ALBERI GENEALOGICI e ANALISI DI SEGREGAZIONE

Questo albero genealogico mostra: - una coppia in cui il marito malato e la donna no - questa coppia ha avuto 10 figli, di cui 3 sono malati, sia maschi che femmine - in ogni generazione ci sono sempre individui malati - una figlia malata della prima coppia ha avuto due mariti e ha generato una figlia affetta con il primo e una affetta anche con il secondo trasmissione di tipo AUTOSOMICO DOMINANTE, basta una copia alterata del gene per avere la manifestazione della malattia (rischio di trasmissione alla prole di un individuo malato del 50%, se un figlio sano, non ha ricevuto lallele e non trasmetter pi la malattia).

Questo albero genealogico mostra: - 5 individui malati, tutti maschi legato al cromosoma X, maschio ha un solo cromosoma X, se eredita un cromosoma malato, manifesta sicuramente la patologia, risulta malato Il maschio della prima generazione ha una malattia LEGATA AL CROMOSOMA X (es. daltonismo), i suoi figli maschi sono sempre sani, perch trasmette loro in cromosoma Y (N.B: nelle patologie legate al cromosoma X non c MAI trasmissione da padre malato a figlio maschio) La figlia della prima coppia sicuramente PORTATRICE OBBLIGATA, correr perci il rischio di generare figli maschi ammalati, e infatti lo trasmette alla prima figlia, che ha due 1

figli malati (delle altre non posso sapere perch non hanno figli, hanno un rischio del 50% essendo la madre portatrice obbligata). Come si stabilisce se una donna portatrice obbligata di una patologia legata allX? - E figlia di un individuo malato - Ha almeno un fratello e un figlio con la stessa malattia (deve avere anche un fratello affetto, perch se solo il figlio affetto e la storia familiare negativa, potrebbe avere una mutazione il nonno del bambino, mentre se ha anche un fratello malato, sicuramente la nonna ad essere portatrice, ne deriva che lei portatrice obbligata) Questa donna ha il 50% di probabilit di generare figli malati e il 50% di generare figlie portatrici.

Questo albero genealogico mostra: - tutti gli affetti sono maschi si tratta di una patologia LEGATA AL CROMOSOMA X Posso determinare le femmine portatrici con i criteri di prima. Con unanalisi di segregazione posso trarre molte informazioni da questo albero genealogico: - come si trasmette la malattia - stato di portatore/portatrice degli individui

Anche in questo caso tutti gli affetti sono maschi, ma il terzo individuo della prima generazione trasmette la patologica al figlio maschio (trasmissione da maschio a maschio), quindi non legata allX, AUTOSOMICA ad espressivit limitata al sesso maschile; non legata al cromosoma Y perch ci sono femmine che trasmettono la malattia e perch il cromosoma Y molto piccolo e se ha geni alterati normalmente luomo infertile.

Nelle patologie AUTOSOMICHE RECESSIVE accade che per diverse generazioni non vi siano segnalazioni di individui affetti patologia ricompare improvvisamente

Servono entrambi gli alleli alterati per manifestare la patologia: la mutazione pu o meno essere la stessa su entrambi i geni, con medesimo effetto finale (OMOZIGOTE RECESSIVO ed ETEROZIGOTE COMPOSTO). La popolazione un serbatoio di geni recessivi progetto di sequenziamento del genoma di mille individui: ognuno di noi portatore sano di circa dieci geni malattia Nel 98% dei casi i figli nascono comunque sani, il rischio di unanomalia congenita alla nascita di figlio di una coppia sana di 1-2%. Vi sono alcune malattie pi frequenti, come la fibrosi cistica (1 su 2500) circa 1 individuo su 25 portatore del gene recessivo per la fibrosi cistica. La probabilit che incontri un altro individuo con tale mutazione 1/25 x 1/25, poi, come in tutte le malattie recessive, la probabilit che da due portatori nasca un individuo malato di 1/4: 1/25 x 1/25 x 1/4 = 1/2500 FREQUENZA DELLA MALATTIA NELLA POPOLAZIONE

Pi una malattia genetica rara (es: 1/100000), pi facile che i genitori di un individuo malato siano tra loro consanguinei (albero e: matrimonio tra cugini di primo grado). Omozigoti recessivi in questo caso vengono detti OMOZIGOTI PER DISCESA, perch lo stesso allele che viene trasmesso allindividuo passando per due vie diverse. Es: vengono in consulenza due fratelli di un individuo morto nei primi mesi di vita in conseguenza a una patologia recessiva. Chiedono qual la loro probabilit di essere portatori del gene recessivo. Lindividuo morto era sicuramente aa:

/
A a

AA Aa Aa aa

Loro non sono sicuramente aa perch non sono ammalati, quindi la loro probabilit di essere portatori 2/3. Se fosse venuta la madre in gravidanza, le probabilit del bambino sarebbero state: - 25% completamente sano - 25% malato - 50% portatore sano Una volta nato il bambino, se non malato, la sua probabilit di essere portatore sale a 2/3, perch essendo sano si esclude laplotipo aa.

