Manual de Prcticas de Microbiologa Blgo. Luis Cartagena S.

Prctica:

Metabolismo microbiano
El metabolismo se puede entender como el conjunto de reacciones o actividades qumicas que se suceden en una clula microbiana, que permiten obtener la energa necesaria para las diferentes actividades vitales como la nutricin, sntesis, crecimiento, reproduccin etc. Estos procesos estn controlados por enzimas codificadas por el material gentico. Los sustratos sobre los cuales las enzimas pueden actuar, se incorporan al medio de cultivo, algunos junto con un sistema indicador que puede detectar ya sea el consumo del substrato o la formacin de productos metablicos especficos. Seleccionando una serie de medios que miden diferentes caractersticas metablicas del microorganismo en estudio, es posible determinar una huella digital bioqumica que permite lograr la identificacin. Objetivo: Conocer e identificar los productos formados por los microorganismos durante el metabolismo. Demostrar acciones enzimticas de los microorganismos sobre carbohidratos, protenas, grasas, cidos nucleicos y fuentes inorgnicas.

I. METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS
Los carbohidratos son la fuente principal de energa y estructuras de carbono para la sntesis de sustancias celulares. la degradacin microbiana de los glcidos se realiza por diferentes vas metablicas y para su estudio se puede emplear diferentes medios de cultivos. * La utilizacin de la glucosa, constituye para los microorganismos la principal fuente de carbono y su degradacin se produce por tres vas principales que son: la va de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), la de Entner-Douderoff (DE) y la de Warburg-Dickins (hexosa monofosfato o HMP). Muchos microorganismos utilizan la glucosa mediante lo que se llama fermentacin cido mixta en la cual se produce una variedad de cidos orgnicos a partir del cido pirvico incrementando la acumulacin de +H detectable con el indicador Rojo de Metilo. En cambio otros metabolizan el cido pirvico principalmente por la va del butilenglicol, produciendo acetilmetilcarbinol y que se detecta mediante la prueba de Voges Proskauer. * La utilizacin de disacridos, tales como la sacarosa y la lactosa deben degradarse en monosacridos antes de que los microorganismos puedan utilizarlos. Varios microorganismos producen enzimas que facilitan esta desintegracin por hidrlisis, detectndose la produccin de acidez y gas proveniente de la degradacin de la glucosa mediante el uso de un indicador y de pequeos tubos de Durham invertidos. * La utilizacin de los polisacridos, como por ejemplo el almidn, glucgeno y la celulosa. Muchas de estas sustancias son tan grandes que no pueden ser incorporadas para su metabolismo por los microorganismos. Solo aquellos microorganismos que producen y excretan enzimas capaces de facilitar la hidrlisis externa parcial de esos polisacridos, pueden utilizarlos. Un ejemplo de la utilizacin de los polisacridos es la prueba de la hidrlisis del almidn.

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Ciertos microorganismos producen una amilasa (exoenzima) capaz de hidrolizar el almidn, causando su degradacin en maltosa y glucosa, perdiendo la capacidad de dar una reaccin de color con la solucin de lugol lo que permite su identificacin.

Utilizacin de la glucosa
Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano de Escherichia coli y Enterobacter spp. de 18 a 24 hr.

Material y medio de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Tubos con medio Clark-Lubs (MR-VP) Tubos vacos estriles. Goteros o pipetas Reactivo: Rojo de Metilo al 1%

Solucin de -naftol al 5% KOH al 40%

Mtodos: Determinacin de la produccin de cido y Acetil metil carbinol Se utilizan la Prueba de Rojo de metilo (RM) y la prueba de Voges Proskauer (VP) a) Produccin de cido (Prueba de Rojo de metilo) Se utiliza para medir el grado diferencial de acidez cualitativa entre diferentes microorganismos. Procedimiento: Protjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Inocule (siembre) los microorganismos en los tubos con medio Clark-Lubs (VPMR) por la tcnica de siembra de inoculacin o agitacin. Incube a 37C por 24 a 48 horas Despus de la incubacin, divida el cultivo en dos partes; luego a una de ellas Aadir 5 gotas del reactivo Rojo de metilo y observe la reaccin. Interpretacin: RM(+): si se observa un color rojo estable en el medio, indicar que la acidez se encuentra en un pH 4,5 o menos RM(-): si el medio es amarillo o naranja. b) Produccin de Acetil metil carbinol (Prueba de Voges Proskauer) Determina la capacidad de algunos microorganismos de producir un producto final neutro el acetil metil carbinol (acetona) a partir de la fermentacin de la glucosa. Procedimiento: A la segunda parte del cultivo dividido, agregar 0,6 mL 12 gotas de -naftol al 5% y 0,2 mL 4 gotas de KOH al 40% Agite y deje en reposo por unos 10, luego observe la reaccin. Interpretacin:

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Utilizacin de disacridos: Produccin de cido y Gas

Muestra Biolgica:

VP(+): si el medio toma un color rojizo a los 10 15 minutos VP(-): si el color del medio es amarillo lechoso o cobrizo.

