EXTRACTO DE GINKGO BILOBA INHIBE LA ADICIN ENDOTELIAL EN SITUACIONES DE RIESGO COMO LA DIABETES BASADO EN SU MECANISMO ANTIOXIDANTE

Abstract: Atherosclerosis is a cardiovascular disease that affects the current population, and some chronic diseases such as diabetes can be a risk factor, therefore, some studies have been realized to find possible treatments including herbal extract of Ginkgo biloba. The extract has shown great benefits in processes which occur in early stages of atherosclerosis, since, GBE reduces significantly ROS, transcriptional factors, chemokines as IL-6, proinflammatory cytokines, and especially adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1, based largely on its antioxidant mechanism. All this makes it a very good choice and a candidate to be evaluated clinically. Resumen: La aterosclerosis es una de las enfermedades cardiovasculares que ms afectan a la poblacin actual, y algunas enfermedades crnicas como la diabetes pueden ser un factor de riesgo para desarrollarla, es por ello, que se han venido realizando estudios para encontrar posibles tratamientos entre ellos los basados en fitoteraputicos como extractos de Ginkgo biloba. Dicho extracto ha mostrado grandes beneficios en los procesos que acontecen las primeras etapas de la aterosclerosis, ya que se tienen notables reducciones de ROS, factores de transcripcin, quimiocitoquinas como la IL-6, citoquinas proinflamatorias, y especialmente las molculas de adhesin ICAM-1 y VCAM-1, basada principalmente en su mecanismo antioxidante. Todo esto lo convierte en una muy buena opcin y un candidato a ser valorado clnicamente. Key words: Ginkgo Biloba extract, atherosclerosis, ICAM-1, VCAM-1, IL-6, endothelial adhesiveness, oxLDL Palabras claves: Extracto de Ginkgo biloba, aterosclerosis, ICAM-1, VCAM-1, IL-6, adhesin endotelial, LDL-ox. CONTENIDO Introduccin Estudios in vitro de la accin del ginkgo biloba y los mecanismos de adhesin de monocitos al endotelio Molculas involucradas en la adicin endotelial. Efecto del ginkgo biloba sobre los factores promotores de aterosclerosis. Discusin de resultados... Conclusiones... Bibliografa.. INTRODUCCIN La aterosclerosis es una enfermedad cardiovascular muy comn hoy en da, cuyo riesgo incrementa con la edad y algunas patologas como la hipertensin arterial, diabetes y hbitos como el tabaquismo. En sus primeras etapas, acontece la adhesin de monocitos al epitelio, mediada por la expresin de molculas de adhesin como VCAM-1 1 2 2 3 4 5 6 (Molcula 1 de adhesin vascular), ICAM-1 (Molcula 1 de adhesin intracelular) y Eselectina, acompaado por un incremento del estrs oxidativo. Junto a estos procesos se presenta la liberacin de citoquinas proinflamatorias como TNF- y una cascada de reacciones que contribuyen a la inflamacin de la ntima y formacin del ateroma. Es por ello, que se han buscado alternativas teraputicas para prevenir dicha patologa, entre ellas el extracto de Ginkgo Biloba (EGB), que ha sido empleado en la medicina tradicional China para trastornos cardiovasculares y desordenes neurolgicos, y que por su actividad antioxidante, puede llegar a brindar ciertos beneficios. En el presente trabajo se pretenden mostrar algunos estudios que investigan el mecanismo del EGB y los aportes positivos para evitar el desarrollo de la aterosclerosis, incluso en casos donde se presenta diabetes, como factor de riesgo asociado.