POLIMORFISMI Human Genome Project progetto di sequenziamento dellintero DNA umano dal 1 ottobre del 1990 al 30 settembre del 2005: fu terminato con 5 anni di anticipo, nel 2000. Occorre chiarire alcune definizioni: GENE: unit di ereditariet. Produce una proteina che svolge una funzione allinterno dellorganismo GENETICA: scienza che studia lereditariet nelluomo GENOMA: deriva da genes e chromosomes, il set completo di geni e cromosomi di un individuo GENOMICA: studio strutturale e funzionale del nostro genoma. Catalogo di tutte le malattie genetiche mendeliane MIM (MENDELIAN INHERITANCE IN MAN), dal 98 solo in forma elettronica (OMIM, on-line MIM)

Solo 13.693 geni sono stati completamente sequenziati. Vi sono 3-4000 malattie di cui si conosce perfettamente lanomalia genetica. Il genoma umano stato paragonato a quello di altri esseri viventi: Microbes S. cerevisiae C.elegans A. thaliana D. melanogaster H. sapiens 1 gene / kb 1 gene / 2 kb 1 gene / 5 kb 1 gene / 5 kb 1 gene / 13 kb 1 gene / 40 kb 90% Coding 70% 40% 20% 20% 3%

Genomica comparativa paragona esattamente la sequenza del nostro genoma con quello di altre specie animali. Questo ci consente di individuare il ruolo di alcuni geni es. esiste un mutante spontaneo di Drosophila, chiamato eye-less, cio cieca, dovuta a mutazione del gene Pax-6. Nelluomo, mutazioni di Pax-6 danno aniridia (assenza delliride) e altre mutazioni importanti che compromettono lo sviluppo embrionale dellocchio. Con la genomica comparativa si pu individuare meglio il ruolo di alcuni geni umani. Non pi 1 gene = 1 proteina, ma circa 25000 geni che codificano per 1 milione di proteine dogma rotto dal sequenziamento del genoma.

Inoltre, nellera post-genomica, non importante lanalisi del singolo gene, ma importante capire linterazione tra geni diversi, quindi devo comprendere il funzionamento di pi geni. Inoltre, eravamo abituati a pensare che un DNA sano portava forzatamente a un soggetto sano e un DNA mutato portava allespressione della malattia genetica in realt, ognuno ha molte mutazioni allinterno del DNA (circa 20000 a testa), quindi vi sono molte varianti che non sono di per s patogene, ma sono i cosiddetti POLIMORFISMI, variazioni allinterno della sequenza del nostro DNA con una frequenza nella popolazione superiore almeno all1%. Questi polimorfismi hanno aperto un nuovo concetto: quelle variazioni non danno un individuo malato, ma possono creare una proteina che pu funzionare un po di pi o un po di meno, che pu favorire lo sviluppo di una malattia complessa o pu proteggere da tale patologia, oppure possono concorrere a modificare lespressivit di malattie monogeniche.

31/10/2011 Ora possibile sequenziare tutto il genoma di un individuo in poche settimane (contro i 10 anni del primo) grazie alle nuove strumentazioni. Si sta facendo lESOMA, la sequenza di tutta la porzione codificante del genoma. Da questi esperimenti, si vede che allinterno degli esoni ci sono circa 20000 o pi varianti, molte di queste sono dei polimorfismi di un singolo nucleotidi, alcune sono mutazioni vanno interpretati Il DNA pieno di varianti e tutte queste varianti, alcune sono collegate a malattie mendeliano, altre sono loci di suscettibilit, etc. e possono anche determinare lespressivit di malattie mendeliane. POLIMORFISMI DEL DNA E LORO APPLICAZIONI ALLA GENETICA CLINICA Definizione di POLIMORFISMO: un polimorfismo definito dalla presenza in una popolazione di una o pi varianti (alleli) di un gene. Per essere definite polimorfismi, queste varianti devono avere una frequenza nella popolazione di almeno l1%. I polimorfismi possono essere: - silenti: non hanno alcun effetto sulla proteina prodotto del gene in cui si trovano (non hanno effetto fenotipico) - dovuti a sostituzioni di basi (SNPs) - dovuti a inserzioni di basi - dovuti a delezioni di basi - dovuti a ripetizioni in tandem e variazioni nel numero Storicamente, i polimorfismi considerati erano i gruppi sanguigni, HLA, etc. Ora lapproccio ai polimorfismi differente.

RFLP: restriction fragment lenght polimorfism VNTR: variable number of tandem repetition (minisatelliti, microsatelliti) Sono sistemi pi lunghi, ma molti pi polimorfi, quindi con pi alleli e pi informativi. RFLP

Ci sono enzimi che tagliano il DNA in determinate regioni specifiche, sequenze dette palindromi (uguali in un senso e nellaltro): per esempio, EcoR1 taglia la sequenza GAATTC endonucleasi che taglia il DNA in presenza della specifica sequenza GAATTC 8riconosce la sequenza) Il taglio pu essere netto, o pu creare due estremit dette appiccicose, utili per il clonaggio del DNA e la biologia molecolare se una base muta, lenzima non digerisce pi quel tratto, polimorfismo fa perdere il sito di restrizione poso analizzare i polimorfismi basandomi sui tagli effettuati da questi enzimi.

Tecnica del Southern Blotting

Riguarda lanalisi del DNA genomico: analizza sequenze tagliate dagli enzimi di restrizione. DNA dellindividuo viene tagliato dagli enzimi di restrizione; lo si fa migrare su gel di agarosio (i frammenti si divideranno a seconda della loro lunghezza); viene trasferito il tutto su membrana di nitrocellulosa utilizzando un sistema di soluzione salina e carta assorbente che trasferisce il DNA; membrana viene poi ibridata con una sonda che riconosce una sequenza specifica del DNA.