Cultivo bacteriano de Escherichia coli y Pseudomonas spp. de 18 a 24 hr.

Material y medio de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Tubos con caldo lactosado (o glucosado) con indicador rojo de fenol y campana de Durham. Procedimiento: Protjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Inocular cada microorganismo en tubos con caldo lactosado Incubar a 37C por 18 a 24 horas Despus de la incubacin, observe la reaccin en el medio y en el interior de la campana de Durham. Interpretacin: Acidez (+): se manifiesta por un cambio de color del indicador en el medio de cultivo de rojo a amarillo Acidez (-): si no se presenta cambio de color en el indicador Gas (+): se manifiesta por la presencia de una burbuja en la campana de Durham debido a la acumulacin de gas en esta Gas (-): no hay presencia de burbuja.

Utilizacin de polisacridos: Produccin de amilasa

Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano de Bacillus subtilis y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medio de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Placas con Agar Almidn al 1%. Reactivo: Lugol. Procedimiento: Protjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Sembrar por estras los microorganismos en 2 sectores de la placa con agar almidn Incubar a 37C por 24 a 48 horas Despus de la incubacin, agregar en la superficie de la placa lugol y observar la reaccin. Interpretacin:

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Amilasa (+): si alrededor del microorganismo se observa zonas o halos claros (transparente), lo que indica que el almidn ha sido hidrolizado por la presencia de la enzima Amilasa (-): si no se observa zonas o halos claros alrededor del microorganismo, que indicara la ausencia de produccin de enzima amilasa.

II. METABOLISMO DE LAS PROTENAS

Los microorganismos son incapaces de ingerir protenas, pero muchas de las especies producen proteinasas y peptidasas que hidrolizan las protenas en forma sucesiva hasta pptidos pequeos y aminocidos que si pueden asimilar las clulas. Los aminocidos se pueden utilizar para la sntesis de protenas o pueden ser metabolizados por diferentes vas que originan productos intermediarios como piruvato, ceto glutarato y oxalacetato que se interrelacionan con las vas del metabolismo de los carbohidratos. * La hidrlisis de la Gelatina, es realizada por ciertos microorganismos; por la capacidad de producir exoenzimas como la gelatinasa que son enzimas proteolticas capaces de desdoblar la gelatina y otras protenas a pptidos y aminocidos. Los microorganismos que secretan gelatinasa en medios de cultivos o substratos que contienen gelatina se pueden detectar observando la licuacin de esta. * La produccin de Hemolisinas, donde muchas bacterias producen exoenzimas que sirven como mecanismo de agresin en la lucha continua de los procesos infecciosos, es el caso de la produccin de exoenzimas con efecto destructivo sobre la hemoglobina de los glbulos rojos. Tales enzimas se llaman hemolisinas que de acuerdo al grado de hemlisis pueden ser , , . * La produccin de Indol, que es un producto de degradacin metablica del aminocido triptfano. Los microorganismos que sintetizan la enzima triptofanasa son capaces de desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La prueba de indol esta basada en la formacin de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehido al emplearse el reactivo de Kovacs o de Ehrlich. * La hidrlisis de la urea, donde los microorganismos pueden hidrolizar urea que es un producto de desecho orgnico importante en el metabolismo animal, en amonaco y bixido de carbono (CO2). En los medios de cultivo el amonaco liberado reacciona para formar carbonato de amonio, producindose la alcalinizacin por el aumento de OH en el pH del medio. * La produccin de sulfuro de hidrgeno, donde ciertos microorganismos que tienen una enzima que liberan el tomo de azufre de los aminocidos sulfurados presentes en la mayora de protenas, el cual es reducido a sulfuro de hidrgeno con hidrgeno de los substratos. En los sistemas de deteccin de cido sulfhdrico en la reaccin final se forma un precipitado negro insoluble de sulfuro de metal pesado formado en el medio (TSI) o en la tira de papel de filtro colocado en el sistema (Agar peptona con tira de papel embebido con acetato de plomo). Metabolismo de los aminocidos Los microorganismos requieren diferentes aminocidos para su nutricin, crecimiento y actividad vital. Algunos microorganismos tienen la capacidad de catabolizar y transformar los aminocidos mediante procesos de desaminacin, descarboxilacin y transaminacin.

