ESCOLA SECUNDRIA DO MONTE DE CAPARICA CPTAL NVEL 4 ANO LETIVO 2012/2013 QUMICA APLICADA

MDULO 8

Relatrio de Qumica Aplicada

Quantificao de efetivos bacterianos de amostras de solo

Identificao do Aluno:
Carina Silva 12G

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ndice

Objetivos ................................................................................................................................................. 3 Fundamento terico ................................................................................................................................ 3 Materiais.................................................................................................................................................. 5 Reagentes ................................................................................................................................................ 5 Procedimento experimental ................................................................................................................... 5 Registo de resultados .............................................................................................................................. 7 Tratamento de resultados ....................................................................................................................... 8 Discusso/Concluso ............................................................................................................................... 8 Bibliografia............................................................................................................................................. 11 Webgrafia ..11

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Objetivos
Efetuar a contagem das colnias e de bactrias cultivveis. Compreender a necessidade de se efetuarem procedimentos especficos como diluies decimais. Preparar meios de cultura. Utilizar tcnica de sementeira superfcie e por incorporao.

Fundamento terico
A cultura de bactrias em laboratrio a tcnica de base de muitos estudos de bacteriologia. As exigncias de crescimento so, contudo, muito variveis. As bactrias aerbicas podem ser quantificadas por sementeira a superfcie ou incorporadas em meios slidos.

Sementeira superfcie - operao que consiste em distribuir uniformemente o inculo em meio de cultura apropriado. Incorporadas a amostra diluda pipetada diretamente sobre a placa de Petri e s depois adicionado o meio de cultura apropriado.

O solo contm uma grande variedade de microrganismos, incluindo bactrias, fungos, protozorios, algas e vrus. Apesar desta diversidade, os microrganismos cultivveis predominante entre a microflora do solo so fungos e bactrias heterotrficas do domnio Bacteria. contudo de ter em considerao que a flora microbiana presente numa amostra de solo particular depende de vrias caractersticas do solo (por exemplo, humidade, pH, temperatura, contedo em oxignio gasoso, composio em material orgnico e inorgnico) e que, alguns destes parmetros ambientais podem variar, por exemplo, ao longo do ano ou em funo do tipo de utilizao que dada ao solo (p. ex. tipo de cultura agrcola, pastoreio, etc.). Estima-se que somente 1 a 9% das clulas viveis de microrganismos presentes no solo so capazes de formar colnias em meios de cultura laboratoriais, como o caso dos meios PDA a usar neste trabalho laboratorial.

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Os outros 91 a 99% da flora bacteriana do solo correspondem principalmente a clulas viveis mas no cultivveis. Os microbiologistas tm chegado a esta concluso, com base, por exemplo, na comparao, relativamente a uma mesma amostra de solo, entre o nmero de clulas que formam colnias em meios de cultura laboratoriais, e o nmero total de clulas observveis com o microscpio de fluorescncia aps a colorao das clulas presentes nessa amostra com compostos fluorescentes (como, por exemplo, o acridine orange que cora todas as clulas e permite distinguir clulas viveis e clulas mortas). Esta situao resulta, frequentemente, dos microrganismos estarem sujeitos a formas variadas de stresse e nos seus ambientes naturais (p. ex. devido a limitao de nutrientes, seca, extremos de temperatura ou pH, presena de compostos txicos), o que pode levar a que as suas clulas vegetativas percam a capacidade de se multiplicar apesar de terem sinais vitais de atividade fisiolgica. Para tal, proceder-se- ao isolamento e contagem, a partir de uma amostra de solo, de colonias de isolados pertencentes ao grupo das bactrias heterotrficas e dos fungos. Recorrer-se- a diluies sucessivas de uma suspenso em gua da amostra de solo, e espalhamento de um volume conhecido (0,1 mL) das suspenses diludas em meios de cultura agarizados com composio apropriada: meio PDA (Potato Dextrose Agar) para fungos filamentosos que um meio no-seletivo, para o isolamento de bactrias heterotrficas diversas. Os meios de cultura slidos so preparados a partir da adio, ao meio liquido correspondente, de um agente solidificante (o agar com uma concentrao de cerca de 1,5-2% p/v), antes da esterilizao do meio.

