COMPARAO IN VITRO DA REATIVIDADE DE DIFERENTES

BIOCERMICAS NA FORMA DE PS E GRNULOS

Silva, S. N.
1
e Pereira, M. M.
2


1
Departamento de Engenharia Materiais, Centro Federal de Educao Tecnolgica de Minas
Gerais, Belo Horizonte (MG), Brasil

2
Departamento de Engenharia Metalrgica e de Materiais, Universidade Federal de Minas
Gerais, Belo Horizonte (MG), Brasil

e-mail: sidneynicodemos@yahoo.com.br

Resumo. A reatividade superficial uma caracterstica importantssima das cermicas bioativas. Durante a
implantao, ocorrem fenmenos complexos na superfcie dos biomateriais que acarretam alteraes nas
caractersticas da interface em formao material-tecido, e/ou portanto no tipo de tecidos neoformado. Uma
abordagem fsico-qumica para entender os mecanismos bsicos desta interao enfoca os vrios fenmenos
observados in vitro em fluidos contendo clulas e partculas de biomateriais. A literatura vem relatando uma
sequncia de diferentes fenmenos in vivo concatenados ao tipo de reatividade superfcial esperada para as classes
de biomaterial, tais como: adsoro proteica, dissoluo, precipitao e troca de on dos componentes inorgnicos,
normalmente seguida por adsoro e incorporao de outras biomacromolculas na reparao da matriz
extracelular. Neste estudo clulas da linhagem continua de macrfagos humanos (THP-1) foram postas em contato
com grnulos e ps de diversas biocermicas e polimero: hidroxiapatita, fosfato de clcio bifsico (BCP), biovidro,
titnia e PMMA, in vitro, com o objetivo de avaliar a interao ou locomoo (quimiotaxia) das clulas. No estudo
da quimiotaxia e reaes das clulas, um modelo de movimentao clula/grnulos baseado nas observaes
desses vrios materiais pde ser averiguado. Fundamentado nos resultados experimentais (quadriplicatas) pode-se
extrair explicaes que discriminam os mecanismos fundamentais envolvidos no movimento e reatividade das
clulas/biocermicas baseados em postulados teoricos envolvendo campos eltricos, meios viscoelsticos e
funes Lagrangeanas para um sistema de partculas. A premissa (condies de contorno) que as clulas em
cultura aps atingirem o repouso, no meio de cultivo, possuem um carregamento eletrosttico positivo na parte
externa da sua membrana citoplasmtica e que, as partculas de alguns destes biomateriais no pH = 7.35 (do meio
de cultura) tm um potencial de superfcie negativo (potencial zeta das partculas neste pH). Assim a partir
de medies cuidadosas experimentais e dados de ngulo de contato foi possvel a deduo de equaes
matemticas relacionada a interao clula-partcula em funo das cargas superficiais e foras de atrao
eletrosttica de curta distncia resultante; Conclui-se que estas foras so inversamente proporcionais distncia,
e esto perfeitamente em consonncia com a resposta biolgica ou classificaes distintas dos biomateriais aqui
estudados.
Palavras-chave: Biocermicas, resposta celular, caracterizao biolgica




1. INTRODUO

A reatividade superficial uma caracterstica comum das cermicas bioativas. Durante a
implantao, ocorrem reaes na interface material-tecido que acarretam algumas alteraes nas
caractersticas da superfcie do material do implante ou mesmo nos tecidos na interface (Hench,
1998; Ducheyne & Qiu, 1999). Os materiais cermicos foram utilizados pela primeira vez como
biomateriais a cerca de 40 anos. Inicialmente a ateno era voltada para o desenvolvimento de
materiais cermicos que provocassem uma mnima ou nenhuma reao do tecido, caractersticas
tpicas destes materiais em meios agressivos. Mas com o decorrer do tempo e o aumento do
conhecimento na rea dos materiais cermicos gerou proposta conceitualmente oposta: as
biocermicas deveriam provocar reaes de formao de tecido e, se possvel, com a formao
de uma ligao ntima entre a cermica e os tecidos. Essas mudanas superficiais contribuem
para a habilidade de ligao das cermicas bioativas e o seu efeito pode ser observado,
sobretudo, na melhoria da formao do tecido sseo de ligao. A busca de materiais que
aumentem a proliferao e a atividade osteognica tem importante aplicao teraputica na
regenerao ssea e/ou na reconstruo e restaurao do esqueleto e articulaes. Este fato tem
gerado reflexos no desenvolvimento de um grande nmero de biomateriais para o tratamento de
defeitos sseos, incluindo cermicas de fosfato de clcio (Oreffo et al., 1998; Daculsi, 1998;
Ishikawa et al., 2002; Higashi et al., 1998; Yamada et al., 1997). Para entender os mecanismos
que levam ligao material/osso, precisa-se antes avaliar os fenmenos atmico e molecular
que acontecem na superfcie do material e posteriormente os efeitos pertinentes destes sobre as
reaes das clulas e dos tecidos. Um progresso considervel foi realizado no entendimento dos
mecanismos bsicos da formao das interfaces que unem os materiais bioativos/ossos e tambm
dos efeitos destes materiais sobre a neoformao ssea (Kokubo et al., 1990; El-Ghannam et al.,
1997; El-Ghannam et al., 1999; Ricci et al., 1992; Gauthier et al., 1999; Hyakuna et al., 1989;
Binderman & Fin, 1990; Anderson, 1998; Benahmed et al., 1996). Este progresso foi o resultado
principalmente de duas abordagens. Uma abordagem enfocando o estudo da interface osso-
biomaterial e seu desenvolvimento in vivo e a outra abordagem usando imerses in vitro em
fluidos fisiolgicos simulados ou em meio contendo clulas. Estas anlises revelaram que uma
seqncia de reaes acontece nas superfcies do material implante, tais como: dissoluo,
precipitao e troca de on dos componentes inorgnicos, normalmente seguida por adsoro e
incorporao de protenas e molculas biolgicas (Ducheyne & Qiu, 1999; El-Ghannam et al.,
1999). Vem sendo reportado na literatura que a presena de biocermicas em contato com
tecidos in vivo talvez pudesse conduzir formao de uma camada interfacial que contm
macrfagos e clulas gigantes da reao ao corpo-estranho (Hyakuna et al., 1989; Binderman &
Fin, 1990; Anderson, 1998; Benahmed et al., 1996). Em tais casos, foi mostrado que os
macrfagos representam de 60-80% da populao de clulas locais. Em funo disso, os
macrfagos so apontados como uma das clulas chaves responsveis pelos eventos associados a
reabsoro por ostelise, conforme esquema abaixo, Figura 1.

