Microbiologa

Ander Bastida Salazar,3 de Biologa

2012

INDICE
Seccin I: Introduccin a la microbiologa - Tema I: Historia de la microbiologa y diversidad del mundo microbiano-> Pag. 3 - Tema II: Metodos para observar microrganismos y estudiar su estructura-> Pag. 10 Seccin II: Estructura y funcin de los microrganismos - Tema III: Estructura de la celula procariota -> Pag. 21 - Tema IV: Virologa -> Pag. 34 Seccin III: Nutricin y crecimiento Tema V: Nutricin microbiana -> Pag.45 Tema VI: Cultivo de microrganismos -> Pag. 54 Tema VII: Crecimiento microbiano -> Pag. 63 Tema VIII: Factores ambientales -> Pag. 75 Tema IX: Control de crecimiento -> Pag. 87 Tema X: Quimioterpicos -> Pag. 97

Tema I: Historia de la microbiologa y diversidad del mundo microbiano

Los microorganismos necesitan una metodologa especial para su estudio, se necesita un microscopio. Se utiliza la esterilizacin y hay que hacer obtencin de cultivos puros. Tienen una organizacin simple, no tienen tejidos y carecen de orgnulos con membrana. 1. Los microorganismos como clulas En las condiciones adecuadas los microorganismos tienen metabolismo, se reproducen, evolucionan, experimentan alguna clase de diferenciacin, tienen capacidad de comunicacin. Pueden tener capacidad de moversepor lo tanto los microorganismos son organismos unicelulares. 2. Historia La primera descripcin de los microorganismos la hizo Robert hook, este se fijo que en el cuero sala una especie moho verde, y con su lupa, dibujo los cuerpos fructferos de los hongos. Luego al observar un corcho, observo celdas, y esa fue la primera descripcin de un tejido. El primero que observo las bacterias fue Anthony van Leeuwenhoek, este seor fue mercader de ropa. Y con ayuda del cuentahlos, observo unos animaculos. Unos eran redondos(cocos) otros alargados(bacilos) Durante muchos aos, hubo una controversia con la generacin espontaneo o abiognesis. La abiognesis define que las clulas vivas pueden originarse a partir de materia no viva, mientras que la biognesis, defendia que las clulas vivas solo pueden surgir de clulas vivas preexistentes. Estas dos teoras estuvo mucho tiempo en controversia, hasta que Francisco Redi refuto la abiognesis en 1668. El demostr el origen biolgico de los insectos.

Coloc una vbora muerta, un pescado y un trozo de carne de ternera en frascos, los cerr y sell. En otros frascos coloc los mismos componentes, pero los dej abiertos. Los resultados fueron muy interesantes. En los frascos cerrados y sellados no haba gusanos, aunque su contenido se haba podrido y ola mal. En los frascos abiertos, en cambio, se vean gusanos y moscas que entraban y salan. Por lo tanto, la carne de los animales muertos no puede engendrar gusanos a menos que sean depositados en ella huevos de animales. Redi pens que la entrada de aire a los frascos cerrados pudiera haber influido en su experimento, por lo que llev a cabo otro. Puso carne y pescado en un frasco cubierto con gasa y lo coloc dentro de una jaula cubierta tambin con gasa.Los resultados fueron exactamente los mismos que en el primer experimento. An con los resultados obtenidos y los de otros autores, no slo la gente segua creyendo en la generacin espontnea, sino que el propio Redi continuaba convencido de que algunos insectos se generaban en forma espontnea. John Needham en cambio, defendi la abiognesis con otro experimento. Hirvi caldo de carne para destruir los organismos preexistentes y lo coloc en un recipiente que no estaba lo debidamente sellado ya que segn su teora, se necesitaba aire para que esto se llevara a cabo. Al cabo de un tiempo observ colonias de microorganismos sobre la superficie y concluy que se generaban espontneamente a partir de la materia no viva. En 1769, Lazzaro Spallanzani repiti el experimento pero tapando los recipientes de manera correcta, evitando que aparecieran las colonias, lo que contradeca la teora de la generacin espontnea. Pero Needham argument que el aire era esencial para la vida incluida la generacin espontnea de microorganismos y este aire haba sido excluido en los experimentos de Spallanzani,en concreto, lleg a afirmar que Spallanzani destrua lo que l llamaba la "fuerza vegetativa", sin embargo, Spallanzani volvi a abrir los recipientes donde supuestamente se haba destruido esa "fuerza vegetativa" y observ cmo seguan apareciendo los organismos. Utilizando el experimento de Spallanzani, Appert lo puso en practica para conservar alimentos (appertizacion)

Louis Pasteur puso fin a la controversia de la generacin espontanea. En la segunda

mitad del siglo XIX, Louis Pasteur realiz una serie de experimentos que probaron definitivamente que tambin los microbios se originaban a partir de otros microorganismos. Pasteur estudi de forma independiente el mismo fenmeno que Redi. Utiliz dos frascos de cuello de cisne (similares a un Baln de destilacin con boca larga y encorvada). Estos matraces tienen los cuellos muy alargados que se van haciendo cada vez ms finos, terminando en una apertura pequea, y tienen forma de "S". En cada uno de ellos meti cantidades iguales de caldo de carne (o caldo nutritivo) y los hizo hervir para poder eliminar los posibles microorganismos presentes en el caldo. La forma de "S" era para que el aire pudiera entrar y que los microorganismosse quedasen en la parte ms baja del tubo. Pasado un tiempo observ que ninguno de los caldos presentaba seal alguna de la presencia de algn microorganismo y cort el tubo de uno de los matraces. El matraz abierto tard poco en descomponerse, mientras que el cerrado permaneci en su estado inicial. Pasteur demostr as que los microorganismos tampoco provenan de la generacin espontnea. Gracias a Pasteur, la idea de la generacin espontnea fue desterrada del pensamiento cientfico y a partir de entonces se acept de forma general el principio que deca que todo ser vivo procede de otro ser vivo. An se conservan en museo algunos de estos matraces que utiliz Pasteur para su experimento, y siguen permaneciendo estriles.

Pasteur no considero que haba bacterias muy resistente al calor, por lo tanto tuvo suerte, a Tyndall, sin embargo le paso lo contrario, vio que no bastaba con el calor para , matar a los mcroorganismos. Debido a esto creo una esterilizacin termoresistente denominada Tindalizacion.

3. Ramas de la microbiologa En sus inicios la microbiologa se desarrollo en tres ramas: La microbiologa medica: Teoria microbiana de la enfermedad, esta teora deca que los microorganismos producan enfermedades. La microbiologa de los alimentos La microbiologa de suelo

3.1 Microbiologa mdica A partir de la teora microbiana de la enfermedad Robert Koch en 1876 puso fin a la enfermedad causada por la bacteria bacilar Bacillus anthracis, el carbunco, lo que le permitio desarrollar los postulados de Koch, que son los siguientes: Postulados de Koch: 1. Los microorganismos tienen que estar presentes en todos los enfermos, y ausentes en todos los sanos. 2. Este microorganismo tiene que poderse cultivar en cultivo puro. 3. El microorganismo cultivado debe producir la enfermedad. 4. El microorganismo debe ser reaislado e idntico al original El a lo largo de sus estudios puso a punto la tcnica asptica. (mantener los cultivos puros) Robert Koch recibi el premio nobel por descubrir el agente causal de la tuberculosois, producido por la Mycobacterium tuberculosis, popularmente conocido como bacilo de Koch.

3.1.1 El control de enfermedades: Antisepsis: Ignaz Semmelweis intento disminuir los casos de fiebre puerperal , con algo tan simple de advertir de que si el medico se lavaba las manos antes del parto se reduciran los casos de esta fiebre. Ciruga asptica: Tratar el material quirurjico para evitar enfermedades. A el le hicieron mas caso porque coincidi con la guerra francoprusiana y los mdicos de guerra los pusieron en practica. Inmunizacion: Edward Jenner se fijo que las seoras que ordeaban las vacas no padecan la viruela, y que poda ser porque estaban en contacto con la tuberculosis bovina. Ha habido dos grandes escuelas, la escuela de Paris en la que el representante fue Pasteu y la escuela de Berlin con Koch como representanter. La escuela de Paris a lo largo de sus estudios pusieron a punto una serie de tcnicas como, los flitros bacteriolgicos(deteccin de virus despus) y el autoclave. La de Berlin(koch) aportaron innovaciones tcnicas como los agentes solidificantes(agar), las placas de cultivo (Petri) La tercera lnea en la que se trabajo para controlar las enfermedades fue la quimioterapia, es decir buscar compuestos para curar las enfermedades. Hubo trabajo de mucha gente pero los mas importantes: Paul Erlich: Bala Magica, matraba el agente que provocaba la sfilis. Flemming: Observo que alrededor de un hongo no crecan las bacterias, sigui estudiandolo y luego Florey y Chain lo desarrollaron qumicamente para aprovecharlo. Wacksman: trabajaba con microorganismos del suelo, y descubri microorganismos que mataban a los microorganismos de alrededor,es decir, productores naturales de antibiticos como la neomicina, tetraciclinas, cloranfenicol. 3.2 Microbiologa de los alimentos Otra rama de la microbiologa fue la micro. de los alimentos. Destacable el estudio de la fermentacin. Uno de los que contribuyo mas a la idea de que los microorganismos transformaban materias fue Pasteur. El tenia un amigo que trabajaba produciendo alcohol a travs de remolachas. Observo que algunas partidas eran acidas. Estudio esto y vio que lo normal era que en los lotes que salan buenos se transformaran por actividad de las levaduras en alcohol y CO2, y en otras ocasiones, se desarrollaban microorganismos que llevaban a cabo la fermentacin acidolactica lo que producia ese sabor en el alcohol. Conclusion, los microorganismos pueden llevar a cabo distintas fermentaciones con distintos productos finales. En el desarrollo de todos estos estudios llego a descubrir la vida anaerobia y puso a punto un metodo que llamo Pasteurizacin que conservaba los alimentos y evitaba

fermentaciones indeseadas. Se trataba de tratar el vino a 62 grados durante 30 minutos. Este principio se aplica ahora tambin con la leche. Haba controversia en cuanto a la fermentacin alcohlica, por una parte estaba la idea de que era por las levaduras, y otros decan que era un proceso quimico. Pasteur borro esta controversia con lo anterior. 3.3 Microbiologa del suelo Otra rama es la micro del suelo. La micro de suelo dice que los microorganismos son agentes geoqumicos. Winogradssky descubri que haba microrganismos que obtenan energa a travs de productos inorgnicos, del nitrgenode muchas fuentes. Beijerinck investigo sobre el papel de los microorganismos en los ciclos de C,N y S. Todos estos avances fueron acompaados de avances en tcnicas que permitieron el descubrimiento de los virus. Iwanosky descubri el virus del mosaico del tabaco. Lo descubrieron gracias a los filtros, pero fue Beijerink el que se dio cuenta que era un tipo diferente de organismo diferente de las bacetrias, mas pequeo. Mas tarde Stanley consigui cristalizarlos. 4. Etapas de la microbiologa

5. Los microrganismos en el rbol filogentico Un sistema usado bastante es el de whitakker, por un lado dividia la estructura celular, y por otro el tipo de nutricin, y asi clasifico 5 reinos, (animalia, plantae, monera, ). En 1977 Woese y Fox clasificaron los organismo segn el cdigo gentico y distinguieron 3 reinos, los urkariotas, las archaeas y los eukaryotas. Woese luego lo refino mas y se llego al sistema de woese,kandler y wheelis y se llego a tres dominios, Archaebacteria, Eukaryotae y Urkaryota.

Tema II: Mtodos para observar microrganismos y observar su estructura

Desde el punto de vista histrico, la microbiologa floreci cuando fue posible ver a los miccroorganismos. En otras palabras, el desarrollo de la microbiologa fue paralelo al de la microscopa. Estos es particularmente adecuado en lo que especta al tema que vamos a trata, la diversidad microbiana. Comenzaremos primero nuestro viaje por el mundo microbiano considerando primero los diferentes tipos de microscopios y la aplicacin de los principios de microscopa que nos permiten observar los microrganismos. 1. Microscopia ptica

En general, el microscopio ptico se utiliza para ver clulas intactas a relativamente bajos aumentos. Los microscopios pticos son aparatos que se sirven de la luz. Cuando la luz interacciona con las partculas le pueden ocurrir varias cosas. A veces se refleja, otras traspasa la particula, otras veces es absorbida por la celula, otras se reemite una luz de caractersticas distintas, otras veces la luz se desvia, y otras la luz se dispersa.

Los microscopios necesitamos que nos aumente el microorganismo, pero tambin que se vea ntido, de manera que, necesitamos estas dos propiedades, gran poder de amplificacin y gran poder de resolucin. Poder de amplificacin: Es la capacidad del microscopio para aumentar el tamao de los organismos. Para conseguirlo van a tener una serie de lentes. Para ello tendremos la lente del ocular(10x) y la de los objetivos(10/40/50)

Poder de resolucin: Es el que nos da la nitidez de imagen. Es a capacidad que tiene un microscopio de permitir distinguir dos puntos que estn muy cerca. Si un microscopio hace que vea dos puntos como uno, es que tiene poco poder de resolucin, si veo dos puntos bien separados, podremos determinar que tiene un alto poder de resolucin. El limite de resolucin(d) es la distancia minima a la que tienen que estar dos puntos para que una lente los vea separados. El microscopio tendr mejor poder de resolucin cuanto mas pequeo sea el limite de resolucin; cuando mas pequea sea la distancia a la que el microscopio me permite ver esos dos puntos separados, mas poder de resolucin tendr ese microscopio. El valor del limite de resolucin(d) viene dado por la ecuacin de Abb.

