrfico, heterotrfico, mixotrfico; las microalgas Chlorella saccharophila, C. vulgaris, Nitzschia laevis, Cylindrotheca fusimormis, Navicula incerta, Tetraselmis suecica

acumulan ms lpidos cuando se crecen en modo heterotrfico que cuando se crecen en autotrfico. Esta acumulacin se da principalmente en forma de triglicridos ya que proveen ms energa al oxidarse que los cidos grasos poliinsaturados y por tanto son una mejor forma de almacenar energa (Day y cols., 1991; Gladue y Maxey, 1994; Tan y Johns, 1991; Tan y Johns, 1996). Los cidos grasos de cadena polinsaturada (EPA, C20:5 y DHA, C22:6) son dos lpidos importantes en el metabolismo de la edad temprana y adulta de los humanos y se han utilizado para tratar una amplia variedad de enfermedades y como suplementos alimenticios en humanos y organismos marinos en acuacultura (Apt y Behrens, 1999; Barclay et al., 1994; Chi et al., 2007; Vazhappilly y Chen, 1998; Wen y Chen, 2003). Los cidos grasos de cadena larga se ensamblas en una sucesin de enlaces carbono carbono de acetato y malonil-ACP (protena acarreadora de grupos acilo), iniciando con acetil-CoA como el sustrato inicial y terminando con acil-ACP. El acetil-CoA es producido a partir del piruvato generado durante la gliclisis o a partir de acetato libre llevado a los plstidos, probablemente activado por acetylCoA sintetasa en el estroma. Para un cido tpico de C18, se necesitan 16 molculas de NAD(P)H; en la oscuridad; la ruta de las pentosas fostafo es el productor del NADPH reducido (Somerville et al., 2000). Como se mencion antes, bajo condiciones heterotrficas se favorece la produccin de cidos grasos saturados, mientras que los cidos grasos altamente insaturados (C16:3 y C18:3) se producen principalmente en condiciones autotrficas. No obstante, la produccin de cidos grasos polinsaturados, EPA y DHA, es mayor el cultivos oscuros de las diatomeas Tetraselmis, Nitzchia laevis y N. alba (Day et al., 1991; Gladue y Maxey, 1994; Wen y Chen, 2000). La temperature tambin influencia el perfil de cidos grasos; cuando est por debajo de la temperatura adecuada para el crecimiento de la microalga se produce una mayor cantidad de cidos grasos insaturados, y el efecto inverso se observa a temperaturas superiores a la ptima de crecimiento. Decrecimientos de 10 a 15C llevan a un decremento en la fluidez de la membrana y compensan el decremento en la fluidez, y se observa una sobre expresin de los genes para las desaturasas promoviendo la desaturacin de los lpidos de membrana. Empero, no se observan cambios en la produccin de cidos grasos totales (Los et al., 1993; Quoc y Dubacq, 1997; Sakamoto y Bryant, 1997; Tatzusawa y Takizawa, 1995; Zhu et al., 2007). Se ha sugerido que el 1-oleoil-2-palmitoilmonogalactosil-snglicerol, un lpido molecular, est involucrado en la regulacin de la fluidez de la membrana durante la aclimatacin de la microalga a la temperatura; este compuesto se ha visto que se incrementa con incrementos de temperatura y decrece con decrementos (Sato y Murata, 1980). Otra explicacin para la insaturacin es el efecto positivo de las bajas temperaturas en el incremento de los niveles de oxgeno molecular en las clulas y la promocin de la actividad de las desaturasas y elongasas en la biosntesis de cidos grasos (Chen y Chen, 2006; Richmond, 1986, Wen y Chen, 2003).