Figura 1. Linhagem clulas sseas.

Neste trabalho, foi investigado o efeito do BCP sintetizado principalmente sobre as funes de
macrfagos humanos. Clulas da linhagem continua de macrfagos denominadas THP-1 foram
postas em contato com grnulos de BCP in vitro, com o objetivo de avaliar a interao e
secreo de fatores solveis, sendo tambm a avaliada locomoo (ou quimiotaxia) das clulas.


2 MATERIAIS E MTODOS

2.1. Materiais. Foram utilizados vrios tipos diferentes de clulas, buscando avaliar a
interao dos biomateriais com as clulas e tambm observar as linhagens que melhor se
adaptavam as condies do estudo. Foram utilizadas duas linhagens de clulas mononucleares
primrias (uma de camundongo e uma humana) e mais outras duas linhagens imortalizadas.
Entre as linhagens foram usadas uma linhagem contnua e aderente de moncitos com
morfologia semelhante aos macrfagos de camundongo J774 (RJCB -Banco de clulas, Rio de
Janeiro) de Janeiro) e outra cultura em suspenso de macrfagos humanos THP-1 (Rockville,
Maryland, E.U.A.). Elas foram adquiridas objetivando o estudo do carter quimiotxico,
toxicolgico, metablico e interativo do BCP. Num primeiro grupo de experimento, foram feitas
comparaes entre o comportamento das clulas em um meio de cultura com grnulos do BCP,
tendo como referncia vrios fosfatos de clcio na forma de partculas e grnulos: uma
hidroxiapatita pura (Calcitek/USA), o xido de titnio ou titnia (Merck), um outro BCP
comercial HAP-91 com 70% HA e 30% |-TCP (JHS/Brasil), o fosfato de clcio amorfo
produzido durante a sntese (grnulos sem tratamento trmico ACP como sintetizado) e ainda
outros materiais tidos como biotolerveis ou bioinertes como: a alumina (Merck) e
polimetilmetacrilato (METCO). O objetivo deste trabalho foi estudar provveis indcios
toxicolgicos e fenmenos diversos da interao local das clulas com cada um desses materiais
cermicos e polimrico, sobretudo a fagocitose no nvel microscpico.
2.2 Caracterizao dos Grnulos. Os grnulos dos materiais foram identificados quanto
composio de fase atravs de anlise de difrao de raio-x (XRD). Amostras foram analisadas
por um difratmetro de Philips com tubo de Cu operado a 40 kW e 20 mA e a uma velocidade
varredura de 0.060/sec. Para os materiais polifsicos - teores de 2 fase superior a 5 % (BCP,
HAP-91 e ACP)- foram calculadas as porcentagens das fases cristalinas baseadas nas somas das
reas abaixo das curvas para cada fase. A morfologia dos grnulos BCP foi estudada com um
microscpio eletrnico de varredura (MEV) JEOL 6300, operado a 15 kV. As imagens do MEV
revelaram que os grnulos de BCP, TiO
2
, ACP, BG60S (vidro bioativo com 60% de slica) e
HAP-91 (BCP comercial) eram aglomerados de partculas muito finas mais os cristais maiores.
No entanto, a faixa dos tamanhos dos grnulos para as experincias in vitro foi fixada atravs do
peneiramento do material e sendo sempre utilizada a frao inferior a 100 m. A distribuio de
tamanho dos grnulos foi medida usando o mtodo de difrao de laser (analisador de tamanho
de partcula CILAS 1064). Em todos os experimentos biolgicos os grnulos de BCP e tambm
dos outros materiais utilizados foram previamente esterilizados com xido de etileno.
2.3 Cultura de Macrfagos. Neste experimento foram realizados estudos com linhagens
primrias e imortalizadas (ou contnuas) de macrfagos num nmero de aproximadamente 50:1
clulas para cada partcula (a contagem tanto das clulas quanto dos ps foram realizadas com o
uso de uma cmara de Neubauer). Estas clulas foram cultivadas em garrafas pequenas de 5 mL
de RPMI 1640 contendo em geral 5 ou 10% (v/v) de soro e suplementadas com antibiticos. As
clulas foram mantidas em estufas a 37
0
C com uma atmosfera mida de 95% de ar e 5% CO
2
.
Os experimentos com as clulas THP-1 foram realizados entre segunda e sexta passagens do
replique. A manuteno das clulas THP-l foi feita com 5% de FBS (soro fetal bovino). As
imagens foram adquiridas atravs de microscopia de luz com contraste de fase, microscopia de
fluorescncia e microscopia eletrnica de varredura (MEV), em tempos de observao que
variaram at 45 dias de cultura. Foram plaqueadas uma densidade 1x10
4
a 1x10
5
clulas 1x10
5

clulas em placas de 24 wells costar

de cultura, sendo incubadas com 0,5 ml de RPMI 1640

contendo de 5% (v/v) soro, e completando a soluo com antibiticos. A cultura de clulas
mantida em meio de cultura contendo os vrios materiais foi observada atravs de microscopia
de campo claro e/ou usando o modo de contraste de fase. O tipo de imagem adquirida est
indicado nas legendas das figuras. As clulas de macrfagos THP1 foram utilizadas porque estas
clulas em suspenso e permitiram investigao mais fcil de movimento e de reaes de clulas.