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ESTUDIOS In vitro DE LA ACCIN DEL GINKGO BILOBA Y LOS MECANISMOS DE ADHESIN DE MONOCITOS AL ENDOTELIO Se llevaron a cabo cultivos celulares de HAEC (clulas endoteliales de aorta humana) para evaluar el efecto de los altos niveles de glucosa en el endotelio, y la produccin de ROS (especies reactivas de oxgeno), quimiocitocinas, molculas de adhesin y a su vez el alcance del EGB sobre dichos mediadores de inflamacin (por ejemplo, reversibilidad de los efectos). Tambin se hizo cultivo de THP-1 (Lnea celular de leucemia monoctica aguda humana) y U937, para estudiar los procesos de adhesividad endotelial de monocitos. Como herramientas de deteccin se emple ELISA, western blot, EMSA y mecanismos de fluorescencia para la medicin de ROS. En un estudio donde evalan el efecto del Ginkgo Biloba sobre las LDL oxidadas se emplearon clulas endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC), que son una buena alternativa en la investigacin de patologas de las clulas endoteliales. MOLCULAS INVOLUCRADAS EN LA ADHESIN ENDOTELIAL Molculas involucradas en la adicin endotelial y su relacin con los altos niveles de glucosa [1] Las clulas se cultivaron en un medio con altos niveles de glucosa (25mmol/L) y se estudiaron los resultados por 14 das, donde se pudo ver claramente la produccin de molculas de adhesin con VCAM-1, ICAM-1 e IL-6, dicho comportamiento se extiende hasta los 7 das, y luego desciende a los 14 das, es decir, que no se presentan cambios significativos. En vista de que la diabetes es una enfermedad crnica, es importante contemplar los efectos a largo plazo de altos niveles de glucosa. En el

estudio se tuvo en cuenta dicho estudio y se evaluaron los efectos tanto de glucosa (25mmol/L) como de manitol (25mmol/L), durante 1,4 y 7 das, donde se pudo observar el incremento de expresin de ICAM-1, luego se cambi el medio de crecimiento de las clulas por uno con niveles normales de glucosa, y se pudo encontrar la reversibilidad de los efectos (se redujo la expresin endotelial de ICAM-1). Por otro lado, con base en los resultados anteriores es importante conocer el rol de ICAM-1 en la adhesin endotelial de monocitos, para ello se recurre al uso de un anticuerpo anti-ICAM-1, obtenindose una reduccin significativa del 21,4% de la adhesin de las clulas THP-1 a las HAECs. Igualmente, se llega a un posible mecanismo ligado al efecto osmtico. Igualmente se presento un aumento en la secrecin de IL-6 en el medio a los 4 das, lo que condujo a una acumulacin de ICAM-1 en un 24% del total de las clulas cultivadas, para ratificar dicho argumento se empleo un anticuerpo neutralizante de IL-6, y se encontr una reduccin del 57,7% en la adhesividad endotelial. Molculas adicionales involucradas en la adhesin endotelial (estudios no relacionados con altos niveles de glucosa) Adems de la expresin de molculas de adhesin en las primeras etapas del desarrollo de la aterosclerosis como se vio anteriormente, independiente de los niveles de glucosa, se ve un incremento de las LDL-ox, as que es importante tener en cuenta el papel de stas. Un estudio procedi a cultivar las clulas HUVECs conjuntamente con LDL-ox (150g/mL), y se not claramente un aumento de 500% en la produccin de ROS. [2] De igual forma las citoquinas proinflamatorias se ven incrementadas en las clulas endoteliales al ser expuestas a LDL-ox, por lo

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que tambin es necesario observar los efectos de stas como el TNF-. Para ello se emplean clulas U937 que se cultivan junto con clulas HAEC sin estimular y estimuladas con TNF- (2 ng/mL por 6 horas). Los resultados coinciden con lo esperado, ya que las primeras no muestran una notoria adhesin endotelial de monocitos, mientras que las segundas si presentan dicho fenmeno. [3] Dichos estudios ya nos dan un panorama ms claro de las molculas involucradas en el fenmeno de adhesin, y por tanto, ahora se hace necesario evaluar el efecto del EGB sobre la produccin de stos y compararlo respecto a otros compuestos como antioxidantes para dilucidar algn mecanismo en comn y la factibilidad de uso teraputico. EFECTO DEL GINKGO BILOBA SOBRE LOS FACTORES PROMOTORES DE ATEROSCLEROSIS Hay distintos estudios que muestran resultados similares sobre los efectos del Ginkgo Biloba en la produccin de las molculas nombradas anteriormente. A continuacin se muestran algunos de los resultados obtenidos en cada uno de ellos. En el primer estudio se evalan los efectos del EGB (100 g/mL) y del antioxidante Nacetilcistena (NAC) (1 mmol/L). Se incubaron las clulas 1 da antes con dichas sustancias y luego se introducan las clulas THP-1 para evaluar la adhesin, la cual pasa de 16000 unidades relativas de fluorescencia (URF) para la glucosa y 14000 URF para el manitol a 8000 con el EGB y 7000 con NAC en ambos casos. Del mismo modo, como era de esperarse se ven reducidos los niveles de expresin endotelial de ICAM-1 y secrecin de IL-6. Se atribuyen dichos resultados a la actividad antioxidante del EGB, adems se propone una posible ruta que consiste en una secrecin inicial de IL-6, que consecuentemente aumenta la expresin de ICAM-1, llevando