A C B

A A

C C

B B

Individuo 1: eterozigote Individuo 2: omozigote per A Individuo 3. omozigote per B Prendiamo lindividuo 3: ha la sequenza GAATTC in tre siti di restrizione che viene tagliata da EcoR1 ed essendo omozigote, facendo la Southern Blot, la sonda (barra rossa nel disegno) evidenzia che lindividuo omozigote per un frammento di dimensioni B che indica esattamente che su entrambi gli alleli ha gli stessi tre siti di restrizione (una sola banda). Lindividuo 2 ha una variante in una delle sequenze GAATTC nel tratto di DNA considerato, che quindi non pi riconosciuta dallenzima di restrizione, su entrambi gli alleli ( omozigote per la variante): facendo la Southern Blot sempre con EcoR1 e utilizzando la stessa sonda, questa mostra lomozigosi per un frammento A pi lungo dellindividuo 3 (manca un sito di restrizione intermedio una sola banda, ma pi pesante). Lindividuo 1 eterozigote: su un allele, ha la sequenza normale con tre siti di restrizione, mentre sullaltro ha il polimorfismo, e perci manca la sequenza di restrizione intermedia. Facendo la Southern Blot con la solita sonda, trovo sia il frammento A che il frammento B, quindi lindividuo eterozigote per questo polimorfismo (due bande). Questi sono gli RFLP, cio POLIMORFISMI DI LUNGHEZZA DI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE: noi possiamo dire che 3 omozigote per la presenza del frammento di restrizione, che 2 omozigote per lassenza del frammento di restrizione e che 1 ha due lunghezze diverse, quindi eterozigote. Con la PCR, si reso possibile amplificare un tratto di DNA che contiene la sequenza di interesse per lo studio degli RFLP, senza limpiego delle settimane di lavoro e delle sonde radioattive necessarie per la Southern Blot.

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Es: per fare diagnosi di anemia falciforme

Lanemia a cellule falciformi una patologia dovuta a una mutazione a livello della sequenza del gene betaglobinico; in particolare, nella porzione iniziale c una sequenza che normalmente riconosciuta dallenzima MST2 (CCTAGG) nellanemia falciforme, questa sequenza mutata per sostituzione di A con T, quindi non riconosciuta dallenzima di restrizione si crea un unico frammento da 1,4kb RIQUADRO soggetto normale presenta solo il frammento dal 1,2kb, il soggetto eterozigote portatore presenta sia il frammento da 1,2kb che quello da 1,4kb, mentre il soggetto omozigote malato presenta solo il frammento da 1,4kb. Quindi, questi polimorfismi possono essere utilizzati non solo per gli studi di linkage, ma anche in casi per cui la variante che perde o riconosce un sito nuovo di restrizione una mutazione responsabile di una malattia genetica, pu essere utilizzato questo metodo per la diagnosi di malattia genetica.

VNRT Ulteriori passi avanti nello studio dei polimorfismi sono stai fatti con lanalisi dei VNRT, minisatelliti e microsatelliti. Sono in numero minore rispetto agli RFLP, ma presentano un numero maggiore di alleli (RFLP sono sistemi a due soli alleli) e perci sono pi informativi. Sono ripetizioni di 2,3 o 4 paia di basi in tandem: possono essere ripetuti tre volte, cinque, sette etc. A seconda del numero di ripetizioni, ovviamente, questi frammenti possono essere pi o meno lunghi e possono essere evidenziati tramite scorrimento dellamplificazione di quel tratto di DNA su gel di agarosio. 11

RIQUADRO C segregazione di un microsatellite in una famiglia: il padre ha due alleli molto distanti tra loro, mentre la madre ha due alleli pi vicini sul gel di agarosio. Si nota che i figli prendono sempre un allele da un genitore e uno dallaltro. E importante negli studi di linkage (di concatenazione) che i marcatori siano informativi, cio che si riesca sempre a capire qual lallele che un figlio prende da un genitore e quale dallaltro: questo si pu fare se i genitori sono doppi eterozigoti per alleli diversi, perch per esempio entrambi i genitori sono omozigoti 1,1: i figli saranno tutti 1,1, ma non so dire quale hanno ereditato dal padre e quale dalla madre perch non sono marcatori informativi. I microsatelliti sono molto polimorfi e vengono usati nella genetica forense, nel riconoscimento di paternit: questo poich, analizzando un certo numero di questi microsatelliti, limpronta genetica che ne ricaviamo praticamente unica. Uno dei microsatelliti pi usati il CA-repeat, che si trova molto spesso nel DNA e viene utilizzato per lanalisi di segregazione numero particolare di ripetizioni di CA differenzia i vari genomi. Oggi possibile vederli facilmente marcando uno dei primer della PCR con un fluorocromo che correndo su un sequenziatore automatico il prodotto di PCR permette di distinguere i frammenti di DNA anche per una differenza di una sola base:

