Introduccin a las membranas biolgicas

Ncleo RE rugoso

Sntesis Protenas Vescula de transporte Lisosoma RE liso Lado CIS Complejo de Golgi Lado TRANS Endosoma Vescula secrecin

Endocitosis

Exocitosis (protenas, mensajeros qumicos)

Funciones Membranas Biolgicas

Compartimentacin celular Mantenimiento composicin especfica Flujo energtico celular Reconocimiento celular Transduccin de seales Movilidad celular

La correcta funcionalidad de las mbs depende de la funcin coordinada del componente lipdico y proteco

Introduccin terica

Metodologa y Experimentacin Bioqumicas IV (Curso 2004/2005)

Excitabilidad celular y compartimentacin

Potencial de Membrana -50/-70 mV

Citosol [K+] = 140 mM [Na+]= 12 mM Espacio extracelular: [K+] = 4 mM [Na+]= 145 mM

Cadena respiratoria de transporte electrnico mitocondrial

Espacio intermb

NAD+ NADH + H+
fumarato succinato

H2O O2 + 2 H+

Modelos de membrana
Mdelo de mosaico fluido, (Singer & Nicholson, 1972)
Oligosacrido de glicoprot Glicolpido

Zona hidrofbica Cabezas polares de PLs Prot perifrica Ch Prot integral (1TM) Prot perifrica unin covalentemente

Protenas integrales (nTM)

Protenas de membrana monotpicas y politpicas

Ch

PLs

SFLs

Estructura general de los lipidos de mb Movilidad de los lpidos de mb

Movimiento translocacin, flip-flop

Movimiento de difusin lateral

Flipasas, facilitan la translocacin Son movimientos lentos (poco probable)

Asimetra de membrana
Composicin % total en mb

% de distribucin en mb plasmtica
Monocapa interna Monocapa externa

PE PC SM PS PI PI 4-P PI 4,5-bP PA

100

100

Mb plasmtica

Existe adems distribucin asimtrica composicin lipdica en mbs celulares Ch, % en mbs orgnulos CL, en mb mitoc int PIs, imp en funcin pero minoritarios

Mb Mitocondrial interna Mb Mitocondrial externa Mb lisosomal Mb nuclear Mb RE rugoso Mb RE liso Mb Golgi 0 100

Sistemas enzimticos implicados en el mantenimiento de asimetra de membrana SM, PC

PS, PE

Aminofosfolpido tranlocasa

Flipasa

Scramblasa

Ca2+

Las MBs Biolgicas NO son uniformes:

Debido a que es energeticamente desfavorable que se expongan dominios hidrofbicos de las protenas a un entorno polar, los lpidos de membrana se adaptan localmente al espesor de estas zonas de interaccin Lipido-Protena

Existen dominios de membrana. Esta segregacin puede venir condicionada por la composicin lipdica y tambin por protenas de mb. Ej. Muestra los dominios en mb modelo formada por dilaurilPC (estado fluido, desordenado; en verde) y dipalmitoil PC (estado gel ordenado; en rojo)

Rafts y Caveolas

Glicoesfingolpido Esfingomielina Colesterol Fosfolpidos Caveolina

Raft, dominio lipdico de mb rico en SM/Ch monocapa externa y Ch en monocapa interna Concentran protenas ancladas va GPI y protenas de sealizacin (GTPasas, PKs aciladas). La existencia de caveolina-1 define las caveolas

raft raft

caveola caveola

La monocapa externa de mb rica en SM y Ch, crea una barrera de permeabilidad pero permite difusin lateral

Constituyentes y aspectos estructurales

Los PL son molculas anfipticas:

Zona polar (hidroflica)

Zona apolar (hidrofbica) Fosfatidilcolina

Esfingomielina

Go < 0
PL, forma geomtrica cilindrica

Monocapa LisoPL

Bicapa
Micela Vescula lipdica (Liposoma)
Interior acuoso

PL

Lamelaridad:

Multilamelares (MLV) Oligolamelares (OLV) Unilamelares (ULV)

Tamao:

25 nm

2,5 m

pequeas (SUV) (dimetro <100 nm) grandes (LUV) (dimetro > 100 nm)

Estructura de Lpidos

AG saturado ej. Palmtico, C16:0

GliceroPL:

Cabeza polar

AG insaturado ej. Olico, C18:1 (9)

Grupo polar (X) puede ser: Colina PC Etanolamina PE Serina PS -O-CH2-CH2-N+(CH3)3 -O-CH2-CH2-NH3+ -O-CH2-CH-NH3+ C00Fosfatidil-DAG CL Inositol-4,5-bisP PI

# Como veremos durante la parte prctica de la asignatura esta estructura confiere a cada PL carga neta especfica a pH fisiolgico que influyen en su comportamiento.