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Materiais
Placas de Petri (esterilizadas) Tubos de vidro rolhados (esterilizados) Frasco Schott com gua destilada (esterilizada) Pipeta graduada de 1 mL, 10 mL, (esterilizadas) Contador de colnias Erlenmeyers 150 mL Vareta de vidro em L Vareta de vidro Vidro de relgio Lamparina Autoclave Fsforos Balana analtica Proveta graduada 50 mL

NOTA: Todos os materiais devem ser previamente esterilizados na autoclave. Ter cuidado de agitar vigorosamente a suspenso obtida aps cada diluio, antes de proceder diluio seguinte. Aps a passagem da vareta pela chama para queimar o lcool, no esquecer de a deixar arrefecer convenientemente antes de a utilizar para espalhar a suspenso celular na superfcie do meio slido.

Reagentes
Amostra de solo Meio de cultura PDA Soluo salina 0,9% (p/v) em NaCl lcool etlico gua destilada

Procedimento experimental
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1. 2. 3.

4.

Escola Secundria do Monte de Caparica CPTAL - nvel 4 Ano letivo 2012/2013 Pesar 1 grama de amostra de solo. Junto chama do bico de Busen, transferir 1 grama da amostra de solo para o frasco contendo 100 mL de gua destilada esterilizada. Agitar vigorosamente a suspenso de solo preparada no passo anterior, de modo a obter uma suspenso homognea da amostra de solo e a facilitar a suspenso na gua da maior parte das clulas dos microrganismos adsorvidas nas partculas de solo. Junto chama do bico de Busen, transferir 1 mL da suspenso para tubos de ensaio contendo 9 mL de gua destilada esterilizada, de modo a diluir a suspenso de 10-1 (1:10). Faa diluies sucessivas at 10-4 (1:10000).

A. Sementeira superfcie
1. Proceder ao espalhamento das suspenses diludas, sobre o meio slido adequado contido em placas de Petri. Para tal, junto chama bico de Busen, transferir 0,1 ml da suspenso original e de cada uma das suspenses diludas, para a superfcie de meio PDA (at diluio 10-3) contidos em placas de Petri convenientemente identificadas. 2. Espalhar as suspenses diludas sobre o meio slido com uma vareta de vidro em forma de L (esterilizada) por imerso de lcool etlico e passada pela chama do bico de Busen.

3. Incubar as placas temperatura ambiente 3 a 5 dias. 4. Conte as colnias isoladas em cada placa. Com base nessa contagem, faa estimativas do nmero de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de cada um dos dois grupos de microrganismos presentes muna grama de solo.

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Escola Secundria do Monte de Caparica CPTAL - nvel 4 Ano letivo 2012/2013 B. Sementeira por incorporao: Se o meio de cultura do frasco de Shott estiver slido, coloc-lo em banho-maria a 100 C para fundir o meio. 1. Com uma pipeta esterilizada retirar 2 mL de diluio 10-3 e colocar 1 mL em cada uma das caixas de Petri. 2. Com a mesma pipeta proceder de modo idntico para diluio de 10-2, 10-1 e soluome. 3. Retirar o frasco, confirmar que o meio est fundido e deixar arrefecer at 45C (o agar solidifica a 44C). Pode manter-se no banho a 50C. 4. Verter nas caixas cerca de 15-20 mL (2 mm de espessura) de meio de cultura. O meio no deve estar muito quente para que ao arrefecer no acumule gua na tampa. 5. Agitar rodando as caixas para que as bactrias fiquem bem incorporadas e uniformemente distribudas com o meio de cultura. 6. Deixar solidificar o meio e incubar as placas em posio invertida a 36C durante 3 dias. 7. Contar as colnias (UFCs/mL) 8. Para calcular a abundncia de bactrias lem-se as caixas que apresentam de 30 a 300 colnias. Faz-se a mdia das colnias das duas caixas e aplica-se a seguinte frmula:

N de bactrias = valor da mdia valor da diluio

Registo de resultados
Sementeira superfcie Caixas de Petri 1 2 3 Concentrao 10-2 10 10
-2 -2

N de fungos 17 8 19

N de bactrias 145 221 ----

Mdia UFC de fungos =

= 14,7

Mdia UFC de bactrias =

= 183

Sementeira por incorporao Pgina 7 de 11

Escola Secundria do Monte de Caparica CPTAL - nvel 4 Ano letivo 2012/2013 No registado qualquer valor de UFC nas placas de Petri relativas sementeira por incorporao visto que no foram contadas as colnias isoladas em cada placa de Petri.