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Famiglia informativa la madre malata di una patologia dominante che ha trasmesso al figlio, ma noi non sappiamo ancora di quale gene si tratti. Per sappiamo che sta su un determinato cromosoma. In questa regione dove noi abbiamo mappato il gene malattia c un marcatore polimorfico, quindi io studio la segregazione di questo marcatore polimorfico nella famiglia. Questo un microsatellite: il padre ha frammenti di 150 e 154 paia di basi, quindi eterozigote in questa regione del DNA che sto esaminando (i due cromosomi di differenziano per 4 paia di basi, cio per due CA-repeat). La madre invece ha due alleli che si differenziano per sei paia di basi, 140 e 146, quindi per tre CA-repeat. A questo punto vado a vedere la segregazione nei figli: la prima figlia prende lallele 154 dal padre e il 146 dalla madre, la seconda figlia prende il 150 al padre e il 146 dalla madre e il figlio malato prende lallele 150 dal padre e 140 dalla madre. Se questo marcatore polimorfico strettamente concatenato al gene-malattia, sebbene io non conosca il gene-malattia o la sua mutazione che causa la malattia, io posso seguire la segregazione degli alleli a questo determinato polimorfismo per capire chi nella famiglia prende il cromosoma malattia e quindi svilupper la patologia. Cio se questo marcatore molto vicino al gene che determina la malattia in questa donna, significa che ogni volta che trasmette lallele con 140 paia di basi di quel marcatore, automaticamente insieme trasmette anche il gene malato e i figli presenteranno la patologia. QUESTO E IL LINKAGE eccezione alle leggi di Mendel: a volte qualche esperimento non rispondeva allidea della segregazione mendeliana, e lui scartava questi esperimenti erano esperimenti dove era avvenuto il linkage, o concatenazione. La seconda legge di Mendel dice che due caratteri segregano indipendentemente: questo vero se due caratteri si trovano su cromosomi diversi oppure sullo stesso cromosoma ma molto distanziati tra loro. Ma se due caratteri sono molto vicini sullo stesso cromosoma, questi tenderanno a segregare insieme LINKAGE. Pi vicini sono due caratteri, pi facile che i due caratteri alla meiosi vadano insieme, cio pi facile che non avvenga un crossing over che li divide. E per questo che, pur non conoscendo il gene-malattia ma solo un polimorfismo vicino, posso studiare la segregazione del microsatellite per determinare la presenza o meno del gene mutato, perch questi due caratteri segregheranno sempre assieme. N.B.: il linkage serve per mappare i difetti genetici sul nostro genoma, si parte da questo concetto di concatenazione per arrivare a identificare la regione genomica nella quale c il gene-malattia

SNPs Sono polimorfismi di un singolo nucleotide SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM In alcune sequenze del genoma, almeno nell1% della popolazione una base mutata. Es: CCATTGACTT CCTTTGACTT Possono esserci persone omozigoti per la A, per la T o eterozigoti. 13

Questi polimorfismi di un singolo nucleotide sono facilmente studiabili oggi con i sistemi di microarray etc, sono sicuramente meno informativi dei microsatelliti, ma siccome sono in numero molto maggiore, se ne studiamo tantissimi tutti assieme arriviamo ad avere la stessa informazione che avremmo con meno microsatelliti. Con il progetto Genoma Umano stata costruita una mappa di SNPs dbSNP: SNPdatabase Racchiude tutti i polimorfismi che sono stati identificati nella sequenza del nostro genoma fino ad ora (aumentano con lanalisi di nuovi genomi). Si pensava che ci fossero circa 3 milioni di SNPs, ma ora si visto che sono pi di 4 milioni. Il database degli SNPs fornir la cura appropriata al paziente appropriato: se per esempio, testiamo un farmaco su una popolazione che risponde molto bene alla terapia, mentre unaltra reagisce in maniera negativa allo stesso farmaco, posso, comparando i diversi SNPs, capire quali sono i polimorfismi che inducono una buona o una pessima risposta alla terapia presa in considerazione (e quindi adattare la terapia). Inoltre, pu fornire informazioni sulla suscettibilit o la protezione verso malattie multifattoriali. LINKAGE EQUILIBRIUM: indica una combinazione casuale di alleli a loci associati. Consideriamo per esempio il caso di due loci associati 1 e 2 con 2 possibili alleli ciascuno (A e a per il locus 1 e B e b per il locus 2) Gli aplotipi possibili in una determinata popolazione (AB, Ab, aB, ab) si verificheranno con una frequenza che il prodotto delle frequenze dei singoli alleli per ciascun aplotipo. LINKAGE DISEQUILIBRIUM (LD) un termine dell'ambito genetico che indica la presenza di associazione statistica tra specifici alleli relativi a due o pi loci, che costituiscono di solito un particolare aplotipo ancestrale, diffuso nella popolazione in cui rilevato perch trasmesso lungo la discendenza da un comune progenitore. Per questo motivo il linkage disequilibrium maggiore in popolazioni omogenee, cio originate da un nucleo di individui fondatori come le popolazioni sarda o finlandese. Infatti le migrazioni recenti generano substruttura ed eterogeneit genetica e aplotipi differenti associati allo stesso tratto tendono ad abbassare i valori di significativit. Il linkage disequilibrium un importante strumento per individuare regioni cromosomiche di limitata ampiezza in cui si collocano i geni per una data malattia (mappaggio ad alta risoluzione) e si avvale dell'analisi molecolare di varianti alleliche (per lo pi di SNPs o STRs) che costituiscono aplotipi in pazienti tra loro apparentemente non imparentati. Infatti prevedibile che pazienti che hanno ereditato lo stesso segmento cromosomico, definito dal medesimo aplotipo, abbiano ereditato anche la stessa mutazione in esso contenuto. Risale agli anni '80, il primo gene mappato con questo approccio: quello della fibrosi cistica in 7q31.2.