Para bajar el poder de resolucin, es decir, obtener una menor ``d debemos bajar la longitud de onda o subir la apertura numrica, que es la medida de captacin de luz por una lente. Otros conceptos de microscopa ptica son: Profundidaz de campo: Es el rango en el que la muestra esta enfocada. Distancia de trabajo: Distancia a la que queda enfocada la muestra. Cuanto mayor es el aumento del objetivo ms cerca est del objeto menor es la lente por lo que llega menos luz al ojo. A mayor aumento menos luminosidad Campo de visin: Area de anlisis de la muestra. Podemos diferenciar dos microscopios segn su complejidad.

1.1 Microscopa ptica simple Una lente biconvexa

1.2 Microscopa ptica compuesta: Tienen varias lentes.

Dentro de estos esta el de campo claro, que es el que utilizaremos. 1.2.1 Microscopio de campo claro

Con el microscopio de campo claro las muestras se visualizan gracias a las diferencias de contraste de ellas y el medio que los rodea, y estas diferencias se producen porque las clulas absorben y dispersan la luz en diferentes grados. Esta compuesto por tres tipos de lentes: Condensador Objetivos Oculares

Posee algunas limitaciones, entre las que se destaca que muchas clulas bacterianas son difciles de observar debido a su falta de contraste con el entorno ya que

absorben/dispersan la luz en casi la misma medida. Los microrganismos pigmentados son una excepcin, pues su color aade contraste y mejora la visualizacin. En el caso de las clulas sin pigmentacin hay varios modos de aumentar el contraste, entre los que destacaremos las tinciones. 1.2.1.1 Tinciones

El proceso de tincin se compone de varios pasos. Lo primero seria extender la muestra en el portaobjetos y dejar que se seque al aire. Luego vendra el proceso de fijacin. La fijacin es el proceso por el cual se preservan las estructuras tanto internas como externas de una muestra. El organismo se muere y queda pegado al portaobjetos. Se puede hacer de dos maneras; mediante calor (preserva la morfologa pero no las estructuras) y qumicamente ( preserva la morfologa y las estructuras internas). Despues de fijar la muestra, vendra el paso de la tincin. Es en este paso donde se procedera a echar el colorante en la muestra. Los colorantes son compuestos orgnicos y cada tipo de colorante tiene afinidad por determinados componentes celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia en microbiologa estn cargados positivamente (catinicos-azul de metileno, cristal violeta, safranina) y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Tambin existen colorantes aninicos como la eosina o la nigrosina, y liposolubles como el negro Sudn. Hay 3 tipos de tinciones, la simple,diferencial y selectiva: -En las tinciones simples se utiliza un nico colorante. Las clulas y el medio reaccionan de forma distinta al colorante y es esto lo que nos permite observar el tamao y la forma de las bacterias. Dentro de las tinciones simples diferenciamos 2:

*Tincin positiva: Se tie el microrganismo. (Azul de metileno, safranina, verde malaquita)

*Tincin negativa: Se tie el medio. ( negrosina, tina china)

-Las tinciones diferenciales son aquellas en las que se utiliza ms de un colorante. Los microrganismos reaccionan de forma distinta a los colorantes debido ala distinta composicin de alguna estructura celular. Se usan para clasificar y diferenciar grupos de bacterias. Vamos a destacar dos tinciones diferenciales que son las mas importantes, y son la tincin de gram, y la tincin de cido-alcohol resistencia.

*Tincin de gram: Dependiendo de la respuesta a esta tincin, las bacterias pueden subdividirse en dos grandes grupos: las gram + aparecen de color morado y las gram aparecen de color rosa. Esta diferente respuesta a la tincin de gram se basa en la estructura de la pared celular de las clulas grampositivas (pared celular mas gruesa) y las clulas

gramnegativas ( pared celular mas fina). Despus de teir con un colorante bsico, que normalmente es el cristal violeta, se trata a las clulas con etanol porque este alcohol es capaz de decolorar a las clulas gramnegativas pero no las grampositivas. A continuacin se utiliza una tincin de contraste con un colorante distinto a fin de poder distinguir los dos tipos de clulas en el microscopio.

*Tincin de cido-alcohol resistencia: Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de ZiehlNeelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de lo cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tincin de contraste.

-Tincin selectiva: Pueden utilizar uno o varios colorantes. Distintas estructuras de UNA MISMA clula reaccionan de forma distinta a los colorantes. Se usan para teir estructuras especficas cpsulas, flagelos, esporas, corpsculos metacromticos.

1.2.2

Microscopio de campo oscuro

El microscopio de campo oscuro es un microscopio ptico en el que el sistema de iluminacin incide solo lateralmente sobre la muestra. La nica luz que es capaz de alcanzar el objetivo es la dispersada por la muestra y, en consecuencia, los microrganismos se observan brillantes sobre fondo oscuro. La resolucin qque se logra con los microscopios de fondo oscuro es bastante alta y en ellos pueden observarse objetos difcilmente percibidos por microscopa de fondo claro o de contraste de fases. La microscopia de fonfo oscuro es tambin un excelente mtodo para observar la movilidad de los microrganismos, ya que esta tcnica permite observar los penachos de flagelos.

1.2.3

Microscopio de contraste de fases

Se basa en el hecho de que las clulas poseen un ndice de refraccin (que es un factor que retrasa la luz cuando incide en la muestra) distinto al del medio. La luz que atraviesa la clula esta, por tanto, en una fase distinta de la que atraviesa el medio. Este pequeo efecto se amplifica mediante un dispositivo especial situado en la lente del objetivo del microscopio de contraste de fases que se denomina el anillo de fases, dando lugar a la formacin de una imagen oscura sobre un fondo brillante.

1.2.4

Microscopio de Interferencia Diferencial

La microscopa de interferencia diferencial es un tipo de microscopia ptica que emplea una fuente de luz polarizada. La luz polarizada pasa a travs de un prisma que genera dos haces diferentes de luz, los cuales atraviesan la muestra y entran en la lente del objetivo. Aqui los dos rayos de luz se combinan y, debido a pequeas diferencias en el ndice de refraccin de las sustancias que a atravesado cada rayo, los dos rayos combinados no estn en la misma fase, lo que crea como resultado un efecto de interferencia. Este efecto intensifica diferencias muy sutiles de la estructura celular y, mediante este tipo de microscopia, adquieren una apariencia tridimensional objetos como el ncleo de las clulas eucarioticas, y las endosporas, vacuolas y grnulos de las clulas procariticas. Esta microscopia es particularmente til para la observacin de clulas no teidas por su capacidad para revelar estructuras celulares internas que no son fcilmente aparentes cuando se utiliza la microscopa de fondo claro.

1.2.5

Microscopia de fluorescencia

El microscopio de fluorescencia se utiliza para visualizar muestras capaces de emitir fluorescencia, es decir, capaces de emitir a una determinada longitud de onda cuando incide sobre ellas una longitud de onda menor. La fluorescencia puede deberse a que algunas clulas poseen sustancias fluorescentes naturales, como la clorofila u otros compuestos fluorescentes (autofluorescencia). Tambin pueden emplearse colorantes fluorescentes para identificar clulas en medios complejos como suelos, aguas, alimentos o muestras clnicas. Este tipo de microscopia se usa habitualmente en los diagnsticos clnicos, microbiolgicos as como en ecologa microbiana para enumerar bacterias en medios naturales o en suspensiones celulares.

Dentro de la microscopa de fluorescencia hay diversas modalidades: -Fluorescencia primaria (autofluorescencia): Propiedad intrnseca de algunas molculas cuando se iluminan con luz de baja longitud de onda. Pigmentos (Clorofilas / Carotenos / Xantofilas), Plantas, bacterias fotosintticas y algas. -Fluorescencia secundaria: *Fluorocromos: Un fluorocromo o fluorforo, es un componente de una molcula que hace que sta sea fluorescente. Es un grupo funcional de la molcula que absorber energa de una longitud de onda especfica y la volver a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda (es decir, con menor energa). La cantidad de energa emitida y su longitud de onda dependen tanto del propio fluorcromo como de su ambiente qumico. Como ejemplo de fluorocromos tenemos la diamino-2-fenilindol (DAPI) usada para los cidos nucleicos, la Auramina O, usada para los cidos nucleicos o los anticuerpos marcados (disciplina tambin denominada inmunofluorescencia). *Fusiones gnicas: La protena verde fluorescente (o GFP, por sus siglas en ingls, green fluorescent protein) es una protena producida por la medusa Aequorea victoria, que emite bioluminiscencia en la zona verde del espectro visible. El gen que codifica esta protena est aislado y se utiliza como marcador bioluminiscinte para poder realizar fusiones de genes y as poder observar mejor estructuras que sin la tcnica serian invisibles.

1.2.6

Microscopio confocal de barrido por laser

Un microscopio confocal de barrido por laser es un microscopio computerizado que acopla una fuente de luz laser a un microscopio ptico. Esta tcnica permite producir imgenes tridimensionales, de microrganismos y de otras muestras biolgicas. El rayo laser se enfoca de manera precisa de modo que slo se hace visible un plano particular de la muestra y la luz perdida en otros planos focales se elimina. Es un avance significativo en la microscopa pero es cara y de muy poca disponibilidad.

2. Microscopa ptica La microscopa electrnica utiliza electrones en lugar de fotones para producir imgenes de clulas o de estructuras celulares. Los microscopios electrnicos estn equipados con cmaras que permiten tomar fotoggrafias llamadas micrografas electrnicas y las lentes son electroimanes. Hay dos tipos. 2.1 Microcopio electrnico de transmisin El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrnico de transmisin debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar la imagen de un objeto hasta un milln de veces. 2.2 Microscopio electrnico de barrido En el microscopio electrnico de barrido (MEB) la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un can. Un detector mide la cantidad

de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolucin est entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imgenes de gran resolucin en materiales ptreos, metlicos y orgnicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie.

Tema III: Estructura y funcin de microrganismos celulares procariotas

3.1 Diferencias entre clulas procariotas y eucariotas

3.2 Morfologa y tamao de las clulas procariotas Dentro de los microorganismos tenemos muchos distintos y, entre ellos, las diferencias son importantes. El tamao de stos est relacionado con la forma. El hecho de tener formas muy distintas hace difcil comparar tamaos y, por esto, hablamos de volmenes.

El tamao de los procariotases muy variado, tenemos desde los proclorococus marinus y sus 0.4 m, hasta los paramecios y sus 100 m.

Los micoplasmas se consideraban las bacterias ms pequeas con un tamao de 0.3m. En los ltimos aos se demostr la existencia de bacterias que destacan por su pequeo o gran tamao. Se calculaba que para la existencia celular era necesario un tamao de 0.2m pero, en los ltimos aos en el fondo marino se han encontrado las Nanobacterias o Ultramicrobacterias, que tienen forma redondeada y su tamao puede ser de 0.005m a 0.2m. Algunas se han podido cultivar. En los ltimos aos se han descubierto tambin bacterias de gran tamao. En 1985 se descubri la Epulopiscium fishelsoni. Tiene un tamao de 50-80m de dimetro y de 0.5-0.10mm de largo. Inicialmente se crey que era un Protista pero en el 92-93 se confirm que era una bacteria.En 1999 en aguas de Namibia se descubri otra bacteria gigante: Thiomargarita nanibiensis que es tan grande que es visible a simple vista (0.75mm de dimetro). Esto pone de manifiesto que el tamao, por si slo, no vale para diferenciar procariotas de eucariotas. Tambin dentro de Eucariotas se ha encontrado una microalga de 1 a 2 m: Nannochlorum. El tamao tiene importancia porque determina algunas propiedades biolgicas, de su ecologa y su evolucin. El tamao de los microorganismos est muy relacionado con la relacin superficie- volumen. La cantidad de membrana disponible va a determinar las tasas de transporte. Cuanto ms pequeos, mayor superficie- volumen, mayor membrana y , mayor tasa de transporte, por lo tanto, mayor velocidad de crecimiento. Esto hace que en los hbitats naturales se multipliquen

rpidamente. Otra consecuencia que tiene esta relacin, es que a mayor velocidad de crecimiento, mayor velocidad de evolucin. No sabemos el lmite de tamao pero parece claro que tiene que haber un lmite, tanto superior como inferior. A mayor tamao, menor velocidad de transporte y por lo tanto ineficiencia.En las bacterias grandes se descubri que tenan su m.p plegada. Las clulas eucariotas son ms grandes, como norma general, pero tienen sistemas interiores de membrana que liberan a la m.p de toda una serie de funciones. En eucariotas slo se dedica al transporte, pero no en procariotas. El tamao tambin es importante para determinar la velocidad de sedimentacin. Los principales tipos de formas bacterianas son: cocos (clulas ms o menos esfricas);

bacilos (en forma de bastn, alargados),que a su vez pueden tener varios aspectos: cilndricos, fusiformes, en forma de maza, etc. espirilos: al igual que los bacilos, tienen un eje ms largo que otro, pero dicho eje no es recto, sino que sigue una forma de espiral, con una o ms de una vuelta de hlice. vibrios: proyectada su imagen sobre el plano tienen forma de coma, pero en el espacio suelen corresponder a una forma espiral con menos de una vuelta de hlice.

Otros tipos de formas: filamentos, ramificados o no anillos casi cerrados formas con prolongaciones (con prostecas)

Estos distintos tipos de morfologas celulares deben de haberse originado por mecanismos evolutivos, a saber, por seleccin y estabilizacin adaptativa frente a las distintas presiones ambientales presentes en diferentes nichos ecolgicos. Las bacterias normalmente se multiplican por fisin transversal binaria. En muchas especies, las clulas hijas resultantes de un evento de divisin por fisin tienden a dispersarse por separado al medio, debido a la actuacin de fuerzas fsicas (movimiento browniano, cizallamiento, corrientes de conveccin, etc). Esto hace que al observar al microscopio una poblacin de estas bacterias veamos mayoritariamente clulas aisladas. Pero en algunas especies las clulas hijas pueden permanecer unidas entre s (al menos durante un cierto tiempo tras la divisin de la que proceden) debido a que el tabique sea incompleto o a la existencia de capas mucosas que retienen juntos los productos de la divisin.