finalmente a la adhesividad endotelial de monocitos. Se encontraron rutas adicionales involucradas en la activacin de las ICAM-1 como el factor de transcripcin STAT 1/3, se llego a dicha conclusin al evaluar la expresin de dicha molcula de adhesin, en presencia de Fludarabina (20mol/L) (inhibidor de STAT 1), Piceatanol (10mol/L) (inhibidor de STAT 1/3), EGB y sus combinaciones, donde se tenan reducciones para EGB y Piceanatol solos, ms no con la Fludarabina, lo que demuestra una mayor influencia de STAT 3 en la aterosclerosis; en cuanto a las combinaciones EGB/Pic y EGB/Flu, en ambas se presentaron reducciones. Cabe resaltar que todos los ensayos se llevaron a cabo en medios con altos niveles de glucosa o manitol, lo que representa una posible alternativa de tratamiento para pacientes con diabetes, que tienen un mayor riesgo de padecer aterosclerosis. [1] En un estudio adicional se observan los efectos del EGB en clulas que han sido cultivadas junto con TNF- , los cules fueron comparados con el antioxidante probucol. En cuanto a la adhesin endotelial de monocitos (clulas U937) 50g/mL del EGB la redujeron en un 68,7%, mientras que 5g/mL, lo hacen en un 48,6%, se emple la combinacin, pero no se tuvieron efectos aditivos, lo que se podra interpretar como un posible efecto comn (antioxidante). Lo que respecta a la produccin de molculas de adhesin como VCAM-1, ICAM-1 y E-Selectina, el EGB suprimi la expresin de los dos primeros en un 63,5% y un 69,2% respectivamente, el probucol solo acto sobre el primero con 56,4% de reduccin, es importante hacer notar que ninguna de las dos sustancias tuvieron efecto sobre la E-selectina. Ligado a la produccin de las anteriores molculas viene el incremento de protena total, la que se ve marcadamente suprimida por el EGB para las protenas asociadas a VCAM-1 e ICAM-1 en un 37% y 31%, respectivamente, y por el probucol

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solamente las de VCAM-1 en un 55%, el comportamiento de dichas sustancias sobre las protenas vinculadas con E-selectina es nulo. En la investigacin anterior se vio el rol que jugaba el STAT 3 dentro de la activacin de ICAM-1, sin embargo tambin son nombrados los factores como NF-B y AP-1, que son estudiados con ms detalle en este estudio, y sobre los cules el EGB tiene efectos positivos reducindolos significativamente en un 55,2% y un 45,1% respectivamente, mientras que el probucol muestra una accin irregular, pues tiene una mayor accin sobre el primero con un 65,6%, pero sobre el segundo es mucho menor con tan solo un 22,3%. Finalmente, sobre la produccin de especies reactivas de oxgeno, ambas sustancias inhiben la [3] produccin de H2O2. En un tercer estudio se evala otro fenmeno asociado a la aterosclerosis como son los daos endoteliales asociados con las LDL-ox. Uno de los efectos relacionados con las LDL-ox, es el aumento progresivo de ROS, que lleva subsecuentemente a una activacin del sealamiento apopttico; el EGB (100 g/mL) reduce los niveles de ROS en un 95,6%, y el antioxidante Trolox (10 M) en un 104%, igualmente en un intento de conocer los componentes involucrados en la funcin del extracto, se evalo la quercetina (a la concentracin que posiblemente se encuentra en el EGB) y se observa que no es un potente inhibidor, por lo tanto, se aduce que ste compuesto no es el responsable y se deben indagar otras sustancias. En el estudio se plantea adems la influencia del EGB (25 g/mL) en la recuperacin de las enzimas antioxidantes como la superxido dismutasa. Las LDL-ox reducen la liberacin de NO de las clulas endoteliales, causando una disfuncin endotelial, el empleo de EGB demostr un incremento en la produccin de eNOS. Por otro lado, las LDL-ox, aumentan el reclutamiento, retencin y adhesividad de los monocitos implicados en las primeras etapas