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02/11/2011 ANALISI DI LINKAGE Lanalisi di linkage permette: - di determinare la posizione cromosomica di un determinato locus responsabile di una determinata malattia/carattere genetico rispetto a marcatori polimorfici che utilizziamo e la cui localizzazione nota - di seguire nella famiglia la segregazione di un allele contenuto nel tratto di genoma tipizzato con i marcatori Lanalisi di linkage un approccio molto utile 1) per il mappaggio e lidentificazione di geni responsabili di malattie genetiche Mendeliane (oltre 1200 geni identificati) 2) per la diagnosi genetica indiretta (patologie di cui nota la posizione ma non la sequenza del gene malattia) Linkage uneccezione alla seconda legge di Mendel:

Incrocio di due caratteristiche: semi gialli e lisci semi verdi e rugosi ottenne una segregazione di 9 3 3 1, cio 9 volte su 16 ottenne semi lisci e gialli, 1 volta su 16 ottenne semi verdi e rugosi, ma 3 volte su 16 ottenne semi rugosi gialli e semi lisci verdi. Da qui deriv il concetto dellassortimento indipendente dei caratteri (i geni delle due caratteristiche stavano su cromosomi diversi che potevano riassortirsi in tutte le combinazioni possibili). Partendo da questo concetto, venne fatto uno studio su soggetti murini: partendo da due linee pure: 15

1)topo normale per un carattere fisico (colore del mantello = C) e per un carattere neurologico (=Sh); 2)topo albino (colore mantello = c) e con fenotipo neurologico che crea problemi durante landatura (=sh). Incrociandoli tra loro, si ha una prima generazione doppio eterozigote per entrambi i caratteri, ma saranno sempre sani perch C e Sh sono dominanti sulle varianti malate: sono portatori per i due caratteri recessivi. Incrociando i topi della prima generazione, per la seconda legge di Mendel, mi aspetto 4 tipi di gameti diversi C/Sh; C/sh; c/Sh; c/sh , ottenendo la segregazione 9 3 3 1. I risultati invece furono differenti: Osservati Attesi C/Sh 192 146,7 c/Sh 9 48,9 C/sh 3 48,9 c/sh 57 16,3 Praticamente un rapporto di tre a uno per i topi normali. I tipi di alleli erano in sostanza due: C/Sh e c/sh, quindi non si formavano quattro tipi di gameti, ma quasi solo due. Con questa ipotesi, si ottiene la segregazione con rapporto 3:1 C/Sh c/sh C/Sh CC/ShSh Cc/Shsh c/sh Cc/Shsh cc/shsh Ci significa che la seconda legge di Mendel vale se i caratteri stanno su cromosomi diversi o distanti sullo stesso cromosoma, a se questi caratteri sono vicini, molto probabile che segreghino assieme durante la meiosi. Quindi: LANALISI DI LINKAGE SI BASA SULLA CO-SEGREGAZIONE ALLA MEIOSI DI 2 O PI LOCI PI FREQUENTEMENTE DI QUANTO CI SI ASPETTA PER CASO. SE 2 LOCI VENGONO EREDITATI INSIEME FREQUENTEMENTE, PROBABILE CHE SIANO LOCALIZZATI VICINI FRA DI LORO SULLO STESSO
CROMOSOMA

La frazione di ricombinazione non pu mai superare il 50%: la frazione di ricombinazione indica il numero delle meiosi ricombinanti rispetto al numero totale delle meiosi (non ricombinanti + ricombinanti). Al massimo, questa pu quindi arrivare al 50%: quando due caratteri sono su cromosomi diversi, possono segregare casualmente al 50% per determinare se c concatenazione fra due loci, dobbiamo determinare con che frequenza ricombinano tra loro, indicata con THETA () che appunto la frazione di ricombinazione. Si avr quindi che: - se due loci sono su cromosomi diversi segregano indipendentemente. La probabilit che vengano ereditati insieme del 1/2 = 50% (massima probabilit) - se due loci sono vicini fra loro sullo stesso cromosoma saranno ereditati insieme pi frequentemente < 50% Tanto pi sono vicini i due loci, tanto minore la probabilit che ricombinino tra di loro: possiamo arrivare ad avere probabilit = 0 di ricombinazione la frequenza di ricombinazione una misura della distanza genetica. 16

La distanza genetica corrisponde in pratica al numero atteso di crossing-over tra due loci. La sua unit di misura il centiMorgan (cM) 1cM corrisponde all1% di ricombinazione, che in termini di mappa fisica indica una distanza genetica (circa una megabase). Per valori di < 10% c grossomodo una corrispondenza tra il centiMorgan e la frazione di ricombinazione; quando > 10% si usano le funzioni di mappa per convertire in centiMorgan. Le frazioni di ricombinazione tra loci distanti non sono additive: per esempio, se su un cromosoma ho il locus A e il locus B che hanno tra di loro una frazione di ricombinazione pari al 30% e tra il locus B e il locus C c di nuovo il 30% di ricombinazione, non che tra il locus A e il C c il 60%.

A B

1 1 Ricombinaz. No ricombinaz

A B A

1 1 2 1 1 2

MEIOSI NON INFORMATIVA

A B

1 2

mb Rico
No r ic

inaz.