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* La desaminacin de la fenilalanina, aminocido que por desaminacin forma al cido fenilpirvico, el cual se detecta por la formacin de un color verde intenso en el medio de cultivo por la adicin de una solucin de cloruro frrico al 10%. * La descarboxilacin de la lisina, realizada por muchas especies que poseen enzimas capaces de descarboxilar aminocidos especficos del medio con liberacin de aminas de reaccin alcalina y dixido de carbono como productos. En el medio agar LIA esta reaccin se pone de manifiesto mediante el viraje del indicador prpura de bromocresol a un color prpura intenso por la alcalinidad producida.

Produccin de las Hemolisinas

Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes de 18-24 hr.

Material y medio de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Placas con Agar Sangre Procedimiento: Protjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Sembrar por estras los microorganismos en 2 sectores de la placa con agar sangre Incubar a 37C por 24 a 48 horas Despus de la incubacin, observe que a ocurrido en el medio de cultivo. Interpretacin: hemlisis: si alrededor del microorganismo se observa zonas o halos traslcidos, por una degradacin completa de la hemoglobina. hemlisis: si se observan halos verdosos, por una degradacin parcial hemlisis: si hay ausencia de halos.

Produccin de indol
Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano de Escherichia coli y Citrobacter spp. de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Tubos con Caldo peptonado o triptonado Gotero o pipeta. Reactivo: Reactivo de Kovacs o Ehrlich. Procedimiento: Protjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios

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Inocular (sembrar) los microorganismos por inoculacin o agitacin en los tubos con caldo peptonado o triptonado Incubar a 37C por 18 a 24 horas Despus de la incubacin, agregar 5 gotas del reactivo de Kovacs, si se emplea en reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por la adicin de 1 mL de cloroformo; observar la reaccin.

Interpretacin: Indol (+): si se forma un anillo de color rojo-fucsia o rojo-cereza en la interfase entre el reactivo y el medio de cultivo. Indol (-): si no se forma el anillo en la interfase.

Produccin de Ureasa
Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano de Proteus sp. y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Tubos con Agar urea Procedimiento: Protjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estras los microorganismos en los tubos con Agar urea Incubar a 37C por 18 a 24 horas Despus de la incubacin, observar la reaccin o cambios ocurridos. Interpretacin: Ureasa (+): si el color del medio cambia de amarillo a rosado o rojo grosella por el indicador rojo de fenol, debido a la alcalinizacin del medio por la hidrlisis de la urea Ureasa (-): cuando no hay cambio de color.

Produccin de hidrgeno sulfurado

Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano de Proteus sp, Citrobacter sp o Salmonella y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Tubos con agar TSI o tubos con agar peptona Papel impregnado con acetato de plomo

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Procedimiento: Protjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estras y puntura los microorganismos en los tubos con Agar TSI o por estras en los tubos con agar peptona y simultneamente colocar en la boca del tubo un papel de filtro impregnado con una solucin saturada de acetato de plomo Incubar a 37C por 18 a 24 horas Despus de la incubacin, observar la reaccin o cambios ocurridos. Interpretacin: H2S (+): cuando se ennegrece el fondo del tubo con agar TSI por la formacin de sulfato ferroso o sulfuro de plomo al ennegrecer el papel en el tubo con agar peptona H2S (-): en ausencia de color negrusco.

Produccin de descarboxilasas
Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano de Enterobacter aerogenes y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Tubos con agar LIA Procedimiento: Protjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estras y puntura (3 veces) los microorganismos en los tubos con Agar LIA Incubar a 37C por 18 a 24 horas Despus de la incubacin, observar la reaccin o cambios ocurridos. Interpretacin: Lisina descarboxilasa (+): si aparece de un color prpura intenso, lo que indica la alcalinizacin de todo el medio Lisina descarboxilasa (-): no hay cambio de color. III. METABOLISMO DE LPIDOS A pesar que los lpidos no representan componentes importantes dentro del substrato nutritivo, ellos tienen cierto significado en la actividad vital de los microorganismos, en particular, aportndoles una elevada resistencia contra los factores nocivos del medio ambiente. Los microorganismos con ayuda de las lipasas y otras enzimas lipolticas firmemente asociadas al citoplasma celular pueden degradar grasas y aceites, y obtener as acetato para el metabolismo de carbohidratos y la sntesis de aminocidos.