Bioreactores Aunque la produccin a gran escala de biomasa microalgal generalmente aprovecha el cultivo continuo con la luz del da, alimentando medio fresco a velocidad constante, la alimentacin cesa durante la noche, provocando prdidas de alrededor de 25% de la biomasa producida durante el da; esta prdida se ve afectada por las condiciones ambientales prevalecientes (Chisti, 2007; Molina Grima y cols., 1999). Actualmente los mtodos de produccin a gran escala incluyen los estanques de pista de carreras y los fotobioreactores tubulares (Molina Grima y cols., 1999; Tredici, 1999). Sin embargo, en los sistemas abiertos la temperatura es difcil de controlar puesto que est expuesto a la atmsfera, esto ltimo provoca adems problemas de contaminacin microbiana por agentes externos, adems, la concentracin de biomasa es baja debido a un mezclado pobre de los nutrientes. La ventaja operativa de esta configuracin es su bajo costo. Los fotobioreactores por su parte son capaces de producir altas cantidades de biomasa sin contaminacin externa. Consiste de una serie de tuberas orientadas para capturar la mxima cantidad de luz solar posible. En este tipo de configuracin se puede mantener un buen mezclado al usar flujos turbulentos de alimentacin usando una bomba peristltica o de aire. Este tipo de reactor requiere no obstante un continuo control de los flujos de CO2 y O2 y del pH del medio (Wen y Chen, 2003; Chisti, 2007; Molina Grima y cols., 1999; Molina Grima y cols., 2003; Tredici, 1999; Pulz, 2001; Carvalho y cols., 2006). Una alternativa efectiva para este tipo de bioreactores son los reactores de crecimiento heterotrfico (Chen, 1996). Los microorganismos a crecer en este tipo de reactores deben poseer las siguientes caractersticas: (1) habilidad para multiplicarse y metabolizar en la oscuridad; (2) habilidad para crecer en medio de bajo costo y fcilmente esterilizable; (3) rpida adaptacin a nuevos ambientes; y (4) capacidad de soportar el estrs hidrodinmico en el reactor y los equipos perifricos (Wen y Chen, 2003). El modelo heterotrfico elimina dos de las mayores deficiencias de los reactores fotoautotrficos: a) difusin de la luz en reactores de volmenes superiores de 50 a 100 L y b) altos costos de inversin (Chen, 1996; Pulz, 2001; Carvalho y cols., 2006), permitiendo el uso de fermentadores ms prcticos tales como los usados en la produccin industrial de una gran variedad de bienes como las medicinas, las bebidas, los aditivos de alimentos y energa, lo cual reduce significativamente la mayora de los costos del proceso (Gladue y Maxey, 1994). La reduccin de costo y la relativa simplicidad de operacin son los principales atractivos del cultivo heterotrfico. Muchos de los estudios recientes mostraron que los cultivos heterotrficos estn adquiriendo mayor inters para la produccin de una amplia variedad de metabolitos en todas las escalas desde laboratorio hasta industrial (Chen, 1996; Chen y Chen, 2006; Sansawa y Endo, 2004; Wen y Chen, 2003; Yang y cols., 2000). El cultivo heterotrfico no obstante es inapropiado para la mayora de las microalgas (Lee, 2001). An as, algunas especies pueden crecerse efectivamente en completa oscuridad y por tanto su cultivo puede llevarse a cabo en fermentadores convencionales. Algunas microalgas verdes y algunas otras

