Techniques de bactériologie

Stérilité
Milieu de culture
Techniques d’ensemencement
Microscopie

Les antibiotiques
Définition et état de la question
Contrôler l'évolution de la résistance bactérienne
Acquisition de gènes
Mutations ponctuelles
Caractéristiques des AB
Toxicité sélective
Champ d’efficacité
Effet bactéricide ou –statique
Critères de classification ?
Origine:
Nature chimique
Spectre d'activité
Modes d'action
Cibles des antibiotiques
Interférence avec la biosynthèse de la paroi
Destruction de la membrane cellulaire
Biosynthèse des acides nucléiques
Traduction des acides nucléiques
Antagonisme métabolique
La résistance bactérienne
Peptides antimicrobiens: les antibiotiques du futur?
 Techniques de bactériologie

Stérilité : bec Bunzen, sources électriques, hôte à flux laminaires

matériel stérile (autoclave ou four)
tubes plastiques à usage unique
stérilisation alcool + flamme

Milieu de culture liquides ou solides (agar = solidifiant)

Croissance et maintien des micro-organismes en laboratoire

--> composition précise dépend de l’espèce à cultiver (besoins
nutritifs variables)
- aliments essentiels carbonés et azotés
- éléments minéraux : phosphore, soufre, magnésium, fer....
-facteurs de croissance (aa, purines+pyrimidines,vitamines)

milieux complexes (ou riches) : composition chimique inconnue

(croissance de la plupart des micro-organismes)
peptones (hydrolysats de protéines à partir digestion viande,
caséine, soja, gélatine....) = source C et énergie
ex bouillon nutritif, bouillon au soja

milieux synthétiques (ou minimums)
composés chimiques purs (phosphate, azote, soufre....) en
solution dans l’eau
Conditions d'incubation
Incubateurs thermostatés (étuves)
Agitateurs thermostatés ou non
Techniques d’ensemencement
Microscopie

Optique Electronique à
transmission
 Les antibiotiques

Définition complète (du grec anti, contre et bios, la vie)

Tout composé chimique, élaboré par un μorganisme ou produit par
synthèse, dont l'activité thérapeutique se manifeste à très faible dose
d'une manière spécifique, par l'inhibition de certains processus vitaux,
à l'égard des μorganismes sensibles
ne tuent donc pas les virus! (antiviraux)
antimicrobiens, antibactériens, antifongiques

antiseptiques: substance -Et-OH- appliquée sur tissus vivants et qui

prévient ou inhibe la croissance de μorganismes
désinfectant: substance -javel, ammoniaque- appliquée sur surfaces
pour détruire ou inhiber les μorganismes et les virus
Jusqu'à la découverte de la pénicilline en 1928 par A. Fleming, les
maladies infectieuses ont tué des millions de personnes dans le monde
(30 M lors épidémie de grippe 1ère guerre mondiale)
Cette découverte ayant été suivie par la découverte et le
développement d'autres AB, les scientifiques, les officiels de la Santé
Publique et le public pensaient que "ces balles magiques" (magic
bullets) protégeraient des maladies infectieuses......

Pénicilline

production en masse dans les 40's, tous les Staphylococcus aureus
(abcès, bronchites, et pneumonie) étaient sensibles, aujourd'hui, 90% des
souches sont résistantes!

souches multirésistantes de Mycobacterium tuberculosis

Streptococcus pneumoniae (pneumonie, méningite) efficacement
traités jusqu'à apparition souches résistantes dans les 70's en Afrique
du Sud, puis début 80's en Europe et milieu 80's aux USA
Vancomycine

AB utilisé en dernier lieu contre S. aureus mortels
1ère souche résistante en 1997 (Japon) puis aux USA

résistance des Entérocoques  20 X en 4 ans (1989-93)

40's: 1ère génération pénicillines contre S. aureus

50's: utilisation de méthicilline
80's: majorité MRSA (méthicilline resistant S. aureus) vancomycine
fin 90's: combinaison quiupristin/dalfopristin contre VRSA
2002: UK isolement d'un S. aureus insensible aux AB!