Adicionou-se o meio RPMI e SFB a 10% nos wells at completar a capacidade do poo. A
seguir distribuiu-se as clulas nas placas 24 wells, calculando-se a quantidade de clulas nas
propores 10
4
, 10
5
e 10
6
por ml para serem cultivadas nos wells. Finalmente, adicionaram-se os
biomateriais na proporo aproximada de 50 clulas por grnulos (ou partcula) de biomaterial,
em seguida as placas foram identificadas, datadas e levadas para a estufa de C0
2
. Nestes estudos
com as clulas foram avaliadas a proliferao e morfologia das clulas, buscando investigar a
interao clulas/biomateriais. O objetivo deste experimento foi fazer comparaes entre o
comportamento das clulas em um meio de cultura com grnulos do BCP e com vrios ps
biocermicos na forma de partculas e grnulos estudando a interao quanto mais prximo
possvel (o experimento permite) das condies de contorno que o biomaterial teria no meio
fisiolgico.
2.4 Anlise de Energia Dispersiva de Raios-X (EDXA). As culturas de clulas e biomateriais
que tinham sido incubadas por 48 horas foram colocadas em uma placa de titnio, em seguida
desidratadas em etanol (70-100%) e lentamente aquecidas a 60
0
C. As amostras foram analisadas
ento por microscopia eletrnica de varredura. Foram observadas partculas dentro das clulas
aderidas aos grnulos de alguns materiais, e tambm partculas secretadas pelas clulas. Estas
partculas secretadas foram analisadas por EDXA, usando-se anlises pontuais e uma voltagem
operacional do MEV de baixa de 15 kV.
2.5 Medida do Clcio (Ca
2+
) Citoslico. Para determinao do clcio intracelular as culturas de
clulas foram cultivadas em contato com os grnulos por aproximadamente 12 horas, e logo aps
adio de 1 M de Fluo-3/AM (indicador de Ca
2+
) as clulas foram novamente incubadas por
mais 20 min em uma incubadora de CO
2
a 37
0
C. As imagens de microscopia de transmisso e
fluorescncia foram adquiridas em um microscpio de imunofluorescncia usando filtros FITC,
no final dos experimentos.
2.6 Teste do MTT. Ao trmino das experincias, a viabilidade das clulas foi investigada pelo
teste de MTT aps incubao por cerca de 2 horas e observao com microscpio tico. A leitura
do MTT, ou seja, a reao de reduo do sal tetrazlico (3-[4,5-dimetiltiazol]-2,5-
difeniltetrazlio brometo) nos fornece uma medida quantitativa da viabilidade das clulas. Os
reagentes foram adquiridos da Sigma Chemical Company. O levantamento da viabilidade se d
atravs da leitura de densidade tica (DO) o ndice absorbncia no aparelho de ELISA
(Universal Microplate Reader, BioTek Instruments Inc.) com comprimento de onda de 595nm.
As experincias foram executadas com clulas entre a 3 e 5 passagens e todas as experincias
foram repetidas 5 vezes em triplicata.

3.3 RESULTADOS E DISCUSSO

3.3.1 ESTUDO IN VITRO DE GRNULOS EM CULTURA DE CLULAS
O estudo in vitro com vrios tipos de biomateriais demonstraram que ocorre uma srie de
fenmenos interativos entre as diferentes culturas de clulas e as partculas destes materiais. A
reatividade entre as clulas e os biomateriais uma caracterstica distinta para cada tipo de
material e pode ser classificada como: intensa, moderada e no reativo.. Neste estudo in vitro
com grnulos de biomateriais apesar terem sido utilizadas quatro culturas diferentes de clulas,
so apresentados resultados apenas das culturas imortalizadas de macrfagos devido ao seu
cultivo mais fcil e reprodutivo. Contudo, observou-se que os experimentos com as diferentes
culturas apresentavam similaridade nos resultados. A baixa migrao de clulas para a superfcie
da alumina e do polimetilmetacrilato (PMMA) confirma que nestes materiais a reao menos
intensa do que os compostos de fosfatos de clcio e tambm do que a titnia. Contudo, como
observado nas fotos a titnia, o vidro bioativo e os compostos de fosfatos de clcio bifsicos
(BCP e a HAP-91) so sem dvida os materiais que maior interao (ou reatividade)
apresentaram deste grupo de materiais investigados. Foram observadas aglutinaes de clulas
ao redor dos materiais mais nenhuma modificao importante foi observado nas culturas
comparando com as culturas controles.

Como esperado no caso do PMMA e da alumina utilizados como material controle negativo, no
foram observados mecanismos significativos de reatividade celular, ou seja, formao de grumo,
secreo etc. Pelo contrrio, foi observado para a alumina um distanciamento das clulas em
relao s partculas desses materiais. Esta observao refora a idia de que o mecanismo de
movimentao tenha sua origem na energia potencial eletrosttica do sistema de cargas das
superfcies, cuja discusso foi iniciada no captulo anterior. Em comparao ao controle, durante
o perodo avaliado, no foram observadas alteraes atpicas nas culturas (apoptose, viabilidade,
metabolismo etc), a no ser uma pequena modificao no tamanho das clulas (ou
histomorfologia). Tambm os nveis de movimentao e secrees variaram significativamente
para os vrios materiais estudados e sero discutidos a seguir. A solubilidade in vitro no caso dos
fosfatos de clcio bifsico depende da proporo entre |-TCP/HA, que eram muito semelhantes
para o BCP (com 20 e 80% |-TCP/HA, respectivamente) e a HAP-91 (com 30 e 70% |-
TCP/HA, respectivamente). O |-TCP apresenta uma dissoluo maior do que a HA facilitando a
liberao de ons e/ou de cristais. J o vidro bioativo (BG60S) apresenta normalmente uma
elevadssima taxa de dissoluo em gua, devido sua estrutura aberta (material amorfo). A
dissoluo dos demais materiais favorecida pelo ambiente produzido pelos macrfagos
humanos, tais como, por exemplo, a elevao do pH local atravs da fosfatase cida acelerando a
solubilizao dos grnulos. A proporo usada de 50 clulas por grnulo propiciou uma
observao dos estgios da interao com os materiais. O primeiro e mais importante estgio foi
a constatao que as clulas e os grnulos se movem concomitantemente um em direo ao outro
de forma relativamente linear. Observa-se que o movimento de aproximao das clulas parece
ser mais intenso, embora aparentemente os grnulos tambm se movem dentro do centro de
massa do sistema - clulas vizinhas e grnulos. Este movimento relativamente rpido e pde
ser monitorado em tempo real em quase todos os campos ao longo dos experimentos, afastando a
suposio de que o movimento observado fosse um evento aleatrio ou casustico.

