Conservacin de microorganismos

2011

Prof. Ms. Ana Mara Gonzlez

Objetivos

Comprender la importancia de la
conservacin de los microorganismos.

Conocer los fundamentos, ventajas y

desventajas de los principales mtodos de conservacin a fin de seleccionar los ms adecuados para cada caso en particular.

Conocer la finalidad de las colecciones de

cultivos y la utilidad de los cultivos de referencia.

Importancia de los microorganismos para la comunidad

Elaboracin de alimentos Obtencin de medicamentos Fabricacin de solventes y reactivos Aplicacin como biocontroladores
INDUSTRIA DOCENCIA - INVESTIGACIN Necesidad de mantener los microorganismos de manera que sus caractersticas o propiedades permanezcan estables.

Conservacin de cepas microbianas

OBJETIVOS Garantizar la: - Pureza - Viabilidad (70-80% de las clulas) - Estabilidad gentica de los microorganismos

Las clulas pueden sufrir daos durante la conservacin y la reactivacin. Dao letal Dao subletal o injurias Mutaciones CONSERVACIN REACTIVACIN

Condiciones de cultivo para la conservacin

Condiciones ptimas de crecimiento: medio de cultivo, humedad, temperatura, aireacin, iluminacin, tiempo de incubacin.

Cultivos en fase exponencial tarda

Incubacin Bacterias Levaduras Hongos filamentosos 24 horas 3 5 das 5 7 das

Mtodos de conservacin
Transferencias Peridicas Supresin de la Evaporacin Reduccin del Metabolismo Secado Congelacin

Mtodos de conservacin

Alternativos De eleccin Restringidos

A E R

MTODOS ALTERNATIVOS
SE UTILIZAN cuando no se permite el empleo de mtodos de eleccin se carece de equipos necesarios la cepa microbiana no resiste tratamientos de conservacin por mtodos de eleccin se necesita tener acceso a ella constantemente

TENER EN CUENTA: medio de cultivo, temperatura, tiempo y duracin de incubacin. Tcnicas aspticas.

Tranferencia peridica
Repiques peridicos

Los mo. consumen los nutrientes y excretan productos de desecho, el medio se vuelve hostil y es necesario la transferencia a medio nuevo.

Ventajas: Disponer de clulas activas en cualquier momento. Desventajas: - Peor mtodo para mantener la estabilidad gentica. - Fcil contaminacin de los cultivos.

TCNICAS DE MEJORAMIENTO PARA ESTE MTODO

Retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras

Disminuir la cantidad de inculo Rebajar la proporcin de algunos nutrientes del medio Inocular los mo aerobios facultativos por puncin Almacenar los cultivos a 4C 8C.

Supresin de la evaporacin

EVITAR LA DESECACIN Y LA CONCENTRACIN DE LOS NUTRIENTES Colocar sobre el cultivo, despus de su desarrollo en medio slido, una capa de aceite mineral o vaselina estril Cerrar los tubos con papel de aluminio, celofn, parafina, nylon

til para la mayora de los mo (5-12 meses) Recomendado para hongos filamentosos de los gneros Aspergillus, Fusarium, Rhizopus Geotrichum y Penicillium Almacenar preferentemente a 4-8C.

Reduccin del metabolismo

SUSPENSIN DE TROCITO DE AGAR EN AGUA ESTRIL A 4C

Trocitos de agar con el crecimiento ptimo del mo Agua estril Frascos tapa a rosca Se conservan a 4C VENTAJAS Econmico Simple Alto porcentaje de viabilidad (2-5 aos) Recomendado para hongos filamentos y Pseudomonas spp.

A
Conservacin en Agar Cepa
Colocar en un eppendorf o frasco pequeo aproximadamente 800ul de medio de cultivo (tripticasa soya) agarizado (0,3 0,5%) Se siembra el inculo por puncin Incubar en condiciones y tiempo ptimos Guardar a 4C.

Recomendado para bacterias

Secado
paralizacin de crecimiento por eliminacin del agua disponible

Slica gel Tierra/arena

R E

Sordelli Sordelli modificado

Liofilizacin

Silicagel
SE AADEN LAS CLULAS A SUSTRATOS QUE LAS PROTEGERN AL DESECAR PROCESO DE SECADO

Silicagel anhidra estril (calor seco150C 24 h) Repique en caldo (2ml) de una estra con crecimiento ptimo. Se incuba a 30C durante 48hs. La suspensin del m.o. se agrega en una mezcla de leche descremada (10%) y tampn fosfato (pH:7) estril y enfriada (4C) En bao de agua a 4C: Distribucin de la suspensin celular sobre la silicagel. Agitacin. Almacenamiento a 4C.

til para mo esporulados. Recomendado para Bacillus spp. Supervivencia: 3 meses a 2 aos.