Si la tendencia a permanecer unidas es baja, tendremos agrupaciones de dos clulas, que dependiendo que sean de morfologa esfrica o alargada, se denominan como: diplococos diplobacilos

Si la tendencia a permanecer unidas es mayor (por ms tiempo), nos encontramos con varias posibilidades, dependiendo del nmero de planos de divisin y de la relacin entre ellos: Si los tabiques son paralelos entre s (o sea, existe un solo plano de divisin): estreptococos (cadenetas arrosariadas de cocos) y estreptobacilos (cadenetas de bacilos).

Si existe ms de un plano de divisin, en el caso de cocos podemos encontrar tres posibilidades: dos planos perpendiculares: ttradas (4 cls. en un plano) o mltiplos; tres planos ortogonales: sarcinas (paquetes cbicos); muchos planos de divisin: estafilococos (racimos irregulares).

En el caso de bacilos, se pueden dar variantes adicionales, debido a la posibilidad de que se produzcan movimientos postfisionales (en algunos casos con desgarro): bacilos en empalizada o en paquetes de cigarrillos (debido a giros de 180o) dos bacilos en ngulo (en forma de letra V o L) varios bacilos formando letras chinas.

3.3 La membrana plasmtica procariota Estructura que rodea a la clula. Imprescindible en todos los seres vivos. Separa el citoplasma interno del medio circundante. Entre las funciones de la membrana plasmtica procariota encontramos: 1. Separar a la clula del medio exterior: entorno con parmetros ptimos para reacciones metablicas 2. Actuar como barrera de permeabilidad selectiva: permite entrada de molculas particulares y evita el trfico de otras 3. Participar en procesos bioenergticos: aloja cadenas de transporte de electrones, ATP-asa 4. Participar en biosntesis de polmeros de las envueltas: enzimas implicadas y para transporte de precursores 5. Proporcionar anclaje al genforo y algunos plsmidos: segregacin correcta tras la replicacin 6. Detectar seales qumicas del entorno: molculas receptoras para respuesta a estmulos externos

La membrana citoplsmica procariota tiene la estructura de tipo bicapa proteo-lipdica que delimita al protoplasto. Su proporcin protenas/lpidos es superior a la de las membranas celulares eucariticas, llegando a alcanzar valores relativos de 4:1.

Consiste en una bicapa lipdica, con los grupos polares (hidrfilos) hacia afuera, y las cadenas hidrofbicas de cidos grasos (o, en el caso de Arqueobacterias, de alcoholes) hacia adentro, ajustndose al modelo de mosaico fluido de Singer y Nicholson. Inmersas en esta bicapa se encuentran las abundantes protenas, que pueden moverse lateralmente en el mosaico de molculas de lpidos, igualmente dotados de una rpida movilidad. Parece ser que no existe movilidad de lpidos entre las dos capas. La membrana citoplsmica es asimtrica (aunque no tanto como la membrana externa de Gram-negativas). Esto se traduce en el hecho de que muchos de los procesos que tienen lugar en la membrana sean vectoriales (tengan una direccin determinada). Las membranas procariticas, a diferencia de las de eucariotas, carecen de esteroles (con las salvedades de Cianobacterias, ciertas bacterias metilotrofas; adems, los micoplasmas presentan colesterol, pero lo secuestran de las clulas eucariticas a las que parasitan). Pero en cambio, en muchas bacterias existe una peculiar clase de compuestos policclicos, denominados hopanoides (triterpenoides pentacclicos) que parecen condicionar parte de la rigidez de las membranas citoplsmicas. Los hopanoides se sintetizan a partir del mismo tipo de precursores que los esteroles. (Por cierto, como dato curioso diremos que los sedimentos de combustibles fsiles como el petrleo presentan cantidades gigantescas de hopanoides, lo que confirma el papel que tuvieron las bacterias en su formacin). LPIDOS Abundan sobre todo los fosfolpidos derivados del cido fosfatdico: fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, cardiolipina (difosfatidilglicerol) En bacterias Gram-positivas, adems se encuentran glucolpidos y glucofosfolpidos.

La composicin y proporcin concretas de los distintos tipos de lpidos son variables entre distintas cepas bacterianas, y dentro de cada cepa, en funcin de las condiciones de cultivo (temperatura, pH, etc.). Los cidos grasos esterificados con el glicerol en los fosfolpidos son principalmente: 1) saturados, como p. ej.: a) b) c) 2) palmtico (16:0) mirstico (14:0) de cadena ramificada (muy frecuentes en muchas bacterias Gram-positivas)

monoinsaturados (sobre todo en Gram-negativas), como p. ej.: a) b) palmitoleico (cis-9, 16:1) cis-vaccnico (cis-11, 18:1)

A diferencia de eucariotas, no existen cidos grasos poliinsaturados, con la excepcin de las Cianobacterias. Este grupo de bacterias fotosintticas tiene, adems, la capacidad de modificar mediante desaturasas el grado de saturacin de sus cidos grasos, lo que representa un mecanismo adaptativo frente a cambios de temperatura. En Arqueas, en lugar de los habituales lpidos a base de steres de cidos grasos con glicerol, existen lpidos a base de teres de alcoholes de cadena larga con glicerol (p. ej., difitanilglicerol-diteres). Los alcoholes suelen ser derivados poliisoprenoides. Este tipo de membranas son ms rgidas que las de eubacterias. Incluso existen arqueas con membranas a partir de tetrafitanil-diglicerol-tetratereres, que consituyen bicapas monomoleculares. PROTENAS

Constituyen la mayor parte de la membrana procariotica (hasta el 80% en peso seco). Existe una gran variedad de tipos de protenas, pero la composicin y proporcin concreta vara segn las condiciones de cultivo.

Segn su localizacin en la membrana, y su grado de unin con la porcin lipdica, se distingue entre: protenas integrales de membrana (=endoprotenas): son protenas estrechamente unidas a la membrana, por lo general atravesadas en plena bicapa lipdica. Son difciles de extraer, tenindose que recurrir a detergentes y/o disolventes orgnicos para separarlas respecto de los lpidos. Las protenas integrales pueden desplazarse lateralmente en la bicapa lipdica, pero no son capaces de rotar, por lo que siempre presentan una determinada orientacin o polaridad. Algunas presentan hidratos de carbono que sobresalen hacia la superficie externa (glucoprotenas).

Protenas perifricas (= epiprotenas): unidas a la superficie de la membrana, de forma ms dbil, por lo que son ms fciles de extraer y purificar. Incluso algunas establecen contactos slo transitorios con la membrana.

3.4 Transporte a travs de la membrana Lo primero que tiene que hacer un microorganismo a la hora de su nutricin es captar los nutrientes que necesite desde el medio exterior. Debido a que la bicapapa lipdica acta como barrera que impide el paso de la mayor parte de las sustancias, esto significa que deben existir mecanismos especficos para lograr la entrada de los nutrientes. Vamos a diferenciar 2 grupos a la hora de hablar de los mecanismos de transporte: Los que requieren energa y los que no. 3.4.1 No requieren energa (difusin) Pasiva Este transporte consiste en la difusin pasiva de ciertas sustancias para las que la membrana es impermeable, debido a la diferencia de concentracin (DC) a ambos lados de dicha membrana (la sustancia tiene mayor concentracin fuera que dentro de la clula). Aparte de esta diferencia de concentracin, en la difusin pasiva influyen: la constante de permeabilidad (P), es decir, el grado de permeabilidad de la membrana a la sustancia en cuestin; el rea o superficie total (A) a travs de la que se produce el transporte.

Las membranas citoplsmicas son impermeables en s mismas a la mayor parte de las molculas. Slo se da en el caso de O2, CO2, NH3, agua y otras pequeas sustancias polares no ionizadas. La difusin pasiva se produce por el paso de estas sustancias a travs de poros inespecficos de la membrana citoplsmica. Facilitada Es un proceso que permite el paso de compuestos por difusin a travs de transportadores estereoespecficos y (al igual que en el caso anterior) sobre la base de un gradiente de concentracin (en la direccin termodinmicamente favorable).El transportador suele ser una protena integral de membrana (permeasa o facilitador), cuya conformacin determina un canal interior, y por el cual un determinado sustrato puede alcanzar el interior, sin gasto de energa.

3.4.2 Requiere energa Translocacin de grupo Es un sistema de transporte que acopla la entrada del sustrato con su modificacin qumica por unin covalente con un grupo qumico. Este sistema supone un ahorro de energa metablica: aunque en el transporte se gasta un enlace rico en energa, el sustrato queda modificado en su paso a travs de la membrana en la forma que la bacteria emplea como primer intermediario de su ruta metablica. Es decir, con un solo proceso se cumplen dos funciones distintas: transporte y preparacin qumica para la ruta, que de todas formas habra que realizar. No es de extraar que este tipo de transporte haya sido seleccionado frecuentemente en la evolucin bacteriana, y que hoy lo encontremos en muchos procariotas, especialmente en bacterias anaerobias o aerobias facultativas que recurren a fermentaciones (recordar que las fermentaciones tienen un rendimiento energtico menor que los procesos respiratorios; por lo tanto, es lgico que se seleccionen mecanismos ahorradores como el descrito). El caso mejor estudiado de esta clase de transporte lo constituye el llamado sistema de fosfotransferasa de azcares (segn las casi inevitables iniciales inglesas: PTS). En E. coli el sistema PTS permite el transporte de glucosa, manosa, fructosa y los polioles sorbitol y manitol.

Transporte activo Simple Como se recordar, el simporte se puede definir como el transporte simultneo de dos sustratos en la misma direccin, por un mismo transportador sencillo. En el caso del transporte activo ligado a simporte de protones, lo que ocurre es que uno de los sustratos (H+) ha creado previamente un gradiente de concentracin, cuya disipacin es aprovechada por el otro sustrato para entrar con l. Este otro sustrato puede ser:

una molcula de carga negativa: en este caso, su simporte ligado a protones tiende a disipar slo el gradiente de concentracin. Ejemplos: transporte de iones fosfato, de glutamato, etc. Una molcula neutra: en este caso, su simporte tiende a disipar no slo el gradiente de concentracin, sino tambin el gradiente elctrico. Ejemplo: en Escherichia coli, la lactosa usa una -galactsido-permeasa, que es una de las permeasas bacterianas ms intensamente estudiadas.Por otro lado, ciertas molculas catinicas (iones K+, lisina), son transportadas directamente a travs de permeasas, en ausencia de simporte de protones. Sistema ABC El tipo paradigmtico de este tipo de transporte se denomina de transportadores ABC o ATPasas de trfico, y se conocen muchos ejemplos en eubacterias y arqueas. Se trata de un sistema de varios componentes, en el que existen protenas periplsmicas que captan el sustrato con gran afinidad, y lo llevan hasta unas protenas de membrana, las cuales acoplan el paso de dicho sustrato hasta el citoplasma (sin alteralo qumicamente) con la hidrlisis de ATP. La denominacin de "transportadores ABC" se debe a que en todos ellos existe una o dos protenas perifricas de membrana citoplsmica que poseen un dominio (de unos 200 aminocidos) conservado evolutivamente, denominado "cassette de unin a ATP" (las iniciales de ATP-binding cassette generan la sigla "ABC"). Elementos de este tipo de sistema: Porinas u otras protenas de membrana externa para lograr la difusin del sustrato desde el medio hasta el espacio periplsmico. Protena(s) solubles de espacio periplsmico que se unen al sustrato con gran afinidad. Un heterodmero formado por dos protenas integrales de membrana (cada una de ellas posee 5 o 6 trechos en a-hlice que atraviesan la membrana citoplsmica), que son la permeasa propiamente dicha del sistema (el canal por donde pasa el sustrato). Dos protenas perifricas de membrana citoplsmica, adosadas al lado citoplsmico, que incluyen el mdulo conservado ABC que acopla la hidrlisis de ATP con el transporte unidireccional del sustrato a travs de la membrana.

Modelo del mecanismo de este sistema:

1. El sustrato exgeno normalmente entra al periplasma a travs de algn canal inespecfico o porina de membrana externa (por ejemplo, en enterobacterias se pueden usar las porinas generales conocidas como OmpF y OmpC).

2. La protena periplsmica especfica, antes de su unin al sustrato tiene una determinada configuracin (denominada abierta), con dos grandes lbulos globulares unidos formando un ngulo (la forma recuerda una almeja a medio abrir). Cuando el sustrato pasa al periplasma, la correspondiente protena de unin periplsmica se une a l con gran afinidad (0.1-1 mM), y al

unirse cambia de conformacin. En esta configuracin, llamada cerrada, el sustrato se encuentra enterrado entre los dos lbulos de la protena (almeja cerrada).

3. Mientras tanto, el dmero de protenas integrales de membrana (antes de la unin con la protena periplsmica) se encuentra en un estado energizado pero incapaz de transportar sustrato. En esta situacin, puede unirse (por la parte que da al periplasma) al complejo formado por la protena periplsmica (en configuracin cerrada) ligada al sustrato. Al hacer esto, el heterodmero de membrana cambia de conformacin, de modo que ahora muestra mayor afinidad hacia la protena periplsmica y se abre su canal para dejar entrar el sustrato.

4. Entonces, el complejo de membrana alcanza su estado de mnima energa, y con ello descarga el sustrato en el citoplasma y se logra la separacin de la protena periplsmica (que vuelve a su configuracin abierta).

5. Finalmente, la hidrlisis de ATP catalizada por las protenas perifricas ABC (adosadas a la membrana y asociadas a las protenas integrales) suministra la energa para que el heterodmero de membrana vuelva a su estado energizado inicial, preparado as para otro ciclo de transporte.