Pode-se ver que o movimento das clulas ocorre j nos primeiros minutos depois da incubao, e
sua aglomerao ao redor de grnulos s foi observada aps 24 horas de incubao.
interessante chamar a ateno para o fato de que as clulas de BCP fixadas tambm podem atrair
um grnulo de BCP vizinho. Foram vistos estes movimentos seguidos pela formao de
aglomerados de clula-grnulos concorrentemente em vrios campos, o que nos permite concluir
que o fenmeno era no localizado e bem representativo. amplamente conhecido que o
potencial de repouso da membrana celular carregado positivamente. Por outro lado, tambm
conhecido que as partculas de fosfato de clcio tm um potencial negativo no pH fisiolgico
(Ducheyne et al., 1992). Por hiptese acredita-se que a atrao clula-grnulo pode envolver uma
interao do tipo eletrosttica. A natureza desta interao neste momento hipottica e ser
discutido no Captulo seguinte. Para isto sero conduzidas experincias usando partculas de
diferentes cargas superficiais e tamanhos nos permitindo entender a natureza e fatores que
afetam esta interao.































Figura 2. Sequncia de movimentao. Clulas THP-1 e BCP foram colocadas em contato na proporo de 50:1
clulas por grnulo. As fotos foram obtidas em microscpio tico de luz transmitida. Foram obtidas imagens em
vrios instantes aps a incubao das clulas-BCP, e tambm depois de uma incubao por 24 horas, em uma
incubadora de CO
2
. No painel A, as setas indicam os grnulos de BCP e as cabeas das setas apontam a clula THP-
1. Os painis so representativos de imagens vistas em vrios campos de 5 experincias diferentes executadas em
triplicata. O painel B a ilustra duas situaes nas quais movimento de clula-grnulo ocorreram, a barra indica a
ordem de grandeza do deslocamento, 10 m. No painel B so mostradas imagens em sequncia de uma clula
aderindo com grnulos de BCP.

Foi observado que a maioria das clulas de THP-1 que estavam aderidas aos grnulos de BCP
apresentavam uma fluorescncia mais elevada, como evidenciado pelas imagens de microscopia
de fluorescncia usando indicador fluorescente (fluo-3/AM) de clcio intracelular. Esta
concentrao mais elevada ([Ca
i
2+
]) livre pode ser comparada com as clulas adjacentes no
aderidas, Figura 3.


















(B)
5 min 10 min 0
min
_____
10 m
(A)


















Figura 3. Concentrao de clcio intracelular Ca
2+
em clula aderida. As clulas THP-1 foram incubadas durante a
noite com BCP e carregadas por 20 min com o indicador de Ca
2+
- fluo-3/AM. A figura do lado esquerdo mostra
clulas carregadas com o fluo-3/AM. A seta aponta uma regio da clula por onde ocorre a aderncia ao grnulo de
BCP, enquanto a cabea de seta indica o grnulo. A clula aderida apresenta uma fluorescncia mais acentuada e
indica um nvel de clcio livre intracellular bem elevado. A imagem, direita, de microscopia tica de luz
transmitida mostra a presena de outras clulas no campo ainda no aderidas ao grnulo. Os painis so
representativos de imagens vistas em vrios campos de 5 experincias diferentes executados em triplicata.