diatomeas como Nitzschia laevis, Navicula inceerta, Phaeodactylum tricornutum figuran entre un limitado nmero de especies de microalgas capaces de crecer en condiciones heterotrficas, con un crecimiento incluso mayor que en cultivos autotrficos (Chen y John, 1991; Endo y cols., 1977; Shi y cols., 2000). Por ejemplo, en condiciones cclicas de cultivo autotrfico/heterotrfico, la produccin celular de Chlorella es aproximadamente 5.5 veces mayor que en cultivos fotoautotrficos; en estos mismos cultivos las clulas producen 16 veces ms ATP en la etapa heterotrfica (Yang y cols. 2000). En las diatomeas, el crecimiento heterotrfico est vinculado a su capacidad de mantener la fotosntesis en ambientes oscuros usando la clororespiracin hasta la restauracin de las condiciones de iluminacin, proceso beneficiado por la alta acumulacin de lpidos (Whilhelm y cols., 2006). Adems del modo de cultivo, la configuracin del reactor y la regulacin de sus parmetros pueden cambiar el metabolismo microbiano, por ejemplo, en reactor por lote o reactor continuo operando a bajas tasas de dilucin se puede presentar inhibicin de crecimiento debido a la acumulacin de metabolitos que pudieran resultar inhibitorios del crecimiento, o bien inhibiciones por altas concentraciones de sustrato o de algn factor de crecimiento; por otro lado, si el reactor se opera a altas tasas de dilucin, cercanas al punto de lavado, se observa un incremento en la actividad microbiana (Grady y cols., 1999; Tchobanoglous y Burton, 1991). Otros factores como el oxgeno disuelto, el pH, la temperatura, tambin tienen efectos notables sobre el crecimiento y el metabolismo microbiano (Chi y cols., 2007; de-Bashan y cols., 2005; Nielsen y cols., 2003; Schmidt y cols. 2005). Por otro lado, el trabajo con clulas inmovilizadas presentan algunas ventajas a considerar sobre los reactores con clulas libres: (a) altas producciones celulares ya que no hay riesgo de lavado celular; (b) existen bajos riesgos de competencia trfica por otros microorganismos ajenos al sistema; (c) la produccin de biomasa es constante; (d) el pH y el flujo de gases es fcil de controlar; (e) la biomasa es fcilmente retirada del sistema por decantacin evitando costos de filtracin y/o centrifugacin. Hiptesis Si los microorganismos regulan su metabolismo en funcin de los nutrientes que se encuentran disponibles, la deficiencia de un nutriente en particular puede derivar en la acumulacin de metabolitos especficos como una respuesta de supervivencia. Las clulas crecidas en agentes inmovilizantes tendrn la misma capacidad de acumulacin de metabolitos de reserva de energa que los sistemas de clulas libres. Si la configuracin del bioreactor as como los parmetros de operacin tienen influencia en el metabolismo microbiano, entonces existen condiciones de

configuracin de reactor que optimizan la produccin de metabolitos de inters especfico (lpidos, carbohidrato, protenas). Las combinaciones especficas de nutrientes configuracin de bioreactor impactarn de manera positiva en la acumulacin de metabolitos de reserva de energa diferentes (lpidos, carbohidratos o protenas) habiendo una combinacin ptima para la acumulacin de cada uno de ellos. Objetivo General Determinar el efecto de la inmovilizacin, el pH, la temperatura, la agitacin y concentracin de sustrato en la composicin bromatolgica de dos cepas de microalgas. Objetivos Particulares 1. Evaluar el efecto de la inmovilizacin en diferentes soportes en la composicin bromatolgica (lpidos, carbohidratos y protenas) de las microalgas y la produccin de biomasa. 2. Determinar el efecto de los parmetros de operacin de los biorreactores en lote sobre la composicin bromatolgica de las microalgas (aireacin, concentracin de fuente de carbono, pH, temperatura). Metas Generar conocimiento referente al comportamiento metablico de las microalgas a travs del monitoreo de su perfil bromatolgico cuando se cambian los parmetros de crecimiento en reactores a escala laboratorio. Generar un esquema sobre parmetros de operacin que direccionan la acumulacin de lpidos insaturados en microalgas para su uso en procesos productivos. Un estudiante de licenciatura afn al rea (Biotecnologa, Biologa, Ambiental) y un estudiante de maestra en el rea de Biotecnologa o afn. Realizar una estancia de investigacin nacional. Publicar dos artculos de investigacin en revistas indizadas a nivel internacional. Presentar los trabajos desarrollados en un congreso nacional y uno internacional.