Tierra

- Mezcla (tierra rica en humus + arena (10%) + CO3Ca (1%) ) estril. Autoclave 2 atm 1 hora. Incubacin 24 hs. 37C (3 veces). - Suspensin de esporos sobre la tierra. - Tubo estirado a la llama. - Vaco: Tubo insertado en un peine de vaco y conectado a la bomba de vaco. - Tubo cerrado a la llama en forma de ampolla.

til para conservar hongos y bacterias esporuladas. Fusarium ms de 10 aos

Sordelli

Las clulas se disponen con ansa aguja

sobre la pared de un tubo pequeo estril. El tubo pequeo tapado se coloca en el interior de un tubo de ensayo con silicagel o Cl2Ca (indicador de humedad). Tubo de ensayo estirado a la llama. Vaco hasta contenido seco. Tubo cerrado a la llama en forma de ampolla. Almacenamiento a temperatura ambiente. Recomendado para levaduras (por varios aos).

Sordelli modificado

Microorganismo suspendido en una gota de coloide protector (suero vacuno, albmina o leche descremada) estril. Luego se procede como en el mtodo de Sordelli. Permite la conservacin de hongos filamentosos (ms de 10 aos) y bacterias.

MTODOS DE ELECCIN
GARANTIZAN AL MXIMO LA ESTABILIDAD GNETICA

Utilizacin de equipamientos sofisticados

Congelacin
al eliminar el agua disponible no hay crecimiento

Congelar las clulas suspendidas en un crioprotector y guardar a temperaturas inferiores a 0C (menor T mayor supervivencia). Ventajas: es el mejor mtodo de conservacin Desventajas: - requiere aparatos especiales - existe el peligro de que algn fallo del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento - Dificultoso para el realizar el envo de las cepas

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VIABILIDAD Y ESTABILIDAD DE LAS CLULAS CONSERVADAS POR CONGELACIN La formacin de cristales al congelar puede romper las clulas Al eliminar el agua, para convertirse en hielo, existe una concentracin de sales que puede ser perjudicial (mayor taza de destruccin celular)

Edad de las clulas: inicio de la fase estacionaria o estado esporulado Velocidad en la congelacin y descongelacin: variaciones de temperatura rpidas (orientacin correcta de los cristales) Temperatura de almacenamiento: ms baja posible. Nitrgeno lquido (-195C) Empleo de agentes crioprotectores: glicerol (10 al 20%), dimetilsulfxido, leche descremada y carbohidratos. Evita el dao celular.

Congelacin
Enfriamiento rpido
Queda ms agua retenida dentro de la clula pero se forman cristales pequeos que no provocan dao fsico. Sale mayor cantidad agua de las clulas pero tienen efectos negativos como cristales ms grandes, concentracin de sales intracelular y cambios en la membrana plasmtica. Lo que puede causar daos fsicos a las clulas

Enfriamiento lento

TEMPERATURA OPTIMA -1 y -2C/min.

Agentes crioprotectores
Caractersticas: Facilitan el flujo de agua a travs de la membrana y protegen estructuras moleculares. No son txicos. Facilidad para acumularse intracelularmente. Conservan su forma amorfa durante la cristalizacin. Capaces de unir molculas de agua para retrasar la congelacin. Compensan la diferencia de presin osmtica.

Liofilizacin

Congelar el agua libre de las clulas y, luego, eliminarla mediante el vaco (sublimacin). Es un proceso de SECADO desde el estado congelado. Ventajas: Reduccin de la variabilidad del mo Temperatura baja (productos termolabiles no se alteran) Largo tiempo de conservacin No existe peligro de oxidacin No hay agua libre Comodidad para el almacenamiento (18C-20C) y Conservacin de para el envo de las cepas cepas durante 30 aos, controlar cada Desventajas: 5 aos - requiere aparatos especiales - el tratamiento es ms complejo que el de la congelacin.