de la aterosclerosis, por lo que se investigo la adherencia de las THP-1 a las clulas HUVEC, cuando han sido pretratadas con GBE, mostrndose una inhibicin significativa, que es dosis dependiente. [2] DISCUSIN DE RESULTADOS La presencia de altos niveles de glucosa es un factor de riesgo mayor en lo que se refiere al desarrollo de aterosclerosis, los estudios realizados muestran el aumento en la expresin de molculas que aumentan la adhesividad endotelial y son un indicativo del desarrollo primario de dicha patologa. Las investigaciones demuestran que un posible mecanismo redox dependiente estimula la secrecin de IL-6, el cual induce la activacin de STAT 3 principalmente y consecuente expresin de ICAM-1, que conlleva finalmente a la adhesin de monocitos al endotelio, que luego los monocitos se diferencian en macrfagos, que expresan receptores para LDL oxidadas que sern absorbidas formando las clulas espumosas, que al acumularse en la ntima, inician la formacin del ateroma (Fig 1).

Fig 1. Aterognesis

Para reducir las probabilidades de aterognesis se han estudiado algunas sustancias como el EGB, que como se pudo observar presenta beneficios, ya que al ser

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antioxidante inhibe la activacin de la IL-6 y sus pasos siguientes. Es importante hacer notar otras posibles contribuciones del extracto como es aquella mediada por el HO-1 inducida por Nfr-2 (Fig 2). Algunos estudios sugieren lo importante que es la hemo oxigenasa, ya que cataliza la oxidacin del grupo hemo para generar varias molculas activas (CO, biliverdina e ion ferroso). El CO producido sirve como un segundo mensajero que afecta distintas funciones como inflamacin, proliferacin y apoptosis. La biliverdina se reduce a bulirrubina, y ambas juegan un papel como antioxidantes. Para el caso puntual de aterosclerosis, es la isoforma OH-1, que por induccin de la cobalto protoporfirina, decrece el linfoproliferativo responsable y la diferenciacin de las clulas T citotxicas, proporcionando una funcin anti-inflamatoria.
[4]

El efecto inducido por la IL-6 es REDOX dependiente y relacionado con un efecto osmtico, de ah que cobren importancia los RTK (receptores de tirosina quinasa) que pueden desempearse como sensores osmticos. Futuros estudio in vivo son indicados para determinar la dosificacin adecuada antes de que esta estrategia teraputica pueda ser validada clnicamente. Se hacen necesarios estudios donde se evale dosis respuesta, como en el caso del tercer estudio, pues hasta el momento la dosis de 100g/mL, son altas si se busca extrapolar las investigaciones en humanos. Lo anterior supondra un punto en contra para el empleo del extracto como alternativa teraputica.

BIBLIOGRAFA [1] J. S. Chen, Y. H. Chen, P. H. Huang et al. Ginkgo Biloba extract reduces high-glucoseinduced endothelial adhesion by inhibiting the redox-dependent interleukin-6 pathways. Cardiovascular Dietology. 2012. 11:49. 1-11 [2] T. H. Chiu, I.T. Lee, W.J. Lee, et al. Ginkgo Biloba extract attenuates oxLDL-induced oxidative functional damages in endotelial cells. J. Appl Physiol. 2009. 106: 1674-1685. [3] J.W. Chen, Y. H Chen, F.Y. Lin et al. Ginkgo biloba extract inhibits tumor necrosis factor-induced reactive oxygen species generation, transcription factor activation, and cell adhesion molecule expression in human aortic endothelial cells. Arterioscler Thormb Vasc Biol. 2003. 23: 1559-1566. [4] Y.C. Ho, C.Y. Lin et al. Heme oxygenase-1 in inflammation and cardiovascular disease. Am J Cardiovasc Dis. 2011. 1(2).150-158.

Fig 2. Mecanismo de liberacin de HO-1 inducido por Nfr-2

CONCLUSIONES Tratamiento con EGB (antioxidante natural), puede inhibir la liberacin de IL-6 y acumulacin de ICAM-1, llevando a una reduccin de la adhesividad endotelial de monocitos, debida a los altos niveles de glucosa.