Metodologa a) Microorganismos y condiciones de cultivo a. Microalgas: Las que digan ustedes se crecern en reactor por lote usando medio especfico por 10 das antes de utilizarse en los experimentos. b. Los experimentos de cultivo para determinar el efecto de la inmovilizacin en las microalgas se harn en medio especfico adicionado con una fuente de carbono a una concentracin de 5 g/L durante 20 das en las condiciones requeridas, ver diseo experimental Tabla 1. Los volmenes de operacin sern de 150 mL en matraces erlenmeyer de 250 mL de capacidad. c. Los experimentos de cultivo para establecer los parmetros que afectan la acumulacin de lpidos insaturados en microalgas se corrern en 100 mL de medio de cultivo utilizando matraces de 250 mL como reactor modelo variando las condiciones fisicoqumicas segn se describe en el diseo experimental de la Tabla 2. Una vez se descarten los factores no significativos se correr un diseo de composicin central adecuado a los factores importantes. b) Inmobilizacin de las microalgas a. Los cultivos axnicos se concentrarn por centrifugacin a 6000 rpm por 15 minutos, despus se lavarn con solucin salina 0.85% dos veces; cada una ser resuspendida en un volumen adecuado de solucin salina hasta alcanzar una densidad ptica de 0.5 equivalente a 1.7 x 108 clulas/mL. En el caso del alginato se inmovilizarn las clulas al 10% v/v. En el caso del olote se considerar el hecho de que por cada 100 mL mezcla alginato + microalga (10% v/v) se obtienen 40 g de esferas, se tienen 4.25 x 105 clulas/g de esfera, de tal manera que se tratar de inmovilizar la misma cantidad de clulas por gramo de soporte. En cualquiera de los dos casos se colocar una cantidad igual de clulas inmovilizadas en cada reactor. Se utilizarn clulas libres a igual concentracin que en los casos anteriores como control. c) Recuperacin de la biomasa a. En el caso de los cultivos de clulas libres se recuperar por centrifugacin y en el caso de los inmovilizados, por decantacin y lavado con solucin salina. d) Diseos Experimentales a. Efecto de los agentes inmovilizantes en las propiedades bromatolgicas de las microalgas y en la produccin de biomasa. Se crecern las diferentes microalgas en dos soportes diferentes usando el medio de cultivo especfico para hacer comparaciones estadsticas entre la generacin de biomasa, lpidos totales y cidos grasos poliinsaturados. Se utilizar el diseo mostrado en la tabla 1, corriendo los experimentos por triplicado. Se evaluar cada una de las variables por separado para obtener el mejor tratamiento en cada caso. El mismo procedimiento se har para cada una de las cuatro cepas. Slo los

mejores 3 tratamientos de cada cepa sern sometidos a anlisis de perfil de cidos grasos por cromatografa. b. Determinar el efecto de los parmetros de operacin de los biorreactores en lote sobre la composicin bromatolgica de las microalgas (aireacin, concentracin de fuente de carbono, pH, temperatura). Se correr un diseo factorial fraccionado 25-1 para descartar factores de proceso (Tabla 2). Una vez que se hayan descrito los mejores factores de proceso se correr un Diseo de Composicin Central adecuado al nmero de factores establecidos como influyentes en el perfil de lpidos totales y cantidad de cidos grasos poliinsaturados. Las 16 muestras debern ser analizadas para lpidos totales y cidos grasos poliinsaturados como se describe adelante. Tabla 1. Diseo Factorial Multinivel para Inmovilizaciones
Agente Inmovilizante A O N A O N A O N A O N Esterilidad del Agente No No No Si Si Si No No No Si Si Si Esterilidad del Medio No No No No No No Si Si Si Si Si Si

A: Alginato; O: Olote; N: Clulas Libres Nota: En el caso de clulas libres slo se evaluar la esterilidad del medio. Tabla 2. Diseo Fractorial Fraccionado 25-1
Aireacin 80 130 80 130 80 130 80 130 80 % Carbono 1 1 5 5 1 1 5 5 1 pH 4.5 4.5 4.5 4.5 6.5 6.5 6.5 6.5 4.5 Temperatura Iluminacin (C) 20 1 20 -1 20 -1 20 1 20 -1 20 1 20 1 20 -1 30 -1