Os ensaios de viabilidade celular pelo ensaio de MTT mostraram que as clulas aderidas e com
altos nveis de [Ca
i
2+
] apresentavam-se viveis (dados mostrados no captulo 3), excluindo a
possibilidade de que o aumento de clcio seja devido a dano da membrana das clulas. Embora
os mecanismos exato do aumento de [Ca
i
2+
] nas clulas aderidas ainda precise ser melhor
investigado, acredita-se que perturbao (ou estmulo) mecnica devido interao clula-BCP
possa ter induzido a abertura de canais Ca
2+
em locais prximos ao contato do grnulo com a
membrana (esta hiptese ser investigada no captulo seguinte). bem conhecido que em muitos
tipos de clulas, como hepatcitos, astrocitos, e osteoblastos, quando sofrem excitao mecnica
ocorre a abertura de canais de Ca
2+
e conseqentemente uma induo levando ao aumento de
[Ca
i
2+
] intracelular (Gronowicz & McCarthy, 1996; Schlosser et al., 1996; Nebe et al.,. 1995;
Romanello et al., 2001; Stout et al., 2002). Alm disso, o clcio intracellular [Ca
i
2+
] aumentado
tem importncia em muitos processos celulares, sobretudo variando os nveis de secreo,
metabolismo, apoptose, e dentre outros. Um exemplo citolgico de estmulo que aumenta [Ca
i
2+
]
acontece quando micropipetas excitam a membrana das clulas. Esta excitao mecnica gera
uma elevao hipo-osmtica nas clulas estimulando a secreo de ATP aps diferentes
estmulos (Schlosser et al., 1996; Sabirov et al., 2001; Ferguson et al., 1997). Os experimentos,
veja Figura 2.5, mostram que o aumento de [Ca
i
2+
] favoreceu o processo de exocitoses. De fato,
o papel do Ca
2+
na regulao da exocitoses de macrfagos j foi demonstrado (Di Anke et al.,
2001), estudos verificaram que uma elevao de [Ca
i
2+
] aumenta o transporte de vesculas para
fora das clulas. Estes resultados colaboram nossos resultados, pois o cultivo de clulas THP-1
com o BCP evidenciaram a presena de partculas pequenas no citoplasma (Figura 2.5A). Parece
que estas partculas so secretadas pelas clulas e eventualmente se aglomeram ao redor delas
(Figura 2.5B). interessante observar que as partculas so de tamanho semelhante. Acredita-se
que as partculas que foram secretadas so oriundas do citosol, embora tambm foram
Fluo-3/AM Transmisso
_____
10 m
observadas aglomeraes de partculas aleatrias ao redor das clulas, Figura 2.5B. Foi tambm
observado que as partculas secretadas permitiram a unio s clulas adjacentes, Figura 2.5C.
Alm disso, anlise de EDXA das partculas intracelular e secretadas mostrou que a razo clcio
e fsforo (Ca/P) , respectivamente 1.530.06 e 1.640.05, uma estequiometria semelhante a
hidroxiapatita. O que sugere que as partculas secretadas sejam constitudas de uma apatita
carbonatada (hidroxiapatita deficiente em cerca de 10% em Ca) presente nos tecidos duros do
corpo humano. conhecido que partculas de tamanho maior que as fagocitveis estimulam os
macrfagos promovendo a produo de vrios tipos de citocinas. Sabe-se, que vrias citocinas
pro inflamatrias no estimulam a produo de xido ntrico (NO) (Oliveira et al., 1998;
Damoulis et al., 1994). No entanto, tambm descrito que algumas citocinas tais como IFN e
TNFo estimulam os macrfagos a produo de NO, a falta de alguns desses citocinas (presente
no meio fisiolgico ou no tecido sseo), nos sugerem que neste caso essa molcula (NO) faz o
importante papel como um mediador paracrino das clulas do osso (Van't Hof & Ralston, 2001;
Mancini et al., 2000). No entanto, concentraes alta de NO pode ter um efeito inibidor na
formao de osso (Van't Hof & Ralston, 2001). Foi investigado se o BCP estimula por induo a
secreo de NO atravs das clulas THP-1, para isto foi retirado o sobrenadante do meio de
cultivo (THP-1/BCP por 3 dias) e a seguir a presena de NO foi determinada pelo reagente de
Griess. Os resultados indicam que o BCP no induziu secreo de quantias mensurveis de NO
in vitro (dados mostrados no captulo 3 juntamente com outras biocermicas). Recentemente, foi
demonstrado que o NO participa nas funes regulatrias de macrfagos (Van't Hof & Ralston,
2001), osteoblasto ou osteoclastos (Mancini et al., 2000). H evidncia de que o NO inibe a
proliferao, secreo e induz apoptoses em muitos tipos celulares (Mancini et al., 2000). Ento,
a baixa concentrao de NO observado em nossos experimentos indica que o BCP no
promovem uma produo significante de NO, preservando, portanto as funes das clulas THP-
1 nas interaes com o BCP. A evoluo destes deslocamentos clulas/grnulos por um perodo
de 12 horas levou formao de aglomerados com vrias clulas ao redor dos grnulos de HAP-
91, HA CALCITEK e BCP. Observa-se a formao de clusters de clulas ao redor de partculas
e aglomerados da ordem de 100 m (BCP, HAP-91 e ACP). Estes aglomerados so o resultado
de vrias trajetrias e movimentos intercalados que, em geral, conduzem formao de
ajuntamentos em cachos ou grumos de materiais bioativos (BG60S, BCP, HA CALCITEK,
HAP-91 e ACP) com clulas ao seu redor.

Logo aps a adeso dos grnulos s superfcies das clulas ocorre o aparecimento de dois novos
fenmenos. Constatou-se com o uso de um indicador de clcio intracelular (Fluo-3/AM) que
uma parcela expressiva das clulas aderidas ao BCP, HAP-91, HA Calcitek e titnia
apresentaram um aumento dos nveis de clcio de livre ([Ca
i
2+
]) intracelular, quando comparadas
com as clulas vizinhas no-aderidas. Ao que tudo indica, o local de contato entre os grnulos e
as clulas sofre uma estimulao mecnica, o que de fato parece favorece a abertura de canais
Ca
i
2+
propiciando a endocitose de clcio inico oriundo da dissoluo dos grnulos ou do meio
extracelular, e portanto, a elevao do gradiente de Ca
i
2+
ao longo dos organelos no citosol.
Assim, um mecanismo fundamental de interao entre os materiais, ao que parece, fortemente
mediado pela atrao entre as superfcies do material e das clulas, possibilitando entender os
fenmenos primordiais que regem a interao local dos biomateriais com as clulas.

Um fenmeno simultneo tambm foi evidenciado em todos os campos de observao ao
microscpio: em um grande nmero de clulas aderidas ou no aderidas foram identificadas
alteraes morfolgicas significativas (quando se comparou o tamanho destas clulas com
clulas do experimento controle). Por amostragem foram avaliadas variaes de at 250% em
relao mdia de tamanho das clulas do grupo controle sem biomateriais. Observou-se que
essas clulas gigantes apresentavam tambm um aumento dos nveis de clcio livre ([Ca
i
2+
])
intracelular, quando comparadas com as clulas vizinhas. Em ambos os casos o fenmeno parece
estar associado forma ou mecanismo de absoro de Ca
2+
e caminho escolhido pelas clulas
para contrabalanar a presso osmtica de Ca do meio extracelular, em virtude da dissoluo dos
grnulos de biovidro, BCP, HAP-91, HA e o ACP, e, portanto como conseqncia do aumento
do gradiente de clcio inico Ca
2+
no micro ambiente local. Este aumento do volume das clulas
era esperado e uma parte desse evento pode ser explicado pela abordagem termodinmica.

O gradiente de concentrao de Ca
2+
e a difuso dos fluidos no microambiente intracelular induz
a formao de vesculas esfricas contendo partculas de um fosfato de clcio sintetizado
biologicamente, que apresenta uma razo Ca/P muito semelhante a hidroxiapatita, Tabela 1. As
clulas que apresentaram uma elevao dos nveis de Ca
2+
passam a produzir em seu interior (no
local prximo a endocitose) pequenas partculas (com cerca de 1 m de dimetro),
aparentemente confinadas por uma vescula, que a seguir se descolam no sentido oposto ao
gradiente de concentrao de Ca
2+
. Com o formato de anis alinhados estas partculas so
liberadas formando veios que se esparramam para fora das clulas. Os veios apresentam uma
forma peculiar, sempre com uma camada protetora de um material orgnico (ainda no
identificado), com as partculas ora emparelhadas, ora em forma de corrente. O veio j no meio
extracelular se distende diametralmente da regio da sua formao (ou seja, local prximo
adeso da clula com o grnulo) e chega a atingir relativamente grandes extenses.