3.5 Pared celular procariota La pared celular es una estructura crtica para las clulas bacterianas de modo que la mayora no puede vivir sin ella. La alta concentracin interna de solutos en las clulas bacterianas en relacin con el medio externo desarrolla una considerable presin de turgencia (cercana a 2 atmsferas en Escherichia coli). La pared celular bacteriana facilita la resistencia de esta presin evitando una lisis osmtica y adems otorga la forma y la rigidez de la clula (si bien existen bacterias que pierden su pared celular y se vuelven amorfas). La pared celular no se visualiza fcilmente en el microscopio ptico, pero se observa con claridad en cortes finos en el MET. Las bacterias se dividen en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. La distincin inicial entre estos dos tipos se llev a cabo gracias a un tipo de tincin diferencial denominado tincin de Gram (con esta tincin, las Gram positivas aparecen en color prpura, mientras que las Gram negativas presentan color rojo), pero existen claras diferencias estructurales que sustentan esta clasificacin. Incluso el aspecto de las paredes celulares es muy distinto entre ambos tipos. La pared celular de las Gram negativas est compuesta por varias capas y es bastante compleja, mientras que la pared de las Gram positivas est formada fundamentalmente por un tipo de molcula y es mucho ms ancha. Ambos tipos de clulas tienen en comn la presencia de peptidoglicanos (murena) en su pared, compuesto solamente encontrado en Bacteria y que forma una capa rgida responsable de la resistencia de la pared celular. Nunca se ha encontrado en las paredes de las Archaea o en Eukarya. Estos peptidoglicanos estn formados por una porcin uniforme de glicano (formada por dos derivados de azcares (acetilglucosamina y acetilmurmico) adems de un pequeo grupo de aminocidos. Estos componentes se unen entre s para formar una estructura que se repite a lo largo de la pared y que se denomina tetrapptido del glicano. La estructura bsica del peptidoglicano est constituida por una fina lmina en la que las cadenas de azcares se conectan entre s por puentes, formados por aminocidos. Los enlaces entre los azcares si bien son muy fuertes, estas cadenas por s solas no son capaces de conferir rigidez en todas las direcciones. Slo cuando se entrecruzan a travs de puentes peptdicos se logra la rigidez caracterstica de la pared, la que es variable en las Bacteria y de mayor intensidad a medida que aumenta el nmero de puentes peptdicos entre las cadenas. De ah que pueda afirmarse que si bien puede variar la qumica exacta del peptidoglicano, todas las formas de esta molcula muestran la misma composicin estructural: la glucosamina y el cido murmico forman el esqueleto, y las molculas de cido murmico se entrecruzan con puentes aminoacdicos. Se conocen ms de 100 tipos de peptidoglicanos que varan fundamentalmente en los puentes intercatenarios (varan los aminocidos). Tanto en Gram negativas como en Gram positivas se cree que la forma de la bacteria viene determinada por la longitud de las cadenas de peptidoglicano y el nmero y tipo de puentes intercatenarios que se establecen.

3.5.1 Pared de Gram+ En las clulas Gram + la pared es ms gruesa y en su vista exterior tiene una apariencia lisa. El peptidoglicano representa hasta el 90% de la pared, aunque pequeas cantidades de cidos teicoicos (del griego techos=pared) suelen tambin formar parte de la misma. Los cidos teicoicos son polialcoholes unidos por steres de fosfato (polmeros que contienen glicerolfosfato o residuos de fosfato de ribitol). stos aportan carga negativa a la superficie celular lo que puede servir para el trasiego de iones a travs de la pared. Tambin algunos cidos teicoicos (que contienen glicerol) se unen a los lpidos de la membrana (cidos lipoteicoicos) Habitualmente el enlace de las cadenas se establece mediante varios aminocidos cuyo nmero y tipo dependen de los diferentes organismos. Si bien se cree que algunas Bacteria poseen una sola capa de peptidoglicano, muchas Bacteria, especialmente las Gram positivas, tienen varias capas de peptidoglicano (hasta 25 en algunos casos). Una gruesa capa de peptidoglicano constituye la mayora de las Gram+ (20-80 nm de espesor). Debido a ello estas clulas son muy sensibles a la accin de la lisozima y penicilina (antibitico utilizado para infecciones causadas por Gram + porque inhibe la sntesis de la pared) o sus derivados. 3.5.2 Pared de Gram Las clulas Gram tienen en su pared una capa adicional y con la cara externa convoluta (arrollada sobre s mismo). El peptidoglicano constituye slo alrededor del 10% de la pared, estando constituido el resto por una capa compleja. Los puentes intercadenas se establecen por lo general mediante enlaces peptdicos. 3.5.3 Pared celular en archaea La pared celular de las archaeas tiene estas caractersticas: No tienen peptidoglicano(algunas pseudopeptidoglicano NAT*N-acetiltalasominurnico*,con enlace beta(1->3) NAG-NAT. Paredes de polisacridos, protenas o glucoproteinas Capa paracristalinaa o capa S Sin pared (thermplasma) Carecen de enlace beta(1->4), resistencia a lisozimas Pptido sin D-aa ni (D-Ala)2 terminal Resistencia a -lactmicos

3.5.4 Microorganismos sin pared celular Los microorganismos sin pared celular son PLEOMRFICOS Planctomycetes (ej. Gemmata) Mollicutes (ej. Mycoplasma) Thermoplasma (Archaea)

Son resistentes a -lactmicos (penicilina) Y tienen esteroles en su membrana plasmtica, lo que confiere rigidez.

Tema IV: Estructura de microrganismos no celulares (virus) y partculas subvricas.

4.1 Virus, Son organismos vivos? Los virus son entidades biolgicas extremadamente simples, carentes de organizacin celular. Se comportan como parasitos intracelulares estrictos porque solo son capaces de reproducirse en el interior de las clulas de organismos susceptibles (hospedador). Se diferencian de los organismos celulares en, al menos, tres aspectos: 1. Organizacin simple y acelular (no membranas no orgnulos) 2. Ausencia de DNA y RNA a la vez en la misma particula. 3. Incapaz de reproducirse de manera autnoma Por tanto, si son inertes fuera de la celula hospedadora, podemos considerarlos organismos vivos? 4.2 Caracteristicas de los virus - No tienen estructura celular - Tienen un tamao muy pequeo: Oscila entre los 20 300 nm, aunque existen virus gigantes de hasta 800nm

- Tienen informacin gentica para sobrevivir

- Necesitan clulas para replicarse, hospedadores, estado intracelular - Son parsitos obligados. Producen enfermedades - Tienen una forma extracelular 4.3 Estructura A diferencia de los priones y viroides, los virus se componen de dos o tres partes: su material gentico, que porta la informacin hereditaria, que puede ser ADN o de ARN; una cubierta proteica que protege a estos genes llamada cpside y en algunos tambin se puede encontrar una bicapa lipdica que los rodea cuando se encuentran fuera de la clula denominada envoltura vrica. Los virus varan en su forma, desde simples helicoides o icosaedros hasta estructuras ms complejas.

4.3.1 cido nucleico El cido nucleico en los virus contiene la informacin especfica y el potencial para modificar operaciones en la clula infectada. Los cidos nucleicos son macromolculas constituidas por cadenas de nucletidos, los cuales a su vez estn constituidos por una base nitrogenada asociada a un azcar del grupo de las pentosas y a uno o ms grupos de fosfatos. Existen cuatro posibles tipos de cido nucleico viral:ADN de cadena sencilla, ADN de cadena doble, ARN de cadena sencilla y ARN de cadena doble. Virus que contienen cualquiera de estos tipos

de cido nucleico pueden ser encontrados tanto entre los fagos como entre los virus que infectan a plantas o animales. Si miramos a la estructura del cido nucleico, veremos que hay AN lineales(todos los virus RNA, y algunos de DNA) y AN circulares(algunos virus DNA) y que generalmente encontramos una molecula de AN, aunque algunos poseen varias. El cido nucleico suele tener entre 5000 y 250000 nucleotidos y el tamao promedio de cada gen es de 1000 nt10-250 genes. 4.3.2 La cpsida Una partcula vrica completa, conocida como virin, consiste en un cido nucleico rodeado por una capa de proteccin proteica llamada cpside. Las cpsides estn compuestas de subunidades proteicas idnticas llamadas capsmeros. Los virus tienen un envoltorio lipdico derivado de la membrana celular del husped. La cpside est formada por protenas codificadas por el genoma vrico, y su forma es la base de la distincin morfolgica. Las subunidades proteicas codificadas por los virus se autoensamblan para formar una cpside, generalmente necesitando la presencia del genoma viral. Sin embargo, los virus complejos codifican protenas que contribuyen a la construccin de su cpside. Las protenas asociadas con los cidos nucleicos son conocidas como nucleoprotenas, y la asociacin de protenas de la cpside vrica con cidos nucleicos vricos recibe el nombre de nucleocpside. En general, hay cuatro tipos principales de morfologa vrica: Helicoidales:

Polidrica:

Compleja:

4.3.3 La envoltura La envoltura vrica es una estructura que rodea a la cpsida viral tpica de los virus animales. Slo unos pocos vegetales y bacterifagos tienen envoltura. En los animales proviene en buena parte de la membrana plasmtica del hospedador (o de su membrana nuclear); pero esta membrana celular no es el nico componente de la envoltura; hacia el exterior aparecen glicoprotenas que estn codificadas en el genoma viral. Frecuentemente la glicoprotena se agrupa para formar pas o espinas que son importantsimos antgenos vricos. Tambin esta formada por una serie de protenas M o matriciales que tienen una funcin importante de refuerzo y estabilizacin. Los virus que no poseen envoltura se denominan virus desnudos. La envoltura es flexible, pleomrfica. Adems, la envoltura tiene una bicapa lipdica relativamente sensible a la desecacin, al calor y a los detergentes, con lo que es detectable simplemente con ter, que disuelve los lpidos, y el virus queda inactivado.La funcin principal de la envoltura es ayudar al virus a entrar en la clula husped 4.4 Clasificacin Vamos a diferenciar dos clasificaciones, segn el tipo de material gentico y segn el tipo de hospedador, y dentro de este ltimo otros dos, bacterifagos, y virus que infectan a eucariotas (animales, plantas, hongos).

4.5 Metodologa de estudio Vamos a diferenciar dos, la purificacin de virus, y la cuantificacin de estos. 4.5.1 Purificacin de virus Utiliza las propiedades de los viriones como: - Que son muy grandes en relacin con las protenas - Que suelen ser ms estables que los componentes celulares - Presencia de protenas en su superficie Tres mtodos: -Centrifugacin: dos tipos -Centrifugacin diferencial: se basa en la diferencia en la densidad de las molculas. Esta diferencia debe ser grande para que sea observada al centrifugar. Las partculas que posean densidades similares sedimentarn juntas. La centrifugacin se realiza a distintas velocidades y tiempo para que se separen poco a poco los grupos del mismo tamao.

-Centrifugacin en gradiente: Es un sistema que se suele realizar empleando la ultracentrfuga. Consiste en la separacin de las partculas en funcin de su densidad de flotacin. La muestra se dispone por encima o se mezcla con un gradiente de densidad ms pronunciado que el del caso anterior, y que contiene una concentracin muy elevada de sacarosa o de cloruro de cesio. Al centrifugar cada componente subcelular se desplazar hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posicinen la que su densidad sea igual a la de su entorno (situacin de flotabilidad neutra) y ya no se desplazar ms. Como consecuencia se producirn una serie de bandas

discretas, las ms prximas al fondo del tubo contendrn las partculas con mayor densidad de flotacin. Este mtodo tambin se conoce como equilibrio en gradiente de densidad. Esta tcnica se emplea para separar partculas similares en tamao pero distintas en densidad. - Precipitacin con sulfato amnico o polietilenglicol: *Aadir a [ ] justo por debajo de nivel de precipitacin ->Centrifugar *aadir a [ ] justo por encima de nivel de precipitacin -> Centrifugar

-Destruccin de constituyentes celulares:

4.5.2 Cuantificacin de virus Varias alternativas: Recuento al microscopio: Los virus pueden contarse al microscopio electrnico. Como no es posible determinar exactamente el volumen de la preparacin viral para ser observada al microscopio electrnico se usa como referencia una suspensin de partculas de ltex de concentracin conocida. Se procesa para su observacin al microscopio electrnico y se cuenta el nmero de partculas virales y el nmero de partculas de ltex. Como se conoce la concentracin de partculas de ltex, fcilmente puede calcularse el nmero de partculas virales totales.

Tcnicas inmunolgicas, hemaglutinacin viral: La hemoaglutinacin es un mtodo donde no se mide la capacidad infecciosa de las partculas virales. Es una tcnica indirecta para medir partculas virales, pues en realidad mediante esta tcnica se mide la cantidad de partculas hemoaglutinantes (protenas virales) independientemente si estas estn incluidas en la partcula viral o libres como antgeno. La hemoaglutinacin es uno de los mtodos indirectos ms comunes para cuantificar partculas virales y/o antgenos virales hemoaglutinantes en suspensin. En esta los eritrocitos se pueden sensibilizar con diversos antgenos y se pueden usar como un sistema indicador. As, si se descubren los anticuerpos, la reaccin se revelar como una hemoaglutinacin que se puede advertir a simple vista.