Tratamento de resultados
Sementeira superfcie

UFC de Fungos Fator de diluio 10-2 14,7 Colnias 14,7 UFC --- 1 mL suspenso 10-2 14,7 x 102 UFC / mL suspenso 2g solo ---- 100 mL (102) 14,7 x 102 x 102 UFC = 1,47 x 105 UFC/2g solo 2g solo ---- 1,47 x 105 UFC 1g solo ----- x x = 7,35 x 104 UFC fungos/g solo

UFC de Bactrias Fator de diluio 10-2 183 Colnias 183 UFC --- 1 mL suspenso 10-2 183 X 10-2 UFC/mL suspenso 2g solo ---- 100 mL (102) 183 x 102 x 102 = 1,83 x 106 UFC/2g solo 2g solo ----- 1,83 x 106 UFC 1g solo ----- y y = 9,15 x 105 UFC bactrias/g solo

Discusso/Concluso
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Escola Secundria do Monte de Caparica CPTAL - nvel 4 Ano letivo 2012/2013 Nesta atividade experimental todos os passos do procedimento foram realizados em condies de assepsia (implica a ausncia de microrganismos), nomeadamente junto chama do Bico de Bunsen mas uma vez que no tnhamos bicos de bunsen tivemos que utilizar uma lamparina de lcool. Antes de iniciarmos a atividade experimental tivemos que esterilizar todo o material a ser utilizado nomeadamente as pipetas graduadas entre outros na estufa esterilizao por calor seco, visto que para transferir as suspenses diluies, meios e solues estreis devem utilizar-se pipetas graduadas ou pipetas de Pasteur estreis para no contaminar o meio. Alm disso tivemos que esterilizar os meios de cultura utilizando o calor hmido sob presso na autoclave - esterilizao pelo calor (autoclavagem), durante aproximadamente 15 minutos durante de modo a assegurar a morte de todos os microrganismos. Os erlenmeyers (que continham o meio de cultura) a esterilizar foram tapados com rolhas de algodo. Na preparao da amostra de solo a ser analisada aps juntarmos 100 mL de gua destilada a 1 g de solo tivemos que agitar vigorosamente a suspenso de solo preparada de modo a obter uma suspenso homognea da amostra de solo e a facilitar a suspenso na gua da maior parte das clulas dos microrganismos adsorvidas nas partculas de solo. De seguida, fizemos diluies sucessivas at 10-4 (1:10000) o que permitem-nos obter, em placas com PDA, colnias perfeitamente isoladas o que possibilita a sua contagem com maior rigor. Aps preparadas as suspenses diludas tivemos que espalhar essas mesmas suspenses sobre o meio slido (PDA) com uma vareta de vidro em forma de L previamente esterilizada por imerso de lcool etlico e passada pela chama da lamparina de lcool. Aps passagem da vareta pela chama para queimar o lcool, devemos deixar arrefecer convenientemente antes de se utilizar para espalhar a suspenso na superfcie do meio slido esterilizao por calor seco. Terminado o espalhamento das suspenses diludas pelo meio slido PDA deixamos incubar as placas temperatura ambiente durante 1 semana. Na sementeira por incorporao tivemos que agitar lentamente as caixas de Petri para que as bactrias fiquem bem incorporadas e uniformemente distribudas com o meio de cultura. De seguida, tivemos que incubar as placas em posio invertida a 36C durante 1 semana. Passada 1 semana fomos ver as placas de Petri e fizemos a contagem de UFC fungos e UFC bactrias existentes. Relativamente qualificao de UFC das placas de Petri da sementeira superfcie escolhemos as de fator de diluio 10-2.

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Escola Secundria do Monte de Caparica CPTAL - nvel 4 Ano letivo 2012/2013 Escolhemos as placas com o fator de diluio 10-2 visto que fundamental que o nmero de colnias desenvolvidas nas placas no seja demasiado grande porque algumas clulas podero no formar colnias e a contagem no ser correta. O nmero de UFC tambm no deve ser demasiado pequeno de modo a inviabilizar o significado estatstico da contagem. Devemos escolher as placas que tenham de 30 a 300 colnias.

No efetumos a contagem de UFC nas placas da sementeira por incorporao. Depois de contadas as UFC de fungos e UFC de bactrias e feitas as mdias realizamos os respetivos clculos para sabermos o nmero de UFC de bactrias e UFC de fungos existentes por grama de solo. Conclui que existia 7,35 x 104 UFC fungos/g solo e 9,15 x 105 UFC bactrias/g solo na placa de Petri utilizada com o fator de diluio 10-2.

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Bibliografia
Apontamentos fornecidos pelo professor Fernando Ferreira

Webgrafia
http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=276 (visto a 25 de Novembro de 2012) http://www.infopedia.pt/$assepsia (visto a 04 de Dezembro de 2012) http://repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/2241/1/U1.pdf (visto a 04 de Dezembro de 2012) http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=276&ordem=2 (visto a 04 de Dezembro de 2012) http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=365 (visto a 04 de Dezembro de 2012)

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