Nomenclatura
LisoPL PL nombre genrico; especificar AG posicin 1 y 2 AG 18:n (nmero de atomos de C: nmero de insaturaciones) si existen varias estas ocurren normalmente cada 3C debido al mecanismo biosinttico

Estructura de los AG
Grupo carboxilo (polar)

Cadena aliftica (apolar)

Nomenclatura de los tomos de C de un AG

Conformacin ej. cis 9

Por el tipo de ruta biosinttica los AGs en general estn formados por nmero par de atomos de C. Estas insaturaciones pueden tener conformacin cis o trans

Mayor grado de insaturacin menor punto de fusin Mayor longitud mayor punto de fusin (Aceites vs grasas)

AG saturados

Mezcla de AG saturados e insaturados

# Prediccin estructural de una bicapa di(C18:1)PC. Se indica la probabilidad de encontrar los distintos elementos estructurales en la zona hidrofbica y acuosa.

Forma del Lpido

Ejemplo

Organizacin

Cono invertido

LisoPls, Detergentes Micela

Cilindro

PLs (sin gran repulsin grupos polares) PC, SM, PS, PI, PG, PA Bicapa

Cono

PLs (repulsin grupos polares) PA-Ca2+, PA y PS pH cido < 3-4 PE

Fase hexagonal inversa HII

Distintos tipos de estructuras anisotrpicas: A) fase hexagonal normal HI, fase lamelar L, fase hexagonal reversa HII Estas propiedades son claves en funcionamiento de mbs. La tendencia a formar un tipo de estructuras u otras ser esencial en procesos de fusin de mbs, transporte vesicular, endo- y exocitosis etc

Por ejemplo:

La transformacin de PA (forma ~ cono) en LPA (forma ~ cono invertido) por transferencia de AA (C20:4) catalizada por endofilina I (LPA aciltransferasa) PLA2 favorece la curvatura de membrana y el proceso de endocitosis en vesiculas revestidas de clatrina.

LPA

AA-CoA

PA

cono invertido

cono

Interviene de forma activa tambin el PtdIns (4,5) P2 que atrae las protena necesarias para el proceso y posteriormente es desfosforilado a PtdIns-4P

Factor desencadenante

Procesos de fusin de membranas

Agregacin

Semifusin

Fusin

Ensayos de mezcla de lpidos y contenidos acuosos

Estructura general de esfingolpido

Descubiertos por J. Thudichum sXIX, lpidos enigmticos sphinx

Esfingosina

AG
Enlace amida

Ceramida Esfingomielina Fosfocolina

Glucosilcerebrosido

Glucosa

Lactosilceramida

Oligosacrido (di, tri o tetra-)

Gangliosido

Oligosacrido complejo

Protocolo experimental para obtencin de liposomas:

Formacin de liposomas por extrusin

No se emplean disolventes orgnicos Se obtiene una poblacin homognea de vesculas Tamao controlado Aplicable a una gran variedad de sistemas lipdicos Temperatura controlada Altas eficacias de encapsulacin

extruder

La composicin lipdica afecta a las propiedades fsicas de las mb: Longitud y grado de insaturacin de AG Caractersticas cabezas polares: impedimentos estricos, carga Composicin en Ch Composicin en SFL

Temperatura de transicin de fase

Gel
Fase Gel Altamente ordenada, compacta

Cristal Lquido
Fase Cristal-Lquido Fase menor grado de orden, ms fluida, movimientos moleculares, ms desordenado

Estudios de calorimetra

# Efecto del Ch en la transicin de fase de bicapas de DPPC

# Efecto de la longitud de los grupos acilo: L, lauril;M, miristoil; P, palmitoil; S, estearoil; A, araquidonoil

Ensayos clsicos de interaccin en liposomas

1- Agregacin de vesculas lipdicas: - Medidas de turbidez (Absorcin aparente) - Medidas de Dispersin de luz (light scattering) 2- Mezcla de lpidos: - Medidas de transferencia de energa de resonancia 3- Liberacin de contenidos acuosos: - Carboxifluorescena, ANTS/DPX, etc....