Produccin de lipasas
Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano de Bacillus subtilis y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo:

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Guantes, Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Placas con agar tributirina o agar mantequilla con indicador rojo neutro.

Procedimiento: Protjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estras los microorganismos en 2 sectores en la placa con agar mantequilla o tributirina con indicador rojo neutro Incubar a 37C por 18 a 24 horas Despus de la incubacin, observar la reaccin o cambios ocurridos. Interpretacin: Lipasa (+): si se evidencia halos trasparente alrededor de la colonia (agar tributirina) o colonias rojas (agar mantequilla) debido al indicador rojo neutro, por la formacin de acidez Lipasa (-): no hay cambios. IV. METABOLISMO DE LOS CIDOS NUCLEICOS Los cidos nucleicos constituyen una alta proporcin del protoplasma bacteriano; as, gran parte de la actividad celular est encaminada a su biosntesis y catabolismo, ms que en la mayora de otras clulas. Algunas especies tienen la capacidad de formar diferentes enzimas intra y extracelulares que despolimerizan los cidos nucleicos, son enzimas hidrolticas del tipo de la diesterasas que parten los cidos nucleicos: como las DNAsas y RNAsas, a nivel de las uniones de los nucletidos y as mismo pueden retornar a las reservas metablicas de las que provinieron por acciones sucesivas de nucleasas, nucleotidasas y nucleosidasas. Las DNAsas en presencia de iones de magnesio producen la despolimerizacin del DNA.

Produccin de DNAsa
Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano de Staphylococcus aureus y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Placas con agar ADN Gotero o pipeta. Reactivo: cido clorhdrico 1 N. Procedimiento: Protjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estras los microorganismos en 2 sectores en la placa con agar ADN Incubar a 37C por 18 a 24 horas Despus de la incubacin, agregar en la superficie de la placa cido clorhdrico 1 N y observar la reaccin. Interpretacin:

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DNAsa (+): si se observar halos blancos alrededor de la colonia si es que se ha producido DNAsa debido a que los nucletidos son solubles en cido mientras que el DNA es insoluble DNAsa (-): no se observan halos.

V. METABOLISMO DE FUENTES INORGNICAS * Utilizacin del citrato, donde algunos microorganismos pueden obtener energa por va distinta de la fermentacin de carbohidratos, utilizando citrato como nica fuente de carbono detectable por el desarrollo del microorganismo en el medio de cultivo. Las bacterias que utilizan citrato tambin pueden extraer nitrgeno del fosfato de amonio, con produccin de amonaco alcalinizando el medio de cultivo que es detectado por el cambio de color del indicador utilizado. * Reduccin de nitratos, algunos microorganismos pueden reducir los nitratos en nitritos en condiciones anaerobias donde la molcula de nitrato acta como aceptor de hidrgeno desempeando la funcin del oxgeno. La presencia de nitritos en el medio se detecta aadiendo -naftilamina y cido sulfanlico con la formacin de un color rojo de diazonio, p-sulfobenceno-azo--naftilamina.

Utilizacin del citrato

Muestra Biolgica:

Cultivo bacteriano de Enterobacter spp, Citrobacter spp y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fsforo Asa bacteriolgica o de Kolle Tubos con medio agar Citrato Simmons. Procedimiento: Protjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estras los microorganismos en los tubos con agar Citrato Simmons Incubar a 37C por 18 a 24 horas Despus de la incubacin, observar la reaccin o cambios ocurridos. Interpretacin: Citrato (+): al observar cambio de color por el indicador azul de bromotimol que vira (cambia) del verde al azul por la alcalinidad presente en el medio; la prueba tambin es positiva en ausencia de color azul si existe un desarrollo visible de colonias a lo largo de la estra de inoculacin Citrato (-): cuando no hay cambio de color ni crecimiento observable.

Resultados: * Haga la representacin esquemtica de lo procesado y los resultados en cada caso.

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Cuestionario: Qu tipos de cidos se forman en la degradacin de los carbohidratos por los microorganismos bacterianos? qu productos de obtienen de la degradacin del almidn, y cmo reaccionan con el lugol? Cmo se forma el anillo en la prueba de produccin de indol? Cul es otras reacciones se producen en el medio TSI, y cmo se interpreta? Qu obtiene la bacteria al degradar los lpidos? Qu productos se obtienen de la degradacin de los lpidos? Por qu no se prefiere utilizar sangre humana para la identificacin de hemolisinas? Qu reaccin ocurre en el proceso de utilizacin de citrato? Cul es la manifestacin de color de los indicadores de color: rojo neutro, rojo de fenol, azul de bromotimol?