06.

Técnicas de DNA recombinante

 Restriction enzymes

-  Reconhecem sequencias especificas 4-6-8-10-12 pb

-  Designadas em relação a bactéria ondo foi isolada
-  Ao cortar o DNA podem gerar extremidades 3’ ou 5’
 Restriction enzymes

DNA molecules treated with REs giving 3’ or 5’ overhang can be put back again
 Restriction enzymes
DNA molecules treated with REs giving no overhang can also be put back again but a low frequency
Separação eletroforetica de grandes moléculas de DNA
“Pulse field eletrophoresis”
Separation of yeast chromosomes
Caraterísticas essenciais:

-  Capacidade de incorporara DNA exógeno

-  Capacidade de replicação autónoma
-  Locais únicos de corte por ER
-  Mecanismo de seleção (resistência antibiótico)
-  Fácil purificação
 Plasmideo pBR322
Seleção por resistência a antibióticos Amp ou Tet
Polylinker or Multiple Cloning Site (MCS)
Seleção por B-galactosidase
Blue-white plasmid selection

B-gal +

B-Gal -
Promotores T7 e T3 no polylinker
CsCl2 Plasmid purification
CsCl2 Plasmid purification
CsCl2 Plasmid purification
Electroporation
Electroporation

GFP
Phage DNA as vectors
Lambda phage life cycles

Lysogeny
Phage DNA replication and packaging
Lambda vectors - insertion
Lambda vectors - substitution
Cosmid library preparation
Cosmid vectors
Bacterial artificial chromosomes (BACs)
Yeast artificial chromosome vector (YACs)
Expression of recombinant proteins
T7 polymerase activation of plasmid transcription
His-tagged fusion proteins
Purification of HIS-tagged fusion proteins
DNA libraries
Biblioteca
Genomica
Cosmideo
Biblioteca Genomica BAC Digestão parcial

Sau3A 5’GATC3’
BamHI 5’GGATCC3’
Non-radioactive DNA labelling
Labelling DNA ends
Chromosome walking
cDNA libraries
Clonar mRNAs
Isolamento de mRNA utilizando
oligo dT e magnetic beads

mRNA - célula específica

- tecido específico
- estádio de desenvolvimento
- condição específica
Genomic e cDNA libraries
Ratreiro de uma biblioteca de expressão
Sequenciação do DNA

1.  Método químico – Maxam and Gilbert

2.  Método enzimático - Sangres

-  500-800 pb max
-  Sequencia 1 cadeia de cada vez
-  DNA cadeia simples
DNA sequencing gels
 Random  Shotgun  cloning  
Biblioteca  do  DNA  do  Bac   7  8  9  10  11  12    

DNA  de  um  Bac-­‐recombinante  

1  2  3  4  5  6  7  8    9  10  11  12    13  14  15  
1  2  3  4  5  6  7  8    9  10  11  12    13  14  15  
3  4  5  6  7  8  9  10  
1  2  3  4  5  6  7  8    9  10  11  12    13  14  15  
(n)  

Digestão  parcial  
10  11  12  13  14    

1  2  3  4  5  6  7  8  
7  8  9  10  11  12    
9  10  11  12  13  14  
10  11  12  13  14    
3  4  5  6  7  8  9  10  
5  6  7  8  9  10  11    

10  11  12  13  14    

Clones  individuais  

Clonagem  num    
plasmideo  em  E.coli  
Sequenciação  automáNca  DNA  

F  

Fragmento  

R  
Sequenciação  automáNca  DNA  
Sequenciação  automáNca  DNA  
Sequenciação  automáNca  DNA  

Resultados  obNdos  no  computador  

Sequenciador  automáNco  por  capilar  

 Reconstrução  do  Genoma    

1        3        4        5   7        8        9            10   12        13        14   18        19        20  

Sequência  dos  clones  
Individuais  
  5        6        7        8   10        11        12   14        15        16        17   22        23        24  
 
  15      16      17      18  
1        3        4        5   9        10          11   20        21          22  
 
 
11        12        13   21        22        23  
 
 
 
 
 
 
Sequência  final   1        3        4        5        6        7          8          9                  10        11            12        13        14          15    16        17      18            19        20      21        22        23          24      
Identification of the ORF
Northern Blot
 DNA microarrays
Arrayer

Colecção de DNAs específicos para cada gene

(cDNAs, ESTs, fragmentos)

Amplificação por PCR

Printing (glass slide)

DNA chips

Cada spot um DNA de

um gene diferente ...........
...........
...........
...........
Inkjet technology 10000 spots/cm2
 DNA microarrays
Experiência:
Células a crescer na condição

1 2

Scanner

Gene expresso em 1

Gene expresso em 1 e2

Gene não espresso em 1 e

2

Gene expresso em 2
DNA microarrays: Computer analysis
DNA microarrays: cluster analysis
DNA microarrays: cluster analysis

Ordenar os resultados do microarray em função de alguma variável

Experiência: fibroblastos em cultura

retirar soro fetal durante 48 horas
adicionar soro ao tempo 0 e recolher amostra de referência (marcar verde)
recolher amostras de cDNAs nos diferentes tempos (marcar vermelho)
comparar com uma amostra de referência (hibridar cada tempo com amostra de referência)
aplicar mistura ao microarray

Vermelho = aumento da expressão

Verde = redução da expressão
Preto = sem alteração
 Expression of different genes in different cells types

Genes 1
2
(n)

DNA micro-arrays
Polymerase chain reaction (PCR)
DNA footprint
 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006

Andrew Z. Fire Craig C. Mello

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 was awarded jointly

to Andrew Z. Fire and Craig C. Mello "for their discovery of RNA
interference - gene silencing by double-stranded RNA"
Prevent translation
Promote mRNA degradation
Endogenous micro RNAs control many aspects of gene expression
 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007

Mario R. Capecchi Sir Martin J. Evans Oliver Smithies

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007 was awarded jointly to Mario R.
Capecchi, Sir Martin J. Evans and Oliver Smithies "for their discoveries of
principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of
embryonic stem cells".
Photos: Copyright © The Nobel Foundation