B A

omb

MEIOSI INFORMATIVA

inaz

Per capire se c concatenazione tra due loci, occorrono due cose: 1- informativit del marcatore: ho un cromosoma con il locus A, un con il locus B e un secondo locus concatenato a questi (1). I gameti che former questo individuo sono A1 o B1, quindi noi non sappiamo dire se avvenuta ricombinazione o no. Massima informativit si ha quando un individuo doppio eterozigote, come nel secondo caso posso dire se c stata ricombinazione o no 2- conosco la fase: cio, conosco la disposizione degli alleli su due loci adiacenti nello stesso cromosoma. Posso avere anche pi di due alleli, posso averne molti: in questo caso, si parla di APLOTIPO, cio la disposizione di una serie di alleli in loci adiacenti su di un cromosoma (vengono ereditati insieme). Per conoscere la fase, noi dobbiamo avere a disposizione la generazione precedente: di solito si usa la seconda generazione per ricostruire la fare dei marcatori e da l in poi si conosce la fase e pu essere calcolata la frazione di ricombinazione occorrono almeno tre generazioni (vedi esempio): la seconda serve per ricostruire la fase. Per il cromosoma X pi semplice calcolare la fase perch c la regola del nonno: il nonno trasmette sempre alle figlie femmine un X non ricombinante quindi conosco direttamente la fase

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Esempio:

In questo caso la madre portatrice per due difetti: il daltonismo e la carenza di glucosio-6-fosfato deidrogenasi. Genera quattro figli: uno con entrambe le malattie, uno completamente sano e due con una sola delle due patologie, cio tra questi ci sono sicuramente due ricombinanti. Per sapere quali sono, devo andare a studiare qual era la fase del nonno: - se il nonno presentava tutti e due i caratteri o nessuno dei due caratteri (primo esempio), i nipoti ricombinanti sono quelli che presentano una sola patologia (la madre riceve di sicuro il cromosoma non ricombinato); - se invece il nonno aveva uno dei due caratteri, i ricombinanti sono i due soggetti completamente sani o con entrambe le patologie.

INFORMATIVITA

Aa 11 Aa 12 NO

aa 22

Aa 12

aa 12 Aa 12 NO

Aa 12 Aa 22 SI

aa 12

Aa 1 2 Aa 14 SI

aa 34

Nel primo esempio, un individuo malato di una patologia a carattere dominante (Aa) e la moglie sana (aa); il marcatore concatenato che utilizziamo segnato con i numeri padre: 1,1; madre 2,2 Questa una meiosi non informativa, perch non sappiamo se il cromosoma intero o ricombinato. Anche il secondo non informativo, perch sia il padre che la madre hanno gli stessi alleli. 18

Nel terzo caso, la meiosi informativa perch, essendo la ragazza ammalata omozigote 2,2, significa che ha preso un allele 2 dal padre e un allele 2 dalla madre: pertanto, dato che noi conosciamo la fase del padre (devo conoscere la fase della generazione precedente per determinare la fase), possiamo dire se ricombinante o no. Nel quarto esempio, c massima informativit poich i genitori sono doppi eterozigoti. QUINDI ci che faccio con lanalisi di linkage non altro che andare a stabilire se c una concatenazione tra un marcatore specifico e un locus malattia, tra due caratteri presenti sullo stesso cromosoma e per stabilire questo devo sapere se c stata ricombinazione La tipizzazione di famiglie ampie ed informative dove segrega una specifica malattia genetica consente di stabilire se esiste una concatenazione tra un marcatore specifico ed il locus malattia. La base logica di questo metodo molto semplice ed dovuta al fatto che in una progenie si possono osservare due situazioni: - quella del riassortimento indipendente di due geni (o di un marcatore con un gene); - quella della concatenazione degli stessi. Per calcolare lesistenza di un rapporto di concatenazione si utilizza il sistema del RAPPORTO DI MASSIMA VEROSIMIGLIANZA o LOD SCORE: i lod score vengono calcolati prendendo in considerazione una meiosi alla volta e confrontando la probabilit dei genotipi osservati nelle ipotesi di concatenazione (linkage) o riassortimento indipendente (assenza di linkage). Si calcolano due probabilit: 1- L0: probabilit che la progenie di quella famiglia sia generata in assenza di concatenazione, quindi con = 50%; 2- L1: probabilit che la stessa progenie sia generata invece in presenza di concatenazione, cio con < 0,5% Queste probabilit vengono pi esattamente definite come verosimiglianza delle osservazioni nelle due ipotesi di indipendenza e di linkage. Ci che si fa in pratica calcolare il rapporto di verosimiglianza (L): L = L1/L0 probabilit che la progenie sia generata in presenza di concatenazione rispetto alla probabilit che quella stessa progenie sia generata in assenza di concatenazione. e si cerca il valore di per cui questo rapporto sia massimo Siccome poi, per semplicit, si usa il logaritmo in base 10 di verosimiglianza: Z = log ( L1/L0 ) Il tutto in inglese viene chiamato lod score. Il valore che da qui si ottiene indica la presenza o meno di concatenazione: la mappatura di una malattia si ottiene cos quando il valore di Z uguale o superiore a 3, c linkage. In effetti questo valore sta ad indicare che lipotesi di concatenazione per un determinato valore di 1000 volte pi probabile di quella di indipendenza. Per valori di Z < -2, non c linkage; per valori intermedi non c un ipotesi certa, probabilmente quei marcatori non sono veramente informativi (dovr analizzare altri marcatori).