Tabela 1. Analise de EDXA das Partculas para cada tipo de Biomaterial.
Medidas Ca/P
Partcula Extracelular
Ca/P
Partcula Intracelular
HAP-91 1,53 0,12 1,57 0,09
BCP 1,64 0,05 1,53 0,06
HA 1,61 0,08 1,49 0,04
BG60S 1,92 0,11 1,75 0,12
ACP 1,83 0,07 1,61 0,05

Os experimentos realizados at aqui nos mostram que o aumento de [Ca
i
2+
] favoreceu o processo
de exocitoses. O papel do Ca
2+
na regulao da exocitoses de macrfagos j foi verificado
tambm em outros estudos (Di Anke et al., 2001), e um aumento na concentrao de [Ca
i
2+
]
aumenta o transporte de vesculas secretoras para fora das clulas. Acredita-se que as partculas
secretadas sejam oriundas do citosol. Neste aspecto, embora sejam requeridos Ca
2+
para
exocitoses em macrfagos, o aumento do Ca
2+
intracelular no suficiente para o evento
exocittico pleno. No caso dos macrfagos, a exocitoses extremamente dependente da protena
G ativada (Di Anke et al., 2001). Ento, a ausncia de protena G ativada poderia ser a razo
temporal requerida para exocitoses completa das partculas. Cerca de 144 horas depois de
incubados os veios com as partculas secretadas se aglutinam formando uma estrutura tambm
em cachos. Observa-se que parte do material orgnico que protegia as partculas dissolvido e as
partculas passam a ter um grau de liberdade que permite se rearranjarem.

O tempo de dissoluo dos materiais bioinertes, bioativos ou biodegradveis estudos no foram
levantados com exatido. Contudo, observou-se que a hidroxipatita Calcitek, a titnia, a alumina
e o PMMA no se dissolveram, mesmo aps 45 dias em cultura. J com o BCP, a HAP-91 e o
ACP mostraram aps cerca de 45 dias de incubao em cultura de macrfagos uma completa
dissoluo tanto dos grnulos quanto das partculas secretadas pelas clulas. Durante as trocas do
meio de cultura eventualmente alguns grnulos desses materiais podem ter sido aspirados,
contudo a maior parte destes grnulos parecem que foram efetivamente fagocitados ou
solubilizados.

No estudo da quimiotaxia das clulas, um modelo de movimentao clula/grnulos baseado nas
observaes dos vrios materiais pode ser averiguado. As causas deste fenmeno podem ser
mltiplas e complexas. No entanto, baseado em duas premissas formadas de poucos elementos
muito simples, pode-se tentar extrair explicaes de fcil utilizao ou compreenso; que no
apresenta elevada complexidade ou dificuldade e, portanto, tentar tornar inteligvel este
fenmeno, sem discriminar todos os mecanismos envolvidos no movimento das clulas. A
primeira premissa que as clulas em repouso possuem um carregamento eletrosttico positivo
na parte externa da sua membrana. A segunda premissa que, as partculas de fosfato de clcio e
titnia no pH estudado (pH = 7.35 do meio de cultura) tm um potencial de superfcie negativo
(Barralet et al., 2002; Huang et al., 2003). Assim por deduo pode-se supor que em funo das
cargas superficiais foras de atrao eletrosttica de curta distncia so geradas e atuam ao longo
da linha que une ambos os centros de cargas. Estas foras so tambm inversamente
proporcionais distncia. Esta fora acarreta um movimento linear que, depois de
desencadeado, provoca uma nova configurao na interao eletrosttica (ou momento de dipolo
eltrico) entre os domnios de cargas opostas da superfcie das clulas e dos grnulos, veja a
Figura 17. Com a aproximao entre as superfcies ocorre um deslocamento relativo ou rearranjo
da distribuio das cargas positivas e negativas nas superfcies da clula e do BCP (sobretudo
nas molculas no polares que formaro ambas as superfcies) e novos dipolos induzidos. Por
sua vez estes dipolos ocasionam nova contra induo eletrosttica e, por conseguinte, a gerao
de momento quadrupolos ou tensores de ordem mais elevados. Este processo de reacomodao
das cargas nas superfcies influencia o movimento levando por fim formao lenta de
aglomeraes em cachos o que em termos de energia potencial do sistema representa o estado
real que mais apropriadamente minimiza a energia qumica superficial. Posteriormente, sero
discutidas evidncias que levam a este raciocnio hipottico-dedutivo. Como parte do
desenvolvimento deste modelo foram feitas algumas tentativas de se medir o potencial zeta do
BCP e da titnia. No entanto, os valores encontrados no foram reprodutveis para o BCP, sendo
apenas observado que em torno pH = 8,0 da suspenso (ou seja, prximo ao pH do RPMI com
BCP) o potencial foi sempre negativo. O valor encontrado tambm para a titnia indicava um
valor negativo no pH neutro do meio de cultura. Na Figura 4 mostrada a atrao de partculas
pequenas de titnia pelas clulas. Ao redor das clulas observa-se uma zona de vazio onde no
existem partculas.

Figura 4. Cultura de clulas com titnia na sequncia de tempos no intervalo de observao de 24 e 48 horas.

O potencial de uma carga pontual dado pela equao:
}
=
i
q A d E

c
Equao 1
Resolvendo a equao 3.1 para o campo eltrico temos:
2
.
4
1
r
q
E
c
o
c
tc
=
Equao 2
Tanto as clulas quanto as partculas da titnia (e tambm do BCP) geram no meio de cultura um
campo eltrico. A carga
c
q .
a carga da clula e
p
q
a carga das partculas de TiO
2
(que
podem ser estimadas pelo potencial zeta). Logo a fora eletrosttica entre as clulas e as
partculas dada por:
c p p
E q F . =
Equao 3
No meio viscoso a fora de atrito cintico :
x
dt
dx
f
a
k k = =
Equao 4
onde k a constante de viscosidade do meio. A fora resultante assim igual a:
x m f F F
a p R
= =
Equao 5
Agrupando as equaes 2 a 5 tem-se a equao do movimento:
0
4
2
= +
x
q q
x x m
c p
tc
k
Equao 6
A possvel resoluo numrica desta equao diferencial pode ser feita a partir das condies de
contorno mdia dos vazios ao redor das clulas e da massa reduzida clula/partcula, veja
Figuras 17 e 18. A posio inicial mdia igual a 30 m e a velocidade final das partculas
igual a zero na superfcie das clulas (raio mdio da clula - 10 m).
m x
m r x

10 0 ) 1 (
30 ) 0 (

=
=

Como a carga lquida conservada num sistema isolado pode-se prever que a fora eletrosttica
ser dada por:
2
1
4
.
r
q
q F
j
N
j
p p
tc

=
=
Equao 7
onde N o nmero de clulas. O trabalho realizado pelo campo eletrosttico (fora x distncia)
para que se mova uma clula ou partcula da posio inicial x para a posio final y
diretamente proporcional ao sinal e magnitude da carga superficial livre.