Dernière décennie, résistance aux AB s'est accélérée, alors que le

lancement de nouveaux AB décroissait rapidement

Les plus vulnérables à ces souches résistantes.....

immunodéprimés
Les dérives
- prescription inadéquate (maladies virales) ou excessive (1997: 10000
tonnes en Europe)
- utilisation excessive par les éleveurs (volaille, bétail, porc, poisson)
- auto-médicamentation

Petite histoire:
AB tuent aussi la microflore de la peau et des intestins ce qui nous
rend plus susceptibles aux infections par des pathogènes
En ne continuant pas la prescription (37% des patients le font dès qu'il
y a amélioration, et 25% en vue de réutiliser l'AB plus tard!), le
pathogène n'est pas tué, mais en plus au contact de la molécule
apprend à la contourner!

Contrôler l'évolution de la résistance bactérienne

--> comprendre la sélection, multiplication et dissémination des
bactéries résistantes --> 2 mécanismes

Acquisition de gènes codant pour les protéines conférant une
résistance accrue à 1 ou plusieurs familles d'antibiotiques
- liée au pouvoir adaptatif et ancestraux du monde bactérien:
transmission verticale (descendance) comme horizontale!
- origine: bactéries qui produisent ces AB (survivre à leur propre
production!)
 transfert de gènes de façon naturelle dans le tube digestif de l'hôte
transfert ancien, gènes restent silencieux jusqu'à ce que la pression
de sélection soit trop importante

Mutations ponctuelles affectant la conformation de la cible

de l'AB -->  sensibilité (10-20% des cas-taux mutation 10-7-10-8)
- transmission verticale (stable)
- origine: sélection au sein des foyers infectieux, lors du
traitement
- spécifique: contre 1 AB ou 1 famille d'AB

Que faire?

améliorer le bon usage et diminuer le mauvais (spots publicitaires,
information-éducation des médecins comme des patients)

prévenir la sélection des bactéries résistantes par antibiothérapie
alliant plusieurs AB

utilisation de molécules ou de modalités d'administration qui
sélectionnent le moins les mutants

proscrire l'utilisation d'AB pour les animaux produisant de la viande

prévention de la transmission inter-individus
enfants gardés par leurs parents lors d'infections respiratoires
traitées par AB, hygiène des crèches
hôpital: mesures d'isolements et hygiène
 Caractéristiques des AB

Toxicité sélective : tuer ou inhiber le germe pathogène en portant

le moins préjudice à l’hôte
--> indice thérapeutique = dose thérapeutique / dose toxique
ex pénicilline qui inhibe les enzymes responsables de la synthèse du
peptidoglycane bactérien a peu d’effets sur cellules hôtes car elles ne
possèdent pas de peptidoglycane
= indice thérapeutique élevé

Champ d’efficacité : spectre étroit (limité à une variété de

μorganismes) ou large (nombreux types d’agents pathogènes
différents)
ex sulfamides sont efficaces contre plus d’un groupe (bactéries et
certains protozoaires)

Effet bactéricide (mort de l’organisme cible) ou –statique

(inhibition réversible de la croissance)
CMI (concentration minimale inhibitrice) : concentration la plus
faible d’un antibiotique capable d’empêcher le développement d’un
μorganisme particulier
CML ou CMB (concentration minimale létale ou bactéricide) :
concentration la plus faible capable de tuer le μorganisme
 Pour qu'un antibiotique soit actif, il faut :

qu'il pénètre
au niveau du foyer infectieux
Diffusion AB non égale dans tous les tissus de l'organisme: assez bien
dans les poumons, limité dans le LCR -on retrouve en moyenne le 1/10° des
taux sanguins-
dans la bactérie
Paroi des Gram + est relativement perméable à la plupart des AB,
celle des Gram - est généralement moins perméable à cause de la
membrane externe.
Traversée membrane cytoplasmique par simple diffusion passive ou
en empruntant système de transport bactérien consommant de l'énergie

qu'il ne soit ni modifié, ni détruit (cf résistance bactérienne)

qu'il se fixe à une cible

 Critères de classification ?