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03/11/2011 Il linkage negli anni stato necessario per mappare un difetto genetico nel nostro genoma, per identificare il gene-malattia allinterno di un tratto di cromosoma: questo fondamentale per unanalisi diretta di malattia genetica. Metodi utilizzati nel passato per identificare il gene-malattia:

clonaggio funzionale: alcune informazioni sulla funzione biochimica del prodotto del gene (es.: malattia data dalla mancanza di un enzima) vengono sfruttate per isolare un clone del gene. Se il prodotto genico noto, la parziale purificazione del prodotto pu permettere ladozione di varie strategie per identificare il gene responsabile. Alternativamente, pu essere usato un saggio funzionale per controllare la presenza del gene. Questo approccio stato utile solo in pochi casi; gene candidato: posso avere unidea sulla patogenesi molecolare del difetto, come per esempio nella distrofia muscolare il gene-malattia sar espresso nel tessuto muscolare; clonaggio posizionale: isolare il gene conoscendo solo la sua localizzazione subcromosomica, senza utilizzare alcuna informazione riguardante la patogenesi o la funzione biochimica. La strategia di cercare di costruire la mappa fisica e la mappa genetica della regione, precisare la localizzazione subcromosomica e poi identificare i geni presenti nella regione per valutarli come possibili geni patologici. Il clonaggio posizionale rimane arduo e sta diventando sempre meno necessario per laccumularsi di informazioni che permettono un approccio posizionale al gene candidato; gene candidato per posizione: terminato il sequenziamento del genoma umano, una volta identificato il locus malattia, nei database pubblici erano presenti le sequenze di quel tratto di genoma con tutti i geni contenuti allinterno e a quel punto si andava a cercare tra questi quale era il miglior candidato in base a parametri funzionali.

Quindi la localizzazione del locus malattia sul nostro genoma fondamentale per identificare un gene-malattia, quindi la mappatura genetica: la mappatura genetica si fa con lanalisi di linkage. lanalisi di linkage permette determinare la posizione cromosomica di un locus responsabile di una determinata malattia/carattere genetico rispetto a marcatori polimorfici la cui localizzazione nota. 20

REQUISITI PER LANALISI DI LINKAGE DI CARATTERI MENDELIANI Si prende una grande famiglia con una malattia (oppure famiglie pi piccole allinterno delle quali segrega la stessa malattia genetica) e li caratterizziamo per quei marcatori che sono distribuiti lungo il nostro genoma (un certo numero di marcatori sul cromosoma 1, un certo numero di marcatori sul cromosoma 2, etc). Per fare questo, si utilizzano circa 400-500 microsatelliti, oppure si pu arrivare fino a 50000300000 SNPs distribuiti su tutto il genoma (meno informativi, ma in numero maggiore danno maggiore informativit). In questi anni sono state costruite mappe dettagliate con tutta una serie di marcatori che sono distribuiti lungo i vari cromosomi esempio per il cromosoma 20:

Gli individui e le famiglie vengono quindi tipizzati per questi polimorfismi distribuiti lungo tutto il genoma. Esempio: locus malattia sul cromosoma 10. Se io vado a vedere se i marcatori del cromosoma 1 segregano con la malattia, trover che c una ricombinazione del 50%, quindi si riassortiscono in maniera casuale perch stanno su cromosomi diversi; e cos tutti i marcatori dei cromosomi 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13etc. Se io vado a vedere i marcatori del cromosoma 10, finch questi marcatori sono distanti dal locus malattia, anche questi segregheranno in maniera indipendente, con una frazione di ricombinazione del 50%. Ma via via che vado a utilizzare marcatori pi vicini al locus malattia, vedr che questi tendono a segregare insieme: ci saranno frazioni di ricombinazione < al 50%, fino ad arrivare a marcatori che, essendo strettamente concatenati al gene-malattia, potrebbero avere frazione di ricombinazione 0. Calcolo il lod score di quei marcatori, quei marcatori mi danno lod score >3 e identifico il locus malattia. Spesso i dati ricavati da una solo famiglia non sono sufficienti per stabilire presenza /assenza di linkage. I lod score ottenuti da famiglie indipendenti (per lo stesso valore di ) si possono sommare fra loro 21

 esempio:

tetha Fam 1 Fam2 Fam3 Totale

0.05 0.1 0.12 0.32 -0.16 0.07 2.23 2.04 2.19 2.43

0.2 0.42 0.21 1.63 2.26

0.3 0.36 0.22 1.17 1.75

0.4 R:NR 0.22 0:4 0.14 1:3 0.63 0:8 0.99

Per il secondo marcatore nella tabella, abbiamo l1% di ricombinazione. Significa che questo marcatore da il massimo valore di lod score, che ancora per non positivo: vuol dire che probabilmente questo marcatore non strettamente concatenato, ma da unindicazione che il marcatore pu essere distante circa 1 megabase, cio 1 centiMorgan dal locus malattia. A quel punto si utilizzano marcatori pi interni per andare a trovare quelli che hanno 0 di ricombinazione. Esempio

Si pu calcolare anche il MULTIPOINT LOD SCORE: data una mappa di markers con posizione nota, si calcola la likelihood (probabilit) per ogni posizione del locus malattia lungo il cromosoma. Permette di estrarre il massimo dellinformazione data da tutti i markers sul cromosoma.