Os resultados das dosagens de xido ntrico das solues demonstram que o BCP apresentou
caractersticas muito semelhantes aos materiais tidos como bioativos. O grfico da Figura 5
mostra a produo de NO para os materiais aps o 3 dia de cultura.


Figura 5. Concentrao de NO no meio de cultura com os biomateriais.

A avaliao da viabilidade e/ou proliferao foi bastante semelhante entre os vrios materiais
dissolvidos. Na Figura 6, pode ser visto que as cultura expostas s solues com biomateriais
(HA, BCP, ACP, PMMA, titnia e alumina) - apresentam resultados com pequenas alteraes na
NO aps 72 Horas
0
20
40
60
80
100
Controle BG BCP ACP HAP-91 TiO2 PMMA Alumina
Biomateriais
[
N
O
]
,


m
M
Nmero de Amostra = 3
porcentagem relativa de viabilidade/proliferao em comparao com culturas de macrfagos
cultivados em meio de controle sem biomateriais. A linha zero (eixo da abscissa) indica o ponto
de igual viabilidade com o controle, ou seja, -5 significa 5% a menos de clulas viveis em
comparao com o controle. Estas pequenas alteraes na percentagem de reduo do MTT
(atividade enzimtica em comparao com aos valores achados para o controle) mostram existir
uma tendncia de equilbrio na viabilidade/proliferao nas culturas dos vrios materiais nos
tempos investigados em comparao com cultura de controle. No entanto, foi observado,
especialmente para o ACP e BG60S, uma recuperao (aumento) dos nveis de atividade celular
aps 60 horas. Em contraste, materiais como alumina e PMMA no apresentaram mudanas
significativas.

Figura 6. Viabilidade das culturas com biomateriais em comparao com o controle.

Como os nveis de dissoluo ou liberao de ons das superfcies das partculas ou grnulos
variam, as culturas expostas a estes biomateriais apresentam presena de tipos diversos de ons
(Ca, P, Si, Al, Ti, cido acrlico etc), o que possivelmente ajudaria entender as causas das
pequenas alteraes na viabilidade das clulas. Aps 60 horas, graas ao metabolismo das
clulas, foi observado um aumento na proliferao para todos os biomateriais. Estes resultados
demonstram a acomodao da cultura na presena das partculas dos biomateriais. Apesar da
existncia de alguma controvrsia, o mtodo de reduo do sal de tetrazlico MTT atravs de
reaes enzimticas celulares o teste mais amplamente utilizado para medio da
viabilidade/proliferao das clulas, e sobretudo um indicativo para a determinao da
toxicidade dos biomateriais em meios cultura. Como conseqncia deste estudo, um padro de
trs diferentes grupos ou variao na capacidade de interao dos materiais / clulas pde ser
assim definido:
- Grupo 1: hidroxiapatita CALCITEK e a titnia (quimiotaxia, adeso e baixo nvel de
secreo e dissoluo);
- Grupo 2: BG60S, BCP, HAP-91 e o ACP (quimiotaxia, adeso e alto nvel de secreo
e dissoluo);
- Grupo 3: alumina e do PMMA (baixssima quimiotaxia e quase nenhuma adeso ou
dissoluo).
Com respeito dissoluo dos biomateriais e proliferao celular, observou-se existir uma
interao de semelhana entre os 3 grupos citados acima. Por exemplo, o PMMA e a alumina
apresentaram uma baixa dissoluo e uma proliferao menor do que o controle. J o BG60S e
ACP apresentaram uma grande dissoluo e inicialmente uma tambm menor proliferao, mais
aps algumas horas a proliferao foi muito prxima cultura controle. Os eventos cannicos
relacionados com a bioatividade desencadeados pelos materiais so descritos na literatura na
seguinte ordem: dissoluo, precipitao de on na soluo, trocas inicas, interdifuso, soluo
mediando o efeito sobre a atividade celular, deposio sem integrao, deposio com
integrao, quimiotaxia, adeso celular e diferenciao/proliferao/secreo. No caso deste
estudo com culturas celulares, foram observados in vitro alguns destes mecanismos (ou eventos)
isoladamente. Como conseqncia da atividade de absoro (ou fagocitose), possivelmente
estimulada pela fosfatase cida secretada pelos macrfagos (clulas da mesma origem dos
-20
-15
-10
-5
0
5
10
10 20 30 40 50 60 70
Tempo (horas)
P
e
r
c
e
n
t
u
a
l