Mezcla de lpidos (sistema NBD-PE/Rh-PE)

Donador: NBD-PE Aceptor: Rh-PE

Experimento tipo

IF
0.8

NBD-PE

NBD/Rh

0.4

0.0 480

520

560

600

640

nm

Mezcla de lpidos: otros sistemas

Octadecil-rodamina R-18 Sondas hidrofbicas Sonda fluorescente autoapagada, forma dimrica

Forma monomrica fluorescente Liberacin de contenidos acuosos: ANTS/DPX

ANTS (fluorescente)

Fusin
Apagamiento Colisional

DPX (apagador)

Sondas hidrosolubles

# Existen otros sistemas en los que se emplea una sonda dbilmente fluorescente (ej. Tb3+ ) que al encontrarse como consecuencia del proceso de fusin con otro agente (ej. DPA) se produce un aumento de la emisin de fluorescencia

2-Micelas y detergentes

Monocapa LisoPL Micela PL

LPL, detergentes:forma cnica

Micela

Vescula lipdica (Liposoma)

[monmero]

cmc

[micelas]

[Detergente]

Tipos de detergentes y sus aplicaciones Detergentes inicos

# Con cadena de alquilo y cabeza cargada. En general son fuertemente desnaturalizantes - Dodecilsulfato (SDS) Aninico - Hexadecil trimetilamonio Catinico # Zwiterinicos o con N-xido en cabeza polar (detergentes suaves) - CHAPS - sulfobetanas

Detergentes no inicos
- Serie Triton-X - Serie Lubrol

- Serie Brij
Brij 35

- Digitonina, interaccin con colesterol - Serie Tween - Dodecil-,D-maltsido - -D-octilglucsido

Digitonina

Derivados de sales biliares

- Colato (deoxicolato) sdico

Complejo protena:detergente
# La solubilidad del complejo depender del tipo de detergente y la relacin [protena]/[detergente] Criterios para la eleccin de detergentes: Efecto en la actividad/estructura de protena Capacidad de solubilizacin de protena CMC

Estructura toroidal en torno a la regin hidrofbica

Dependiendo del tipo de interaccin entre prots y mb se pueden separar de modo: Prots perifricas pH, fuerza inica, agentes quelantes o desnaturalizantes PLC (prots unidas covalentemente a GPI), esterasas (prots aciladas) Prots integrales utilizacin de detergentes

Los lpidos y la estructura de las protenas de mb # Mayor grado de conocimiento de la estructura de protena de mb si se consigue hacerlo en presencia de los lpidos con los que interaccionan # Dificultades metodolgicas en la purificacin de protenas de mb y en la resolucin estructural

Bacteriorrodopsina (1C3W.pdb): resolucin 1.55 18 cadenas de acilo; 4 esqueletos de glicerol 1 escualeno

Tipos de estructura 2 de protena de mb:

Protenas integrales de mb

- Hlices hidrofbicas

Nt

zona hidrofbica

residuos bsicos

Ct
Ej. Bacteriorrodopsina: 248 aa/monmero 7 hlices transmembrana oligomeriza formando trmeros

- Barril
Formado por 20 segmentos TMB entorno a un cilindro Estabilizado por fuerzas semejantes a hlice hidrofbica

Ej. Porina FhuA, canal Fe-ferrocromo de E. coli

Ejemplo de protena perifrica: Unin de Anexina V a mb

Ca
Cabeza polar Pls Grupos fosfato

2+

Perfiles de hidropata
Glicoforina
- Permite predecir estructura de prots de mb Basados en algoritmos que atribuyen a cada aa en funcin de su naturaleza un valor indicativo de su probabilidad de estar en entorno hidrofbico de Mb o en entorno polar - Importante valor parmetro calculado para aa adyacentes - Son necesarios ~7-20 aa para atravesar bicapa (ventana) Indice de hidropata

Hidrofbico

Hidroflico

N aa

Bacteriorrodopsina
Indice de hidropata

Hidrofbico

Hidroflico

N aa

A) Interaccin Lpido-Protena estudios in vitro

Introduccin biolgicas a las membranas 1- Preparacin de liposomas (MLV y LUV) y determinacin de sus caractersticas

Seminarios sobre trabajos de investigacin en el rea (alumnos)

2- Influencia parmetros fsicoqumicos en la interaccin L-P

3-

Modelos

Experimentales

de

Membrana

4-

Agregacin

fusin

de

vesculas

B) Interaccin L-P en el contexto celular

1- Regulacin de la localizacin subcelular Papel de los lpidos en sealizacin celular (mensajeros inter- e intracelulares) de Ras

2- Translocacin a dominios preferentes, influencia covalente de y procesos de modificacin por seales regulacin

extracelulares

3-

Prediccin de

anlisis

de

la de

estructura membrana Seminarios sobre trabajos de investigacin en el rea (alumnos)

protenas

4- Dominios de interaccin ProtenaLpido