Origine:"élaboré par un organisme vivant ou produit par synthèse"
A l'heure actuelle, il s'agira souvent de molécules, le plus souvent
obtenues par synthèse.

Nature chimique:
Très variable, souvent une structure de base comme le cycle ß-lactame
(famille des ß-lactamines) sur laquelle il y a hémisynthèse

Macrolides
Phénicolés

Donne souvent, le nom à la famille

Aminosides

Tétracyclines

Spectre d'activité : Liste des espèces sur lesquelles les
antibiotiques sont actifs (spectre étroit ou large).

Modes d'action --> cibles

 Cibles des antibiotiques

Interférence avec la biosynthèse de la paroi

Inhibition des enzymes de transpeptidation impliquées dans le
pontage des chaînes polysaccharidiques du peptidoglycane et
activation des enzymes lytiques de la paroi ex pénicilline,
ampicilline...
NB + efficace sur Gram+

Interfère avec l’action du transporteur lipidique qui transfère les

précurseurs du peptidoglycane ex bacitracine

Destruction de la membrane cellulaire

Polymyxine B se fixe à la membrane interne et en perturbant sa
structure agit sur sa perméabilité
!
Biosynthèse des acides nucléiques
Réplication Quinolones : inhibition ADN gyrase
Transcription Rifanpine : inhibe l’ARN polymérase-ADN
dépendante

Traduction des acides nucléiques

Tétracyclines : se fixe à la sous-unité 30S du ribosome et
interfère avec la liaison de l’aminoacyl-ARNt
Chloramphénicol : se fixe à la sous-unité 50S et empêche la
formation de liaison peptidique

Antagonisme métabolique
Sulfamides : inhibent la synthèse de l’acide folique (analogues
structuraux d’un précurseur)
 La résistance bactérienne

Empêcher la pénétration de l’antibiotique (diminution perméabilité

membranaire et pompes-efflux)

Inactiver l’antimicrobien par modification chimique (hydrolyse du
noyau
-lactame par
-lactamase) ou addition de groupes chimiques
(acétylation du chloramphénicol)

Modification de l’organite ou de l’enzyme cible qui les rend
insensibles à cet agent (affinité des ribosomes pour le
chloramphénicol peut être réduite par modification de l’ARNr 23S sur
lequel il se fixe)

Utilisation d’une voie alternative (résistance aux sulfamides -->
plutôt que de le synthétiser, utilisation d’acide folique de
l’environnement)

Contre les bactéries qui y sont sensibles les

antibiotiques restent aujourd'hui des médicaments
miracles!
 Les antibiotiques du futur?

150 AB commercialisés, mais ne correspondent qu'à une 10aine de

familles , et les nouvelles molécules en cours d'homologation sont
souvent des variantes de composés connus
Priorité= développer des familles d'AB vraiment innovantes
Spectre large? Spécifique? Combinaison?!

Comparaison de génômes bactériens

pathogènes/non pathogènes, bactéries/eucaryotes supérieurs

Cibles à haute probabilité

transglycosylase lors synthèse PG, synthèse protéique (résolution
structure ribosome)

Peptides antimicrobiens

composants essentiels du système de défense immunitaire inné, du
monde vivant, animal et végétal

1er peptide identifié en 1980 chez un papillon de nuit, depuis près de
400 autres ont été découverts, dont la moitié chez les insectes

large spectre d'activité (bactéries + champignons)

Mort des μorganismes en désorganisant ou en perforant leur
membrane cytoplasmique (processus rapide, risque faible de voir
apparaître résistants)

Plusieurs candidats-médicaments sont en phase de

développement thérapeutique