-Cuantificacin de placas: *Virus bacterianos

*Virus animales

Cuantificacin de lesiones

Virus, perjuicios, beneficios y aplicaciones

Tema V: Nutricin microbiana y asimilacin de macronutrientes

1. Nutrientes La gran meta que tiene un microorganismo es crecer y dividirse; para ello necesita duplicar el material que posee. Las clulas utilizan elementos qumicos que provienen del medio ambiente para transformarlos en los constituyentes caractersticos que componen dicha clula. Estos compuestos qumicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una clula transforma estos nutrientes en sus componentes celulares se denomina anabolismo o biosntesis. La biosntesis es un proceso que requiere energa. Esta energa se obtiene del medio ambiente. Las clulas pueden utilizar tres tipos distintos de fuentes de energa: luz, compuestos orgnicos o compuestos inorgnicos. Aunque algunos organismos obtienen su energa de la luz, la mayor parte lo hacen a travs de compuestos qumicos. Cuando estos compuestos qumicos se rompen originando compuestos ms simples se libera energa y a este proceso se le denomina catabolismo. El resultado colectivo de las reacciones anablicas y catablicas es el metabolismo. Los nutrientes que requiere una clula para su crecimiento se pueden clasificar en los siguientes grupos: 1.1 Macronutrientes: Carbono: Todos los organismos necesitan carbono en alguna de sus formas. El carbono forma el esqueleto de los tres ms importantes nutrientes (carbohidratos, lpidos y protenas) que se utilizan para la obtencin de energa as como material celular. Los microorganismos que utilizan compuestos orgnicos como fuente de carbono se llaman heterotrofos y aquellos que utilizan el CO2 como fuente de carbono se llaman autotrofos.

Hidrgeno y Oxgeno: El hidrgeno y oxgeno forman parte de muchos compuestos orgnicos. Se encuentran en el H2O, como componentes de nutrientes y en la atmsfera. Adems el O2 se utiliza en la respiracin aerbica como aceptor terminal de electrones.

Nitrgeno: Todos los organismos requieren nitrgeno. El nitrgeno es metabolizado y entra a formar parte de las protenas, cidos nucleicos y polmeros de la pared celular. Las fuentes de nitrgeno que pueden ser utilizadas por diferentes organismos incluyen el N2 atmosfrico en algunos procariotas, otros utilizan compuestos inorgnicos como nitratos, nitritos o sales de amonio, mientras que otros requieren compuestos nitrogenados orgnicos como son los aminocidos o pptidos. Fosforo: Fosfolpidos, Nucletidos, cidos nucleicos, Cofactores

Azufre: Aminocidos, Vitaminas (tiamina, biotina) 1.2 Micronutrientes: Mn: cofactor de ciertas enzimas Mo: molibdoflavoprotenas (asimilacin de nitrato).Cofactor del complejo nitrogenasa (fijacin N2) Co: constituyente de la vitamina B12 Cu: transportadores cadena respiratoria y fotosinttica Zn: estabilizacin complejos enzimticos (DNA y RNA Pol.) Ni: activador de hidrogenasas 1.3 Elementos secundarios K: activador enzimtico (sntesis de protenas) Na: procesos de transporte celular Ca: estabilizacin de la pared celular bacteriana. Termorresistencia de las endosporas Fe: cofactor del complejo nitrogenasa (fijacin N2). Transportadores (citocromos, protenas FeS) Mg: activador enzimtico (transferencia de grupos fosfato).Estabilizacin ribosomas, membranas, cidos nucleicos. Transportadores (clorofilas y bacterioclorofilas) Todas estas sustancias cumplen un importante papel en los denominados factores de crecimiento, que son los compuestos orgnicos que un determinado microrganismo es incapaz de sintetizar a partir de nutrientes simples, y necesita incorporarlos preformados del medio.

2. Categoras Nutricionales Podemos diferenciar 4 atendiendo a dos factores, la fuente de energa y la fuente de carbono.

2.1 Fotoauttrofos Los fotoauttrofos o fottrofos (del griego: photo = luz, auto = s mismo, troph = nutriente) son organismos (especialmente plantas) que efectan fotosntesis para obtener energa. Los organismos fotoauttrofos utilizan la energa de la luz solar para fijar el dixido de carbono (CO2); ste es combinado con agua (H2O) formando PGAL (fosfogliceraldehido). Esta molcula se usa para sintetizar diversas molculas orgnicas, empezando por la glucosa; usadas en los procesos celulares tales como biosntesis (procesos anablicos) y respiracin celular. 2.2 Quimiauttrofos Al igual que los fotoauttrofos (como algas y plantas) los quimioauttrofos utilizan el CO2 como fuente principal de carbono, pero a diferencia de ellos, no utilizan la luz como fuente de energa sino que la obtienen por oxidacin de compuestos inorgnicos reducidos, tales como NH3, NO2-, H2, formas reducidas del azufre (H2S, S , S2O3-) o Fe2+. Su carbono celular deriva del CO2 y es asimilado mediante las reacciones del ciclo de Calvin, de modo anlogo a las plantas. Como resultado de su capacidad distintiva de crecer en medios estrictamente minerales, en ausencia de luz, estos organismos son denominados con frecuencia quimiolittrofos (de lithos, roca). 2.3 Fotohetertrofos Se llama fotohetertrofo al organismo que tiene como fuente de energa la luz y, como fuente de carbono, la materia orgnica.Los organismos adscritos a esta categora utilizan el carbono orgnico como fuente de carbono. No utilizan el agua como donador de electrones en la fotosntesis y por lo tanto no producen O2. Por ltimo, son aerbicos

porque utilizan el oxgeno molecular como aceptor final de electrones en el proceso de respiracin. 2.4 Quimiohetertrofos Llamamos quimiohetertrofo a aquel individuo que tiene como fuente de energa las reacciones y, como fuente de C, la materia orgnica. Los quimioorganotrofos toman materia orgnica, parte la usan para sintetizar sus componentes y parte para obtener energa. Es un tipo de metabolismo muy frecuente: Todos los animales y hongos adems de muchos protistas, bacterias y arquas y las clulas no fotosintticas de las plantas 3. De donde proceden los nutrientes?

4. Asimilacin de nutrientes 4.1 Asimilacin del carbono inorgnico (CO2 ) por auttrofos -Ciclo de calvin: Se forma gliceraldehdo 3-P en tres vueltas del ciclo. Se necesitan 6 vueltas para formar una molcula de glucosa. Est ausente en arqueas, en algunas bacterias anaerobias estrictas y en algunas bacterias microaerfilas. La ribulosa bisfosfato carboxilasa (RubisCO) es una enzima clave en el proceso. Los

carboxisomas son corpsculos donde se acumula la enzima RubisCO. - Ciclo inverso del cido ctrico: El ciclo de Krebs invertido (tambin llamado ciclo del cido tricarbooxlico invertido o ciclo del cido ctrico invertido) es una ruta metablica utilizada por algunas bacterias para producir compuestos orgnicos a partir de dixido de carbono y agua. La reaccin es la opuesta al ciclo de Krebs: mientras que en el ciclo del cido ctrico biomolculas complejas (glcidos) se oxidan a CO2 y agua, el ciclo inverso toma CO2 y agua para sintetizar compuestos de carbono. Este proceso es utilizado por ciertas bacterias, en ocasiones utilizando hidrgeno, sulfuro, o tiosulfato como donantes de electrones. La reaccin es una opcin metablica posible en las condiciones prebiticas de la Tierra y, por tanto, tiene un gran inters en la investigacin del origen de la vida. Se ha observado que algunos de los pasos del ciclo pueden ser catalizados por minerales. Ejemplos de microrganismos que lo utilizan: fottrofos (Bacterias verdes del azufre: Chlorobium, Heliobacterias), quimiolittrofos (arqueas (Sulfolobus),bacterias (Aquifex)) El poder reductor es proporcionado por la ferredoxina reducida.

Ciclo del hidroxipropionato: mtodo muy exclusivo.Asimilacin del carbono inorgnico (CO2) por auttrofos. Se considera que puede ser un primer intento de autotrofa de los fottrofos anoxignicos.

4.2 Asimilacin del azufre El azufre se puede obtener de diversas fuentes: - S orgnico: parte de protenas, vitaminas - S inorgnico: sulfato y sulfuros Es necesario para la sntesis de aminocidos (cistena y metionina) y diversas coenzimas (coenzima A, biotina) A partir del sulfato (reduccin asimilatoria del sulfato): La reduccin asimilatoria del sulfato la realizan los microrganismos reduciendo el sulfato e incorporndolo como aminocidos tales como la cistena, cistina y metionina. La reduccin asimilatoria del sulfato viene a ser la respiracin anaerbica, donde el aceptor de electrones es el sulfato, proceso que lleva a cabo bacterias como Desulfovibrio desulfuricans, Clostridium spp. Y Desulfotomaculum nigrificans.

El sulfuro, producido por la reduccin de sulfato y por la descomposicin anaerbica de protenas, es toxico para la mayora de los organismos aerobicos incluyendo la vegetacin. Por eso se necesita asimilar el sulfuro e incorporarlo de otra manera que no sea toxica.

4.3 Asimilacin del nitrgeno El nitrgeno es un componente principal de protenas, cidos nucleicos, coenzimas y otros componentes celulares. Se puede obtener de distintas fuentes: -Compuestos orgnicos nitrogenados - Compuestos inorgnicos: amonio, nitrato (reduccin asimilatoria), nitrito (reduccin asimilatoria) - N atmosfrico ->fijacin de N2 atmosfrico 4.3.1 Asimilacin del nitrgeno inorgnico Amonio

Nitrato/Nitrito

4.3.2 Asimilacin del nitrgeno atmosfrico La atmsfera contiene enormes cantidades de nitrgeno no combinado (libre) en estado gaseoso: el nitrgeno molecular o dinitrgeno (N2), que procede de microorganismos desnitrificantes . Sin embargo, esta gran reserva slo puede servir de fuente de nitrgeno a ciertos procariotas, las llamadas bacterias fijadoras de nitrgeno o diazotrofos. - Bacterias y arqueas de vida libre: Azotobacter, Klebsiella, Clostridium, Metahanococcus - Bacterias simbiontes con plantas: Rhizobium, Frankia - Cianobacterias: Nostoc, Anabaena La fijacin del N2 es un proceso de reduccin que convierte el nitrgeno molecular en amoniaco, segn la siguiente reaccin: N2 + 8H+ + 8e + 18 ATP ---------> 2NH3 + H2 + 18 (ADP + Pi) La estabilidad del triple enlace es muy alta. Se requiere mucha energa para reducirlo. Se requieren 6 e- en pasos intermedios. Se necesitan otros 2 e- para formar H2 a partir de protones. El H2 participa en la reaccin. Los electrones para la reduccin llegan al complejo por medio de una ferredoxina o una flavodixina (FeS protenas no hmicas), que los transfiere al componente II, que queda reducido. El componente II reducido se une a dos molculas de ATP, y cambia su conformacin, lo que le permite unirse al componente I. Entonces se produce la transferencia de electrones desde el componente II al componente I, con hidrlisis de ATP, lo que a su vez provoca la separacin del componente II respecto del I. Una vez reducido el componente I (la molibdoferroprotena), ste transfiere los electrones (y los protones) al N2, hasta convertirlo en dos molculas de amoniaco. (El centro activo es FeMoCo). El amoniaco entra entonces en las rutas biosintticas para convertirlo en N orgnico, incorporable a las macromolculas. 4.4 Asimilacin del fsforo Es necesario para la sntesis de cidos nucleicos, protenas, fosfolpidos de membrana, ATP y coenzimas como NADP. En bacterias es parte del lipopolisacrido y cidos teicoicos

Fuente de fosfato: Fosfato inorgnico (Formacin de ATP: fotofosforilacin, fosforilacin oxidativa y fosforilacin a nivel de sustrato) , fosfato orgnico (forma disuelta o particulada), fosfatasas liberan fosfato inorgnico (por ejemplo a partir de nucletidos u organofosfatos) 4.5 Captacin del hierro

Tema VI: Cultivo de microorganismos

De manera general se denomina medio de cultivo a cualquier material que presente una adecuada combinacin de nutrientes para permitir el crecimiento o el incremento del nmero de clulas de una poblacin microbiana. En los Laboratorios de Microbiologa se utiliza una gran variedad de medios de cultivos para mantener las cepas, aislar o identificar microorganismos con varias finalidades: determinar la existencia de contaminacin de alimentos, medicamentos o cosmticos; diagnosticar alguna enfermedad, elaboracin de vacunas bacterianas, etc. Los medios de cultivo son una mezcla balanceada de nutrientes y estos nutrientes dependen de la especie a cultivar:

Podemos diferenciar diferentes medios de cultivo segn, su estado fsico, su composicin, y su finalidad. 1. Medios de cultivo segn estado fsico 1.1 Liquidos Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado nmero de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo. En el laboratorio encontraremos matraces y tubos, pero en la industria se utilizan fermentadores.

1.2 Solidos Se pueden preparar a partir de medios lquidos a los cuales se les aaden agentes solidificantes como agar, gelatina o slica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.

2. Medios de cultivo segn su composicin 2.1 Medios complejos Estn constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y usualmente se complementan con el aadido de minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que estn presentes. Ejemplos:

2.2 Medios definidos o sintticos Se preparan a partir de ingredientes qumicamente puros y por lo tanto se puede conocer exactamente su composicin cuali y cuantitativa. Por su costo slo se emplean en procedimientos especiales.Ejemplo:

3. Medios segn su funcin o aplicacin 3.1 Medios de mantenimiento Suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas. Ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen cidos, acidificndose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento. 3.2 Medios enriquecidos Se llama enriquecimiento a cualquier cultivo en medio lquido que resulte en un incremento en el nmero de tipo dado de microorganismo en relacin con el nmero de otros tipos de microorganismos que puedan estar en el inculo. Un medio de enriquecimiento puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del microorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de los otros tipos de microorganismos presentes. La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no est determinada nicamente por la composicin qumica del medio usado, sino que en un medio dado puede ser variada significativamente modificando otros factores tales como: temperatura, pH, fuerza inica, iluminacin, aireacin etc. Ejemplos:

3.3 Medios selectivos Son bsicamente iguales a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios slidos y estn diseados para el aislamiento de microorganismos especficos. Inhiben el crecimiento de algunos microrganismos y facilitan el de otros. Ejemplos:

3.4 Medios diferenciales No contienen sustancias inhibidoras, es decir, permiten el crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero si contienen indicadores de productos derivados de la actividad metablica de los microorganismos sobre algunos de los componentes del medio. Se utilizan para la identificacin de los microorganismos. Ejemplos:

Ejemplos de medios de cultivo selectivos y diferenciales

4. Obtencin de cultivos puros El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora delos casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano). Vamos a ver tres tcnicas diferentes para obtener cultivos puros. 4.1 Tcnica de siembra por estras Para obtener colonias aisladas por el mtodo de siembra en estra se toma una pequea muestra de una suspensin de una mezcla de microrganismos con el aro del filamento del asa de siembra. A continuacin se hacen estras en zig-zag sobre la superficie de una placa de agar de manera que durante

el frotado del asa con la superficie slida las clulas se irn desprendiendo progresivamente y el inculo se ir diluyendo con cada estra. Por tanto, a lo largo de las primeras estras tendr lugar un crecimiento confluente, mientras que a lo largo de las ltimas se desarrollarn colonias aisladas. 4.2 Tcnica de dilucin seriada Esta tcnica se realiza mediante diluciones en serie. Se basa en cuando la muestra esta muy diluida contendr solamente la bacteria que buscamos, o dependiendo de la dilucin realizada se aislara el microrganismo adecuado.