Liofilizacin
Factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las clulas: Los mismos que influyen en la congelacin, ms los que surgen como consecuencia de la deshidratacin. Crioprotectores: inositol (bacterias), glutmico-glutamato
(bacterias lcticas), mezclas de glucosa con caldo hgado (bacterias anaerobias), leche descremada (hongos) glicerol (NO) - Dimetilsulfxido (NO)

Factores que influyen especficamente en la eficacia de la liofilizacin

Tipo de microorganismo (hongos filamentosos no esporulados conservar por otro mtodo) Concentracin celular: 108-109 clulas/ml (bacterias) y algo < (hongos) Temperatura durante la sublimacin: < -50C Grado de deshidratacin alcanzado: lo ms alto posible Atmsfera de oxgeno en el tubo: tubos cerrados al vaco (para evitar rehidratacin y el O2) Condiciones de almacenamiento: a temperatura constante, preferentemente 18C y sin bajar de los 0C. En la oscuridad.

Mtodos de conservacin
LARGO PLAZO: congelacin (a 70 C y 196 C) y liofilizacin Mnimo riesgo de cambio gentico en las clulas y las mantienen viables por 10 aos o ms - (cultivos de hongos, bacterias y levaduras, algas, suero, clulas sanguneas, entre otros).

MEDIANO PLAZO: secado o desecacin en diferentes soportes y suspensin en agua estril, logran mantener la viabilidad de los cultivos entre 2 y 5 aos. Mtodos bien documentados en especial para los hongos.

CORTO PLAZO: repiques peridicos y supresin de la evaporacin permiten la supervivencia de los cultivos en cortos perodos de tiempo.

Para la seleccin de la tcnica ms adecuada de conservacin

deben tomarse en consideracin:
Tipo de microorganismo Criterios de viabilidad, pureza, cambios genticos, Cantidad de clulas Nmero y valor de los cultivos a preservar Disponibilidad de recurso humano Equipamiento y soporte financiero Suministro y transporte de cepas Frecuencia de uso de los cultivos

IMPORTANTE
No existe una tcnica universal para conservar
adecuadamente todos los microorganismos.

Por seguridad y para minimizar la probabilidad

de prdida de las cepas, cada una debe ser mantenida por al menos 2 procedimientos diferentes y por duplicado en dos edificios separados, para evitar la prdida de las mismas por desperfectos en las instalaciones.

Coleccin de Cultivo
Objetivo primario
Mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfolgicos, fisiolgicos o genticos.

- Coleccin creada por Kral (Praga, 1880), fue la primera en tener catlogo - Coleccin de la Asociacin Internacional de Botnicos (Holanda 1906) - Coleccin del Commanwealth Mycological Institute del Reino Unido (1919) - American Type Culture Collection (ATCC) (EEUU, 1925) - La Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT) nace en el CSIC (Villanueva)(1960). A partir de 1972 las CC se agrupan en la organizacion internacional denominada World Federation for Culture Collection (WFCC). En Europa a su vez estan agrupadas en la European Culture Colletion Organization (ECCO) que se fund en 1982.
Existen ms de 450 colecciones en ms de 60 pases registrados en el Centro de datos mundial de microorganismos (WDCM).

Coleccin de Cultivo. Actividades

1.-Recoleccin, conservacin y suministro de cepas microbianas. 2.-Recopilacin de datos de las cepas microbianas y difusin de los mismos 3.-Servicio de guardera de las cepas microbianas 4.-Identificaciones microbianas. 5.-Depsito de cepas microbianas. 6.-Organizacin de Cursos 7.-Investigacin. 8.-Asesoramiento en general

Proveedores de cepas de referencia:

Primera opcin: Algunos ejemplos ATCC (American Type Culture Collection). SVM (Foundation for the Advancement of Public and Environmental Protection) CECT (Coleccin espaola de cultivos tipos). CNCM. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) lNSTITUT PASTEUR Segundo opcin: Proveedores acreditados por ISO 9001 que realizan repiques a partir cepas adquiridas en la coleccin reconocida.

 Para qu son necesarios los cultivos de referencia ?

Evaluacin de la calidad de los medios de cultivo y discos de antibiticos. Realizar controles de calidad interno durante la ejecucin de los ensayos. Realizar controles de calidad de reactivos. Pruebas confirmatorias. Validar mtodos.

Bibliografa
Curso Terico-Prctico de Postgrado Preservacin de cultivos en Microbiologa Clnica Dep. de Qumica Biolgica y de Ciencias Biolgicas. Fac. de Cs. Exactas y Naturales. UBA. (2002). Garca Lpez MD; Uruburu Fernndez F. La conservacin de cepas microbianas. Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Universitat de Valncia. Disponible en http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/ingenieriabioquimicaIyII/seminario3.doc Gua Conservacin de Microorganismos. Ctedra Microbiologa General. Facultad de Bioqumica y Ciencias Biolgicas. UNL. 1999