d
e

C

l
u
l
a
s

V
i

v
e
i
s
HA Calcitek
HAP-91
BCP
Titnia
ACP
BG60S
PMMA
Alumina
osteoclastos), observou-se uma elevada dissoluo dos materiais e, eventualmente, ocorrncia de
trocas inicas no meio de cultura. No entanto, a atividade dos macrfagos resultou
principalmente em outros trs eventos tambm observados neste estudo: a quimiotaxia, a adeso
e a secreo celular. A associao destes mecanismos resultam no desencadeamento de uma
cascata de interaes primordiais que possibilitam a bioatividade do material, ou seja, o
fenmeno da interao local dos biomateriais. No meio fisiolgico sabe-se que esta interao
bem mais complexa e que possivelmente esteja associada tambm com uma grande produo de
osteocalcina e citosinas (hormnios) que estimulariam os demais eventos no observados aqui
(Ducheyne, 1999). O estudo in vitro com cultura de clulas caracterizado por uma induo
incompleta, cujas concluses, no obstante parciais, dado a complexidade do meio fisiolgico,
podem se revelar universais e necessrias, pois se estabelecem por meio de estudos e
procedimentos sistemticos no microambiente da interao, e levam a algumas descobertas de
relaes coincidentes entre o que observado no nvel celular com o que realmente pode ocorrer
no meio fisiolgico quando da interao com um biomaterial. Alguns dos mecanismos
relacionados com interao local das clulas com o biomaterial foram, durante o perodo de
testes em cultura, investigados quantitativamente, atravs dos resultados de microscopias e
espectroscopia, buscando-se evidncias morfolgicas atpicas, tais como: nveis de absoro,
alteraes morfolgicas atpicas, secrees e outros indcios ou fenmenos que possam
caracterizar uma citotoxicidade, sobretudo comparando o BCP com os outros materiais. No
entanto, nenhuma indicao houve que revele quais anormalidades na resposta celular, ou
mesmo que elementos txicos so liberados durante a fagocitose ou dissoluo do BCP.

4 CONCLUSES

O BCP sintetizado e aqui analisado apresentou 80% hidroxiapatita (HA) e 20% fosfato de
triclcico (|-TCP). O BCP pode ser considerado uma substncia bioativa devido, aos fenmenos
de interao com as clulas apresentadas durante os testes in vitro e tambm por no apresentar
nestes testes nenhum indcio de toxidez pode ser classificada como uma substncia com baixa
toxicidade ou atxica. Os protocolos de pesquisa e desenvolvimento de biomateriais
recomendam nestes casos que sejam conduzidas novas investigaes utilizando para isto estudos
com animais.
O BCP em cultura de clulas demonstrou a habilidade de induzir a proliferao de clulas, assim
como os outros biomateriais testados.
Os biomateriais utilizados nos estudos com grnulos e partculas mostraram, segundo os
seguintes agrupamentos: bioinerte, bioativo e biorreabsorvvel; fenmenos gerais (ou
caractersticos) que se enquadram nas observaes j realizadas por outros grupos de pesquisa.
O ACP mostrou-se toxmico quando utilizado nos implantes esterilizados em autoclave, sendo
por isto no recomendado para os estudos posteriores com animais.
O passo seguinte na avaliao do BCP utilizar este material em ambiente de spray a plasma
para produo de recobrimentos. E a posterior caracterizao da adeso desses implantes junto
ao tecidos vivos (modelo animal).
As clulas aderidas ao BCP apresentaram uma alta concentrao de Ca2+ livre intracelular,
quando comparada com as clulas vizinhas no aderidas.
As partculas de fosfato de clcio secretadas formaram clusters com as clulas adjacentes. O
estudo desta cascata (ou seqncia) de eventos nos permitiram iniciar a abordagem dos
mecanismos celulares (in vitro) na interao clulas-BCP, contribuindo para a melhoria da
performance destes materiais bioativos.
A anlise de energia dispersiva de raios-X mostrou que as partculas secretadas apresentaram
uma relao de Ca/P de 1.64 0.05, semelhante a da HA.
Das observaes conduzidas neste trabalho possvel cogitar que as partculas secretadas criem
uma zona de transio que permite adeso de macrfago adicional, o que poderia no meio
fisiolgico eventualmente levar fixao do biomaterial.

AGRADECIMENTOS
Ao Centro Tecnolgico de Minas Gerais- CETEC/MG e ao Departamento de Bioqumica e
Imunologia da UFMG pela infraestrutura cedida. A Fapemig Fundao de Amparo a Pesquisa
de Minas Gerais e ao Centro Federal de Educao Tecnolgica de Minas Gerais- CEFET/MG
pelo apoio na pesquisa.

REFERNCIAS
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COMPARISON OF IN VITRO REACTIVITY OF POWDERS
BIOCERAMICS AND GRANULES

Silva, S. N.
1
e Pereira, M. M.
2

1
Departamento de Engenharia Materiais, Centro Federal de Educao Tecnolgica de Minas
Gerais, Belo Horizonte (MG), Brasil

2
Departamento de Engenharia Metalrgica e de Materiais, Universidade Federal de Minas
Gerais, Belo Horizonte (MG), Brasil

e-mail: sidneynicodemos@yahoo.com.br

Summary: The surface reactivity is an important characteristic of bioactive ceramics. During deployment, complex
phenomenon occurring on the surface of biomaterials which lead to alterations in the characteristics of the interface
material-tissue formation, and / or the type of fabrics thus formation. A physical-chemical approach to understand
the basic mechanisms of this interaction focuses on the various phenomena observed in vitro in cells and fluids
containing particles of biomaterials. The literature has been reporting a result of various phenomena concatenated in
vivo reactivity of the type superficial classes expected biomaterial, such as protein adsorption, dissolution,
precipitation and ion exchange of inorganic components, usually followed by adsorption and inclusion of other
biomacromolculas the repair of the extracellular matrix. In this study cell line continues from human macrophages
(THP-1) were put in contact with granules and powders of different polymer and bioceramics hydroxyapatite,
biphasic calcium phosphate (BCP), bioglass, titania and PMMA in vitro in order evaluating the interaction or
movement (chemotaxis) of cells. In the study of reactions and chemotaxis of cells, a type of movement cell / granule
based on observations of these various materials might be ascertained. Based on experimental results
(quadriplicatas) can extract explanations that discriminate the fundamental mechanisms involved in the movement
and reactivity of the cells / bioceramic based on theoretical assumptions involving electric fields, viscoelastic media
and functions for a Lagrangian particle system. Premise (boundary conditions) is that cells in culture after reaching
the rest, in the culture medium have a positive electrostatic charge on the outside of their cytoplasmic membrane and
the particles of some of these biomaterials with pH = 7.35 (the culture medium) have a negative surface potential
(zeta potential of particles in this pH). Thus from the experimental data and careful measurements of contact angle
was possible the deduction of mathematical equations related to cell-particle as a function of surface charges and
electrostatic forces of attraction resulting short distance; conclude that these forces are inversely proportional
distance, and are perfectly in line with the biological response or classification of different biomaterials studied here.

Keywords: Bioceramics, cellular, biological characterization