4.3 Micromanipulacin La manipulacin de especimenes microscpicos usando equipo con micro-tamao como agujas, inyectores, micro-electrodos, soportes, pinzas, etc., y mtodos sin contacto (como las pinzas pticas).

5. Cultivos de crecimiento Condiciones de incubacin que sean selectivas para los organismos deseados y contraselectivas para los organismos no deseados. Aumentar la cantidad hasta niveles detectables.

6. Obtencin y mantenimiento de cultivos puros -Corto plazo: Menos de 14 das. 4 C (Placa, Tubo de agar inclinado). - Medio plazo: Aos (Ultracongeladores: -70C, se utiliza glicerol o DMSO,Nitrgeno lquido: -140C) - Muy largo plazo: + de 30 aos (Liofilizacin. Se utilizan crioprotectores)

Tema VII: Cintica del crecimiento microbiano

Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del genoma no se acompaa de divisn celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: A escala individual: Implica un crecimiento en tamao y forma. A escala poblacional: Implica un incremento del N de clulas. Y podemos distinguir entre crecimiento equilibrado (Todos los constituyentes celulares son sintetizados a velocidades constantes) y crecimiento desequilibrado (No todos los constituyentes sintetizados de manera constante.

1. Cultivos discontinuos. Crecimiento Los cultivos discontinuos o batch son los ms habituales. En el inicio del cultivo, el medio estril se inocula con un volumen adecuado de microorganismos y se permite que se lleve a cabo la fermentacin en condiciones ptimas. A lo largo del proceso no se aade ningn nutriente, salvo el oxgeno. Llega un momento, por lo tanto, en que los nutrientes son limitantes para el crecimiento, por lo que se dan las fases tpicas de un cultivo bacteriano, que son: 1.1 Fase de latencia Los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial. Aqui se da el metabolismo primario, no hay incremento de masa, las clulas fisiolgicamente activas sintetizan nuevos componentes.

1.2 Fase logartmica o exponencial En ella la velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los nutrientes del medio. Posee estas caractersticas: -Mxima capacidad de crecimiento - Velocidad de crecimiento constante -Crecimiento equilibrado -Poblacin uniforme qmica y fisiolgicamente -Susceptibles a condiciones adversas.(p.e. radiaciones, penicilina) 1.3 Fase estacionaria En ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u otros parmetros de cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente (metabolismo secundario) al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial.Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes naturales. Posee estas caractersticas: -Cesa crecimiento -El n clulas viables permanece cte. -Clulas disminuyen de tamao -Clulas cambian composicin qumica -Ms resistentes a factores adversos -protenas de estrs nutricional (hambre) -protenas de unin al DNA (proteccin) - puentes cruzados del peptidoglicano - en ocasiones, de la virulencia

1.4 Muerte Se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del cultivo. Caracteristicas: -Disminucin del n de viables -Exponencial (pendiente menor fase log) -fase de declinacin logartmica -Pueden conservar integridad o lisarse 2. Cintica del crecimiento Las bacterias crecen siguiendo una progresin geomtrica en la que el nmero de individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de generacin (). De esta forma, podemos calcular el nmero de bacterias (N) al cabo de un nmero de generaciones (n) usando la ecuacin siguiente:

siendo N0 el nmero de clulas en el momento actual. El nmero de generaciones se puede calcular de la siguiente forma:

donde t es el tiempo transcurrido. Por consiguiente, combinando las ecuaciones 1 y 2:

Los tiempos de generacin de bacterias creciendo en ambientes favorables pueden ser muy cortos (valores de de 20 min). Esto lleva a que una nica clula (N0=1) creciendo con un = 20 min, llegue a poder producir 4.7 x 1021 clulas en 24 horas. Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar grficamente, por ello es mejor transformarlas en otras ms simples. Para transformar una ecuacin exponencial en una recta, tomamos logaritmos en los dos trminos y resulta:

Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el tiempo a razn de una constante igual a ln2/. Si el tiempo de generacin es muy grande, el crecimiento tendr poca pendiente (ser lento) y si es pequeo el crecimiento ser rpido. En un crecimiento equilibrado, todos los parmetros de crecimiento (nmero de clulas, biomasa de cultivo, acumulacin de metabolitos primarios, protenas, cidos nucleicos etc.) evolucionan en paralelo. Por tanto, en la ecuacin anterior N puede representar cualquiera de estos factores.

Otra forma de representar la cintica es considerando el incremento en el nmero de clulas (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuacin que describe la cintica es la siguiente:

esto es: el incremento del nmero de clulas (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al nmero de clulas presentes en el cultivo (N). A la constante de proporcionalidad () se le denomina tasa de crecimiento. Integrando la ecuacin anterior durante el tiempo de cultivo, se transforma en la siguiente funcin exponencial:

la transformacin de esta ecuacin en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente:

esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad . Comparando esta ecuacin (7) con la similar presentada ms arriba (4), podemos concluir que = ln2/ y, por consiguiente, que = ln2/. Es decir, que hay una correlacin inversa entre el valor de la tasa de crecimiento () y el tiempo de generacin (). Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de clulas, masa celular, etc. despus de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien, poder calcular la tasa de crecimiento a partir de medidas experimentales del incremento en el nmero de clulas, biomasa, etc.

3. Medicin del crecimiento 3.1 Medicin directa -Recuento de clulas totales: - Microscopio(cmara toma): consiste en la observacin al microscopio de volmenes muy pequeos de suspensiones de bacterias. Se usan unos portaobjetos especiales denominados cmaras Thoma. Para que la medida sea correcta es necesario que la densidad de clulas sea del orden de 10^5 por ml.

-Contador electrnico de recuento: Estos sistemas no nos indican si las partculas corresponden a clulas vivas o muertas; pero nos pueden dar una idea del tamao de las partculas.

-Determinacin de clulas viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo slido adecuado para estimar el nmero de viables contando el nmero de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de una clula aislada. Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadstico, es necesario contar ms de 300 UFC. En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja, stos se pueden recolectar por filtracin a travs de una membrana (de 0.2 m de tamao de poro) y posterior colocacin de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las colonias. Dos tipos: -Tcnica de dilucin seriada

-Tcnica de concentracin y plaqueo:

3.2 Medicin Indirecta -Turbidimetra: el sistema se basa en que las clulas en suspensin dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en suspensin y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parmetro de medida ms fcil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de clulas debe ser del orden de 10^5 por ml.

-Determinacin de peso hmedo o peso sco, centrifugacin o filtracin:

-Medida de actividades metablicas/enzimticas: a de las bacterias como que respiran producen una disminucin del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del consumo de oxgeno (utilizacin de colorantes sensibles a oxidacinreduccin tales como el azul de metileno).

4. Cultivo continuo o sistema abierto Un sistema abierto o cultivo continuo es aquel en el que entran nutrientes y salen los desechos. En un cultivo continuo se mantienen los microorganismos en crecimiento constante porque se aade de forma constante medio de cultivo fresco (que aporta nuevos nutrientes) y se elimina cultivo (medio usado con sus microorganismos correspondientes) a la misma velocidad con objeto de mantener el volumen total del cultivo constante. Los cultivos continuos son importantes para trabajar con microorganismos que estn creciendo constantemente de manera que sean capaces de producir constantemente productos de inters (biomasa, metabolitos secundarios, etc.). Este tipo de cultivo es tambin importante en los estudios de fisiologa y de ecologa microbiana. En la naturaleza un ejemplo de cultivo continuo lo constituye el rumen de ciertos animales y el conjunto de procesos microbianos intestinales de todos los animales. En un cultivo continuo se pretende mantener un ambiente constante durante todo el tiempo de cultivo. Esto es imposible en un cultivo estanco en el que los nutrientes se van consumiendo progresivamente y el medio se va cargando de productos de desecho. El tipo ms frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilucin (D) a la vez que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante).

5. Biofilms

5.1 Percepcin de Quorum La deteccin de qurum es un sistema de estmulo y la respuesta correlacionada con la densidad de poblacin. Muchas especies de bacterias utilizan la percepcin de qurum para coordinar la expresin de genes de acuerdo con la densidad de la poblacin local. til para asegurarse de que hay la suficiente cantidad de clulas de una especie determinada antes de iniciar una respuesta que requiera de una cierta densidad celular para surtir efecto. Cuando las clulas alcanzan una densidad determinada, la concentracin de autoinductor aumenta lo suficiente para unirse a una protena reguladora, y se activa la transcripcin de genes especficos de qurum.

Tema VIII: Influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento microbiano

Debido a su pequeo tamao y a su estilo de vida individual, las clulas procariticas sufren los cambios ambientales de un modo mucho ms directo e inmediato que las clulas de los organismos pluricelulares. A lo largo de miles de millones de aos, los procariotas han venido estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos mecanismos de adaptacin. Actualmente, las nicas formas de vida existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procariticas. Desafiando a nuestras ideas preconcebidas de lo que es la vida normal, encontramos extraordinarios seres vivos unicelulares viviendo cmodamente a pHs muy cidos o muy alcalinos, medrando en salmueras y salinas, o reproducindose a temperaturas de ms de 100C y a grandes presiones. Este tipo de microorganismos que habitan medios que los humanos consideramos como extremos reciben el calificativo de extremfilos. En este captulo veremos algunas de estas notables adaptaciones. Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en funcin de su fondo gentico, en relacin con los nutrientes, y en unas hipotticas condiciones ideales (ptimas). Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales, es decir, una serie de agentes fsicos y qumicos que 1) modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos; 2) condicionan la distribuicin de los microorganismos en sus ecosistemas y hbitats naturales; 3) permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijacin de parmetros para: a) b) c) d) encontrar condiciones ptimas para su cultivo potenciar sus actividades metabolicas explicar su distribucin en la naturaleza disear mtodos para su control, y si es necesario, su destruccin

No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. As, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para otra.

1. Requerimientos fsicos 1.1 Oxgeno Segn sus requerimientos de oxgeno los microorganismos pueden ser: - Aerobios estrictos: requieren oxgeno para crecer. Es decir, son completamente dependientes del oxigeno atmosfrico.(21%) Ej. Mycobacterium tuberculosis. - Anaerobios facultativos: pueden crecer en presencia o en ausencia de oxgeno. Es decir, no requieren oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor en su presencia. Ej. Levaduras, enterobacterias. - Anaerobios estrictos: crecen en ausencia de oxgeno. En presencia de oxgeno su crecimiento cesa, algunos mueren rpidamente. No lo pueden utilizar, no lo toleran. Ej. Especies del gnero Clostridium. - -- Anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de oxgeno, pero la presencia de oxgeno no perjudica su crecimiento. No lo pueden utilizar pero lo toleran. Ej.: Especies del gnero Lactobacillus. - Microaeroflicos: requieren pequeas concentraciones de oxgeno para crecer. Requieren niveles de oxigeno de entre 2% y 10%. No toleran los niveles de oxigeno atmosfrico. Ej.: Especies del gnero Spirillum.

En el curso de ciertas reacciones metablicas redox se forman compuestos altamente reactivos (radicales libres, formas superxido) que pueden daar las protenas, membranas y cidos nucleicos produciendo la muerte de las clulas.

Las clulas se defienden de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes: Superxido dismutasa (SOD) ,catalasa y peroxidasa. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia deoxgeno. La deteccin de estas enzimas tiene valor taxonmico.

1.1.1

Cultivo de aerobios

1.1.2

Cultivo de anaerobios

Las bacterias anaerbicas estrictas slo pueden crecer si se les excluye el oxgeno del medio, lo cual puede hacerse de varias maneras: a) Utilizando agentes reductores en el medio para disminuir el contenido de oxgeno. Ej. el tioglicolato de sodio; b) Por remocin mecnica de oxgeno y reemplazndolo por otro gas (nitrgeno); c) Mediante reaccin qumica, el oxgeno disponible se convierte en CO2, esto ocurre si se enciende una vela dentro de un recipiente cerrado o utilizando jarras Gaspak, en esta ltima la reaccin del bicarbonato de sodio y el borohidruro de sodio en presencia de agua, produce la liberacin de hidrgeno y CO2, ese hidrgeno liberado se combina con el oxgeno atmosfrico para formar agua en presencia de un catalizador de paladio. Cuando se utiliza la jarra Gaspak es usual colocar un indicador de anaerobiosis.

1.2 Temperatura Cada microorganismo tiene una temperatura ptima en la cual su crecimiento es ms rpido; una temperatura mnima por debajo de la cual no crece y una temperatura mxima por encima de la cual el crecimiento no es posible, estas tres temperaturas se denominan temperaturas cardinales y son caractersticas de cada microorganismo. El rango de temperaturas entre las que un microorganismo puede crecer es variable, hay microorganismos con un rango estrecho llamados ESTENOTERMALES y se encuentran en hbitat de temperatura relativamente constante. Los microorganismos de rangos ms amplios se encuentran en medios ambientales donde la temperatura vara considerablemente y stos son llamados EURITERMALES.