130 80 130 80 130 80 130

1 5 5 1 1 5 5

4.5 4.5 4.5 6.5 6.5 6.5 6.5

30 30 30 30 30 30 30

1 1 -1 1 -1 -1 1

*Iluminacin: (-1) Fotoautotrfico y (+1) Heterotrfico e) Determinaciones bromatolgicas a. Extraccin y transesterficiacin directa de lpidos. Las clulas libres o inmovilizadas en alginato sern liofilizadas para su posterior tratamiento de extraccin de lpidos por el mtodo descrito por Rodrguez Ruiz y cols. (1998) con ligeras modificaciones. Brevemente, aproximadamente 20 mg de muestra seca se colocarn en un tubo de ensayo con 1 mL de mezcla de metilacin (metanol/cloruro de acetilo, 20:1 v/v) y 1 mL de hexano. Las muestras se calentarn a 100C durante 10 minutos. Despus de enfriar a temperatura ambiente se adicionar 1 mL de agua destilada. La fase superior (de hexano) se recuperar y se har una segunda adicin de hexano para recuperar de nuevo la fase de hexano, ambos recuperados se colocarn en un tubo de ensayo limpio. Las mezclas se secarn totalmente con nitrgeno gaseoso y se resuspendern en 200 L de hexano; 100 L de este volumen se colocar en un vial de cromatografa para el anlisis del perfil de lpidos y 100 L se utilizarn para cuantificar lpidos totales por el mtodo de Marsh y Weinstein (1966). b. Cuantificacin de lpidos totales. Se determinarn lpidos totales por calcinacin por el mtodo de Marsh y Weinstein (1966). Una alcuota de 100 L de los lpidos extrados se evaporar hasta sequedad con nitrgeno gaseoso y se adicionarn 2 mL de H2SO4 concentrado, se sellarn los tubos con aluminio y tapa de rosca. Los tubos se sometern a calentamiento a 200 2 C en estufa durante 15 minutos. Se dejarn reposar 5 min a temperatura ambiente y se enfriarn en bao de agua con hielo durante 5 minutos. Se agregarn 3 mL de agua destilada y se mezclaran en vortex hasta lograr una mezcla homognea. Se leer la absorbancia a 375 nm calibrando el equipo con un blanco de cido sulfrico que se trata de igual manera que las muestras. La curva de calibracin se har con estndares de triglicridos (triestearina, tripalmitina o triheptadecanoina), esteroles (colesterol) y fosfolpidos (fosfatidilserina) a concentraciones conocidas entre 30 y 180 g/mL. Se prepararn tres curvas de calibracin y se obtendr el promedio de la pendiente. c. Se estudiar el perfil lipdico por cromatografa de gases con espectrmetro de masas. Anlisis externo de las muestras extradas (inciso a).

Cronograma de Actividades Actividad Revisin bibliogrfica Preparacin de cultivos Diseo de Experimentos 1 Anlisis de bromatolgico Actividad Revisin bibliogrfica Preparacin de cultivos Diseo de Experimentos 2 Anlisis de bromatolgico Distribucin de Gastos Gasto
Balanza analtica cap. 210 g sensibilidad 0.1 mg Bomba peristltica de medio flujo de 0.4 a 85mL/min Remodelacin de laboratorio para microbiologa Kit de micropipetas flujo variable Reactivos y materiales de laboratorio Autoclave vertical con control digital de temperatura Anlisis externo de muestras Papelera y bibliografa Totales parciales

0 1.5 X X X 0 1.5 X X X

Perodo 1 (6 meses) 1.5 3.0 3 4.5 4.5 6.0 X X X X X X X Perodo 2 (6 meses) 1.5 3.0 3 4.5 4.5 6.0 X X X X X X X X X

0 1.5
$ 27,000 $ 5,000 $ 45,000 $ 10,027 $ 40,000

Perodo 1 (6 meses) 1.5 3.0 3 4.5 4.5 6.0

$ 40,000 $ 81,200 $10,000 $ 4,000 $ 54,000

$ 4,000 $131,027

$ 81,200

Gasto
Centrifuga refrigerada con rotor para tubos de 50ml y 20 ml Kit de micropipetas flujo variable Reactivos y materiales de laboratorio Micropipeta de 0.5 a 5 mL Papelera y bibliografa Anlisis externo de muestras Totales parciales Total General

0 1.5

Perodo 2 (6 meses) 1.5 3.0 3 4.5 4.5 6.0

$117,000

$ 10,027 $ 30,000 $ 7,000 $ 4,000 $ 51,027

$ 40,000 $ 4,000 $ 20,000 $ 20,000

$161,000 $ 498,254

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