De acuerdo con el rango de temperatura a la que crecen, los microorganismos se dividen en: -Psicrfilos: Microorganismos capaces de crecer a bajas temperaturas. Existen varias definiciones de psicrfilos, en un inicio se defina como Psicrfilo a cualquier microorganismo que poda crecer a 0 C. Sin embargo, parecen haber dos grupos diferentes que pueden crecer a esa temperatura. El primer grupo est constituido por los psicrfilos estrictos o aquellos microorganismos que pueden crecer a 0 C pero cuya temperatura ptima es de 15 C. El otro grupo los constituyen aquellos microorganismos que pueden proliferar a 0 C pero que tienen temperaturas ptimas ms elevadas 20 - 35 C llamados psicrfilos facultativos o psicrotrofos. Ej. Pseudomonas. - Mesfilos: Microorganismos cuya temperatura ptima de crecimiento se encuentra dentro de un rango de 25 45 C. Dentro de este grupo se encuentran la mayora de los microorganismos contaminantes de los productos farmacuticos, alimentos y cosmticos y los microorganismos patgenos para el hombre. Ej. Neisseria gonorrhoeae.

- Termfilos: Microorganismos cuya temperaturas ptima es de 45 - 70 C, hay algunos con temperaturas ptimas an ms altas 80 - 110 C, a estos se les denomina hipertermfilos o termfilos extremos. Ej. Thermus aquaticus (temperatura ptima 72 C; crece entre 50 - 80 C).*Ejemplos y aplicaciones en diapositivas*

1.2 Disponibilidad de agua Se denomina actividad de agua a la relacin entre la presin de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presin de vapor de agua del agua pura (P0). El valor de la actividad de agua est relacionado con el de la humedad relativa (HR).

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metablicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las molculas de agua estn libremente disponibles para reacciones qumicas con el agua presente en una disolucin saturada de sal comn (NaCl) donde una parte importante de las molculas de agua participa en la solvatacin de los iones de la sal disuelta. En este ltimo caso, la actividad de agua es mucho menor que en el primero.

Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, disminuye su actividad de agua. Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua demasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detencin del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que ste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo ms o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prcticamente ilimitada. La gran mayora de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mnimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a ttulo orientativo, los siguientes: bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw >0.80. Como puede verse, los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (mucho ms secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razn se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias. En funcin de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que pueden crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halfilos y xerfilos segn toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente:

La reduccin de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentaria. La utilizacin de almbares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano. 1.2.1 Adaptacin a ambiente hipotnico

1.2.2

Adaptacin a ambiente hipertnico

Existen ciertos microorganismos que pueden crecer en medios con elevadas concentraciones de solutos y se conocen como osmotolerantes. Otros microorganismos necesitan para crecer elevadas concentraciones de solutos, a stos se les denomina osmoflicos. Hay otros microorganismos que se han llamado haloflicos o halfilos estrictos, estos requieren iones Na+ para crecer y lo hacen ptimamente en medios a los que se les ha aadido NaCl para obtener valores de aw menores de 0,80 y los halfilos facultativos que crecen a concentraciones de sales capaces de inhibir a la mayora de las bacterias.

1.3 pH Es un parmetro crtico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de microorganismo slo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rpidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas ya que, en muchos casos, la obtencin de energa metablica depende de la existencia de una diferencia en la concentracin de protones a ambos lados de la membrana citoplsmica. El pH interno en la mayora de los microorganismo est en el rango de 6.0 a 7.0. Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, tambin, distintos. Hay microorganismos acidfilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalfilos que toleran pH=10.0

1.4 Presin La mayor parte de los microrganismos de hbitats continentales no pueden crecer (e incluso mueren) cuando son sometidos a altas presiones (unos 600 Kg/cm2). Ello se debe a los siguientes efectos adversos: aumento de la viscosidad del citoplasma; disminucin de la capacidad de las enzimas de unirse a sus respectivos sustratos; interferencia en la divisin celular: las bacterias se alargan, se filamentan, pero sin produccin de tabique transversal (crecimiento sin divisin celular).

Sin embargo, existenmicroorganismos que toleran o requieren altas presiones (barotolerantes y barfilas, respectivamente): Bacterias barotolerantes: Crecen a la presin atmosfrica, pero aguantan hasta unas 500 atmsferas. Su hbitat son las aguas ocenicas, entre los 2000 y los 4000 metros de profundidad. Bacterias barfilas: Crecen ptimamente a ms de 400 atmsferas. Podemos distinguir entre barfilas moderadas (facultativas) y barfilas extremas (obligadas):

Las barfilas moderadas son aquellas bacterias que pueden crecer a presin atmosfrica, aunque su ptimo est a unas 400 atmsferas. Habitan profundidades entre los 5000 y 7000 metros. Las barfilas extremas presentan ptimos de crecimiento a muy altas presiones (por encima de 600-700 atmsferas), y son incapaces de crecer a presin atmosfrica. Se han llegado a aislar a ms de 10000 metros de profundidad. Debido a que a esas profundidades la temperatura del agua es de slo 2-3oC, suelen ser simultneamente crifilas. Este tipo de bacterias est empezando a ser investigado actualmente, y su manejo es engorroso, ya que hay que cultivarlas en cmaras especiales presurizadas que suministran las altas presiones que requieren.

1.5 Luz y radiacin

Tema IX: Control del crecimiento microbiano

Los materiales alimenticios cuya composicin es utilizada por el hombre con fines nutritivos, es tambin utilizado para los mismos fines por los microorganismos. La intervencin microbiana sobre los diversos alimentos trae como consecuencia modificaciones en la calidad, que se conoce como deterioro, ocasionando prdidas econmicas muy importantes. La supervivencia y el crecimiento microbiano puede potenciar la presencia de algunos microorganismos que afectan la inocuidad de los alimentos, trayendo consigo enfermedades de origen alimentario, como son las infecciones y las intoxicaciones de origen microbiano. Estas circunstancias han conducido a desarrollar una serie de tecnologas que buscan prevenirlos procesos de deterioro y la ocurrencia de las enfermedades microbianas transmitidas por losalimentos. La mayor parte de los procesos tecnolgicos utilizados en la industria alimentaria se basanen fundamentos fsicos, qumicos y biolgicos que permiten un control del crecimiento microbiano. Elconocimiento de los reservorios naturales, de su sistema ecolgico y de las tcnicas que permitan suidentificacin y cuantificacin son temas que complementan tales tecnologas y coadyuvan al mejorentendimiento de herramientas como la limpieza y desinfeccin en plantas industriales, la aplicacinde buenas prcticas de manipulacin de alimentos (BPM) y la implementacin del sistema HACCP.Las razones principales para controlar los microorganismos son: Prevenir la transmisin de la infeccin y la enfermedad Prevenir la contaminacin o la proliferacin de microorganismos perjudiciales. Prevenir el deterioro o destruccin de materiales por los microrganismos

Los microorganismos se eliminan, inhiben o matan por medio de: Agentes fsicos Procedimientos fsicos Agentes qumicos

1. Muerte de un microrganismo Desde el punto de vista microbiolgico, un microorganismo muere cuando pierde de forma irreversible la capacidad de dividirse. Como consecuencia de esta prdida, no se aumento en el nmero de microorganismos y, por tanto, no hay crecimiento. Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiolgico y continuar desarrollando una actividad metablica que se traduzca, por ejemplo, en liberacin de toxinas. Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicacin (crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones fsicas o qumicas del entorno. En estos casos, podramos considerar

como muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables. La muerte de un microrganismo como consecuencia del tratamiento con un agente antimicrobiano es una funcin exponencial negativa. La accin del agente microbiano supone la muerte de una fraccin constante de la poblacin superviviente en cada momento. La poblacin disminuye en una misma proporcin a intervalos constantes.

2. Conceptos 2.1 Esterilizacin Proveniente del latn sterilis incapaz de reproducirse. Proceso por el cual las clulas vivas, esporas viables, virus y viroides destruidos o eliminados de un objeto o hbitat. Destruccion de todas las formas de vida microbiana(clulas vegetativas, endosporas y entidades celulares infecciosas)->Agentes esterilizantes. 2.2 Desinfeccin/Antisepsia Destruccion o inhibicin de MO que pueden causar enfermedades (no de endosporas). El objetivo primario es destruir patgenos, pero se reduce sustancialmente la poblacin microbiana total. Agentes desinfectantes: Alta toxicidad, solamente utilizables sobre objetos inanimados. Agentes antispticos: Toxicidad lo bastante baja como para poder ser aplicados sobre la superficie de tejidos vivos. (piel, mucosas)

2.3 Saneamiento Reduccin de la poblacin microbiana hasta niveles que son considerados seguros segn las normas de salud publica.->Agentes higienizantes 2.4 Bacteriostatico, bactericida y bacterioltico - Bacteriostatico: Inhibe el crecimiento del microrganismo. El efecto desaparece cuando el agente se elimina. - Bactericida: Mata a las clulas, pero no produce rotura o lisis celular. - Bacterioltico: Induce la muerte mediante la lisis celular.

3. Metodos de control de microrganismos 3.1 Agentes fsicos antimicrobianos 3.1.1 Altas temperaturas

Al subir la temperatura por encima de la temperatura mxima de crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la prdida de viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y dividirse, aun cuando las transfiramos a un medio idneo. La muerte por calor es una funcin exponencial de primer orden: dN/dt = -KTN O sea, y como se puede constatar en el grfico adjunto, la accin del calor supone la muerte de una fraccin constante (KT) de la poblacin sobreviviente en cada momento. La cintica de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que la muerte se debe a la destruccin o inactivacin irreversible de una molcula o estructura esencial (como p. ej. el ADN cromosmico o por creacin de un dao irreparable en la membrana). Cmo podemos caracterizar o medir en la prctica la inactivacin por calor de una suspensin bacteriana? He aqu algunos parmetros utilizados: tiempo trmico mortal: es el tiempo mnimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensin a una determinada temperatura; tiempo de reduccin decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de la suspensin, a una determinada temperatura (tambin llamado valor D); punto trmico mortal: es la temperatura mnima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).

Estos tres parmetros se emplean frecuentemente en industrias alimentarias, como en las de fabricacin de conservas, centrales lecheras, etc. Antes de seguir adelante, es importante tener claro que, dependiendo de la temperatura y el tiempo a que sometamos un material a tratamiento trmico, lograremos inactivacin parcial de la poblacin microbiana (es decir, queda una fraccin de clulas viables) o bien esterilizacin (=inactivacin total). En general, entendemos por esterilizacin todo tratamiento de un material con un agente fsico (como el calor, que nos ocupa en este momento) o qumico (como veremos en el captulo 14) que acarrea la eliminacin de toda forma de vida en l. Una vez estril, el material sigue estril indefinidamente con tal de que est encerrado en un compartimento estanco, sellado y libre del contacto con microorganismos del ambiente exterior. Centrndonos de nuevo en el calor, la inactivacin parcial o la esterilizacin se pueden lograr por calor hmedo o por calor seco. La inactivacin (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalizacin de protenas y a la fusin de lpidos de membrana, debido a que se rompen muchos enlaces dbiles, sobre todo los puentes de hidrgeno entre grupos -C=O y H2-N-. Estos enlaces se rompen ms fcilmente por calor hmedo (en atmsfera saturada de vapor de agua), debido a que las molculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrgeno. CALOR HMEDO Por lo tanto, la inactivacin por calor hmedo requiere menores temperaturas que la que se realiza en ausencia de agua. Veamos algunos ejemplos de condiciones de inactivacin total por calor hmedo: Veamos los mtodos principales de lograr esterilizacin de materiales por calor hmedo: Autoclave (introducido por Chamberland en 1884): Es un aparato que permite calentar muestras por calor hmedo a temperaturas superiores a las de ebullicin del agua (sin que sta hierva), debido a que el tratamiento se efecta en un compartimento estanco saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosfrica. (El funcionamiento del autoclave ser oportunamente explicado en clases prcticas). Los parmetros de esterilizacin suelen ser: temperatura 121C y 10-15 min. Como se puede deducir, estos parmetros vienen fijados por la resistencia de las esporas de especies saprofitas (ver ltima lnea de la tabla anterior), que son las formas de vida que ms aguantan el calor sin perder viabilidad. (Hay que tener en cuenta que, en la prctica, a veces hay que emplear condiciones diferentes; por ejemplo: si queremos esterilizar grandes volmenes de lquido, habr que prolongar el tratamiento, 30 o 40 min, ya que el centro del recipiente donde va el lquido tarda ms en alcanzar la temperatura de esterilizacin. Los medios de cultivo que incluyen glucosa deben esterilizarse a 115oC, ya que a temperaturas superiores la glucosa "carameliza"; por lo tanto, en estas ocasiones, el tiempo tambin es mayor: 30 min). La accin rpida del calor hmedo depende en buena parte del alto valor de calor latente del agua (540 calg-1); ello hace que los objetos ms fros (como las muestras a esterilizar) se calienten rpidamente por condensacin de agua en su superficie.

Tindalizacin (nombre en honor de John Tyndall): Es un mtodo de esterilizacin fraccionada para materiales que se inactivan o estropean a ms de 100C. Consiste en someter el material a varios ciclos (normalmente 3 4) de dos fases sucesivas cada uno:

a) en la primera fase el material se calienta a una temperatura entre 50 y 100C, durante 1 2 horas;

b)

en la segunda fase el material se incuba en una estufa, a 30-37C durante 24 horas.

Durante las fases de tipo a) mueren todas las clulas vegetativas de la muestra, pero permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar. Durante las fases de tipo b) se produce la germinacin de las esporas activadas en la respectiva fase anterior. En la siguiente fase de tipo a) morirn las clulas vegetativas procedentes de la germinacin en la fase anterior; y as sucesivamente, hasta que al cabo de unos cuantos ciclos no queda ningun microrganismo en la muestra. Como se puede ver, este mtodo es bastante engorroso y consumidor de tiempo, por lo que en los ltimos aos ha sido reemplazado por otro mtodo de esterilizacin, aunque ya no dependiente del calor: se trata de la esterilizacin por filtracin. Consiste de hacer pasar una solucin a travs de una membrana o filtro de un tipo de material (normalmente nitrato de celulosa) que presenta poros de un tamao inferior al de cualquier clula bacteriana (dimetro de poro =0,22 mm). Aplicaciones principales del calor hmedo:

1. En la prctica cotidiana del laboratorio de microbiologa, en la esterilizacin de medios de cultivo y soluciones.

2.

En la esterilizacin de material quirrgico.

3. En la esterilizacin o inactivacin parcial, en las industrias alimentarias (conservas, leche y derivados).

En la industria lctea se emplean como mtodos de esterilizacin la llamada uperizacin. La uperizacin o tratamiento UHT consiste en un tratamiento de calor hmedo donde se emplean temperaturas muy altas durante unos pocos segundos (p. ej.: 135-150C durante 1-2 seg).

Pero no siempre es imprescindible esterilizar la leche, sino que puede bastar eliminar los posibles microorganismos patgenos que pueden contaminarla, y que son ms sensibles al calor que los saprfitos inofensivos. Con esta inactivacin parcial de la poblacin microbiana de la leche logramos que sta se conserve durante unos das, sin alterar apenas sus cualidades organolpticas y nutricionales. He aqu los procedimientos ms habituales para conseguir esto:

i. La pasteurizacin (en honor a Pasteur, que la introdujo en los aos 1860) consiste en tratar la leche a 63oC durante 30 min, tras los cuales se enfra y envasa rpidamente.

ii. La pasteurizacin instantnea (tambin conocida por sus siglas en ingls HTST, de high temperature-short time) se logra calentando a 72C durante slo 15 segundos, tras de lo cual la muestra se enfra rpidamente. Esta tcnica es la ms usada actualmente, ya que: mata ms rpidamente; mata mejor organismos ms resistentes; altera menos el sabor; acta en flujos continuos (y permite procesar grandes volmenes de leche).

Tras la pasteurizacin, el nmero de bacterias viables desciende un 97-99%. Los potenciales patgenos que pueda llevar la leche (Brucella, Salmonella, bacilo tuberculoso, Streptococcus, etc) son eliminados fcilmente. La pasteurizacin tambin se emplea para la preparacin de vacunas a base de microorganismos inactivados por el calor. CALOR SECO Como ya dijimos, la esterilizacin por calor seco necesita recurrir a mayores temperaturas que la efectuada por el calor hmedo, ya que al no existir agua, la rotura de puentes de hidrgeno y la desnaturalizacin de protenas, as como la fusin de membranas, se efectan a mayores energas. Otros efectos del calor seco son los daos por oxidacin y el provocar un aumento de la concentracin de electrolitos. Aplicaciones del calor seco:

1. El llamado horno de Pasteur, mediante calentamiento a 160-170C durante 2-3 horas permite esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al calor: material de vidrio y metlico, aceites y jaleas, etc.

2. Flameado a la llama (hasta el rojo) de asas metlicas de siembra, con las que se inoculan las bacterias.

3.

Incineracin de materiales de desecho

3.1.2

Filtracin

Consiste en pasar la muestra (liquido/gas) a travs de un material similar a una criba con poros lo suficientemente pequeos como para retener los MO. Se trata de una separacin fsica de los microrganismo. Hay que tener en cuenta que mediante esta tcnica no se destruyen los MO contaminantes. Los filtros habitualmente utilizados NO eliminan los virus (el material no queda esteril). Se usa para reducir/eliminar la poblacin microbiana en materiales sensibles al calor. Hay dos tipos de filtros: De profundidad y de membrana. Filtracion de profundida: se utilizan materiales fibrosos o granulados que forman una capa gruesa con canales de dimetro muy pequeo. La solucin es aspirada al vaco y los microorganismos quedan retenidos o son adsorbidos por el material. Se utilizan diatomeas, porcelana no vidriada, asbestos. Filtracin de membrana: Son circulares con un grosor de 0.1 mm y con poros muy pequeos, de unos 2 m por lo que los microorganismos no pueden atravesarlo. Se fabrican de acetato de celulosa, policarbonato, fluoruro de polivinilo u otros materiales sintticos.

3.1.3

Radiacin

No ionizantes: Es letal para todas las clases de microorganismos por su longitud de onda corta y su alta energa. Es letal a 260 nm ya que es la longitud de onda que es ms efectivamente absorbida por el ADN. El mecanismo primario del dao al ADN es la formacin de dmeros de timina lo que inhibe su funcin y replicacin. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies.

Ionizante: Niveles bajos pueden producir mutaciones e indirectamente resultar en la muerte, niveles altos son letales. Especficamente causan una serie de cambios en las clulas: ruptura de puentes de hidrgeno, oxidacin de dobles enlaces, destruccin de anillos, polimerizacin de algunas molculas, generacin de radicales libres. La mayor causa de muerte es la destruccin del ADN. Es excelente esterilizante y con penetracin profunda en distintos materiales, por lo que se utilizan para esterilizar materiales termolbiles (termosensibles) como jeringas desechables, sondas, etc. No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas porque producen alteraciones de los componentes.

3.1.4

Altas presiones

3.1.5

Otros mtodos

Por bajas temperaturas

- Refrigeracin - reduce el crecimiento de los microrganismos. Mtodo de conservacin tiempos cortos - Congelacin - ausencia de agua libre. Mtodo de conservacin tiempos largos (alimentos) La congelacin se usa para mantenimiento de cultivos: *a -70 C con soluciones de glicerol (bacterias y hongos)*a -196 C con nitrgeno lquido (clulas animales) - Desecacin: condiciones deshidratacin, parada de crecimiento. Se usa para: conservacin alimentos: Frutas, carnes; Conservacin microrganismos; Liofilizacin: microrganismos inalterados durante aos - Presin smotica: Soluciones hipertnicas (baja aw): clulas pierden agua y paran el crecimiento. Conservacin de alimentos:*Salado: Carnes, pescado;*Azcar: frutas en almbar, miel;Hongos y levaduras pueden llegar a crecer (osmfilos).

Tema X: Quimioterapia antimicrobiana

Todos los das usamos agentes qumicos para controlar el crecimiento microbiano: detergentes y jabones para el cuerpo y la ropa, cloracin de las aguas potables, antispticos para la piel y el tratamiento de heridas, desinfectantes para tratar superficies en la industria y en los laboratorios, quimioterpicos y antibiticos para tratar enfermedades bacterianas, etc. 1. Control de poblaciones por medios qumicos 1.1 Desinfectantes/antispticos Hay ciertos factores que afectan a la eficacia de estos productos: Concentracin del agente y tiempo de actuacin

pH: El pH afecta tanto a la carga superficial neta de la bacteria como al grado de ionizacin del agente. En general, las formas ionizadas de los agentes disociables pasan mejor a travs de las membranas biolgicas, y por lo tanto son ms efectivos. * Los agentes aninicos suelen ser ms efectivos a pH cidos. * Los agentes catinicos muestran ms eficacia a pH alcalinos.

- Temperatura. Normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la potencia de los desinfectantes. Para muchos agentes la subida de 10 grados supone duplicar la tasa de muerte.

Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a la poblacin microbiana segn la especie empleada: p. ej., el bacilo tuberculoso resiste los hipocloritos mejor que otras bacterias; segn la fase de cultivo; dependiendo de la presencia de cpsulas o de esporas (suelen conferir ms resistencia); dependiendo del nmero de microorganismos iniciales. Presencia de materiales extraos: La existencia de materia orgnica en el material a tratar (p. ej., sangre, suero, pus) afecta negativamente a la potencia de los desinfectantes de tipo oxidante (como los hipocloritos) y de tipo desnaturalizante de protenas, hasta el punto que pueden llegar a hacerlos inactivos en cuanto a su poder desinfectante o esterilizante. Por lo tanto, para el empleo eficaz de muchos desinfectantes hay que contar con este factor, determinando previamente el gasto de materia orgnica inerte, o calculando la potencia neta del desinfectante en presencia de la materia orgnica.

1.1.1

Fenoles y derivados

1.1.2

Alcoholes

1.1.3

Agentes tensioactivos

1.1.4 Yodo

Halogenos

Cloro

1.1.5

Metales pesados: Hg, Ag, Cu, Zn

1.1.5

Agentes oxidantes: Peroxigenos

1.1.6

Aldehidos

1.1.7

Gases esterilizantes

1.1.8

Conservantes qumicos de alimentos

1.2 ndice fenol El Coeficiente fenlico, es un valor experimental que se realiza a las sustancias que tienen propiedades biocida, tomando como referencia la capacidad biocida del fenol. El mtodo estandarizado para obtener el valor del coeficiente fenlico, es una modificacin de la tcnica de dilucin en tubo, en la cual se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del desinfectante. A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan diferentes diluciones de fenol. Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas del microorganismo utilizado como prueba (cepas especficas de Salmonella typhi o Staphylococcus aureus). A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una cantidad alcuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de cultivo estril.

Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento del microorganismo (aparicin de turbidez). La mayor dilucin del desinfectante que mate a los microorganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se divide por la dilucin mayor de fenol que d los mismos resultados.

El nmero obtenido es el coeficiente fenlico de ese desinfectante.

1.2 Quimioterpicos Los quimioterpicos son sustancias con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiosttica) con toxicidad suficientemente baja como para poder ser administrados a un organismo por la va adecuada, hasta alcanzar y mantener concentraciones eficaces en los tejidos. Los quimioterpicos deben tener una toxicidad selectiva, es decir, el agente quimico debe destruir al patgeno causando el menor dao posible al hospedador. Para ello es importante conocer ciertos conceptos: Dosis teraputica: Nivel de frmaco necesario para el tratamiento clnico de una infeccin en particular. Dosis txica: Nivel de frmaco en el que el agente se vuelve demasiado txico para el hospedador. Indice teraputico: Viene dado por la divisin de la dosis toxica/dosis teraputica. Cuanto mayor sea este ndice, mejor ser el agente quimioterapico.

1.2.1 Antibiticos Los antibiticos son sustancias normalmente de bajo peso molecular producidas por seres vivos (antibiticos naturales) o modificadas artificialmente a partir de ellas (antibiticos semisintticos), que a pequeas concentraciones tienen efectos antimicrobianos (microbicidas o microbiostticos), tras ser administrados por va adecuada a un organismo receptor. La mayor parte de los antibiticos proceden del metabolismo secundario de microorganismos procariotas (actinomicetos, Bacillus, etc.) o eucariotas (hongos de los gneros Penicillium, Cephalosporium, etc.).

Los antibiticos ms abundantes, y los mejor estudiados, son los que interfieren con enzimas de la biosntesis del peptidoglucano de las eubacterias, y los que interfieren con la funcin del ribosoma eubacteriano (obviamente, esto cumple el requerimiento de balas mgicas). El espectro de accin de un antibitico condiciona su uso teraputico, y puede ser de dos tipos: Espectro reducido: Tiene menos riesgo de efectos secundarios (microrganismos determinados recalcitrantes) Amplio espectro: Son los de uso generalizado. (No es necesario conocer el agente etiolgico)

Para determinar la eficacia de un antibitico existen dos conceptos importantes: Concentracin minima inhibitoria: Cantidad minima que inhibe el crecimiento. Concentracin minima letal: Cantidad minima que mata al organismo

Para estudiarlos es ms til agrupar a los antibiticos no por clases segn su naturaleza qumica, sino en funcin de las dianas sobre las que actan y con las que interfieren: antibiticos que interfieren con la biosntesis de la pared celular antibiticos que actan sobre la membrana celular antibiticos que inhiben la sntesis de protenas antibiticos que actan sobre la sntesis de cidos nucleicos.

Los antibiticos ms abundantes, y los mejor estudiados, son los que interfieren con enzimas de la biosntesis del peptidoglucano de las eubacterias, y los que interfieren con la funcin del ribosoma eubacteriano (obviamente, esto cumple el requerimiento de balas mgicas). A continuacin estudiaremos algunos grupos importantes de antibiticos, dando importancia a sus mecanismos de accin.

Frmacos que actan sobre la pared celular

1.2.1.1 Penicilinas Como ya sabemos, las penicilinas fueron los primeros antibiticos naturales en descubrirse, pero en general, todos los -lactmicos tienen el mismo mecanismo de accin. Actualmente las penicilinas suponen un 17% del mercado total de antibiticos. Su principal mecanismo de accin es la inhibicin de la transpeptidacin (lisis por las autolisinas, las clulas tienen que estar creciendo). La penicilina natural, purificada por primera vez en los aos 40, es la penicilina-G (o benzilpenicilina), en la que el radical acilo es el grupo bencilo (=fenilactico). Esta penicilina presenta una serie de limitaciones e inconvenientes: tiene un espectro estrecho: acta frente a estreptococos y otros cocos Gram-positivos, pero no frente a la mayora de bacterias Gram-negativas, porque estas ltimas son impermebles debido a su membrana externa. Es sensible a cidos, por lo que no puede ser administrada va oral (se inactiva a su paso por el estmago). Es susceptible a enzimas inactivadoras (penicilinasas) producidas por muchas bacterias.

Para solventar estos problemas se fueron creando variantes de esta penicilina que mejoraban algunas de sus cualidades. La mayor parte de estas variantes son penicilinas semisintticas, que se obtienen de la natural introduciendo artificialmente nuevos grupos radicales (-R) con carboxilo en el cido 6-aminopenicilnico.

Accin sobre la membrana plasmtica

Accin sobre sntesis de acidos nucleicos

Accin sobre sntesis de protenas: Elongacin

1.2.2 Agentes sintticos

*Resistencia adquirida por antibitico en diapositivas*