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COSTRUZIONE DI APLOTIPI: DEFINIZIONE DELLA REGIONE CRITICA

Famiglia con patologia dominante. Una volta trovato il marcatore di linkage che da lod score positivo, si utilizzano tutta una serie di marcatori molto vicini a questo per determinare quindi qual il tratto di cromosoma che segrega sempre in tutti gli affetti allinterno di tutti gli affetti rappresenta la regione minima dove andare a cercare il locus del gene-malattia. Si utilizzano marcatori che sono vicini tra di loro sullo stesso cromosoma. Tutti gli individui malati hanno un aplotipo (riportato in nero) 6 4 3 3 2 3 6 5 alleli del marcatore polimorfico! al marcatore D1S2722 gli individui malati hanno lallele 6 al marcatore D1S211 gli individui malati hanno lallele 4 etc La porzione in nero rappresenta un tratto di cromosoma che sempre presente negli ammalati. Si nota che: - il secondo individuo della III generazione presenta una ricombinazione a livello dellultimo marcatore considerato (9 invece di 5) ed affetto: ci significa che quello il limite distale della regione contente il gene-malattia; - il primo individuo della IV generazione presenta solo i primi 4 marcatori individuati, mentre gli altri sono ricombinanti e non affetto dalla patologia: ci significa che la regione critica 23

si trova obbligatoriamente tra D1S417 e D1S2742 (questa ricombinazione definisce il limite prossimale della mutazione, mentre laltra definiva quello distale). Una volta si sarebbe fatto un piccolo progetto genoma umano per analizzare la porzione di DNA identificata; oggi invece, avendo a disposizione in sequenziamento del genoma umano e, di conseguenza, la sequenza di quella regione e tutti i geni in essa contenuti che verranno testati per capire qual quello che induce la patologia. Geni identificati con il metodo candidato per posizione: Morbo di Alzheimer precursore della proteina -amiloide, apo-E Malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 1A Proteina mielina zero Malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 1B Proteina 22 mielina periferica Melanoma familiare P16 Cancro del colon non associato a poliposi ereditaria hMSH 2, hMLH 1, hPMS 1, hPMS 2 Ipotermia maligna Recettore della rianodina Sindrome di Marfan Fibrillina Neoplasia endocrina multipla di tipo 2A Recettore RET della tirosina chinasi Retinite pigmentosa Periferina e rodopsina Sindrome di Waardenburg di tipo 1 Paired box gene PAX 3 Come si associa un gene malattia ad uno specifico fenotipo? se si ha un fenotipo specifico in vitro (es: coltura di fibroblasti di un soggetto affetto da una patologia di queste cellule), transfettando allinterno di quei fibroblasti una serie di geni, se la transfezione di un gene fa s che i fibroblasti riacquistino il fenotipo normale, significa che il gene responsabile della malattia (raramente) si possono costruire modelli animali knock-out per il gene omologo e vedere se il fenotipo che esprimono corrisponde alla patologia che stiamo studiando (raramente) ricerca di mutazioni causative allinterno di un gene candidato per una specifica malattia genetica in una coorte di pazienti che presentano quella malattia (metodo in uso) Esempio: La sindrome di Fechtner una patologia molto rara che presenta alcune caratteristiche: - problemi oculari (spesso cataratta); - sordit; - nefrite (che porta a insufficienza renale); - macrotrombocitopenia (piastrine diminuite di numero ma aumentate di volume); - inclusione nei PMN, chiamati doll-like bodies. Ci sono due patologie ematologiche (Anomalia di May-Hegglin e Sindrome di Sebastian) che hanno alcune di queste caratteristiche: la macrotrombocitopenia e le inclusioni, mentre le altre sono 24

assenti. Queste due malattie si distinguono per il diverso aspetto delle inclusioni nucleari al microscopio elettronico. Vi sono poi pazienti che presentano solo la macrotrombocitopenia senza inclusioni, ma accompagnata da nefrite e sordit Sindrome di Epstein

Ipotesi: le quattro patologie derivano tutte da un unico cromosoma identificato come il cromosoma 22, si cercano marcatori per determinare la regione critica della mutazione responsabile

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Ricombinazioni indicate dalle frecce consentono di delimitare distalmente e prossimalmente la regione minima: la regione ricavata molto piccola, circa 480000 bp. La regione contiene al suo interno solo 9 geni 9 geni candidati per posizione. Tra questi nove, solo uno era quello responsabile del fenotipo: il gene MYH9 codifica per la catena pesante della miosina non muscolare di tipo IIA (NMMHC-IIA) che espressa in alcuni tessuti quali piastrine, rene, leucociti e coclea gene altamente candidato perch espresso nei tessuti colpiti dalle malattie considerate. (Altre miosine non convenzionali sono associate a malattie nelluomo che mostrano sordit o difetti dellocchio) trovate mutazioni distribuite prevalentemente in alcuni esoni responsabili dei vari fenotipi. Lo stesso gene era quindi responsabile delle stesse quattro patologie: le differenze tra i pazienti non sono altro che variabilit nellespressione clinica di mutazioni nello stesso gene. A questo punto possibile fare una diagnosi diretta di patologia genetica: se ho una famiglia affetta da una malattia genetica cerco direttamente la mutazione. 26

EXOME SEQUENCING nuova tecnologia che consente di sequenziare il genoma di un individuo solo per le sequenze codificanti (in realt si arriva a coprire circa il 90% delle porzioni realmente codificanti): il problema poi capire tra le varianti che identifichiamo quali sono responsabili della malattia analisi bioinformatica Non partiamo pi dalla mappatura, dal locus malattia: qua abbiamo un paziente cui si diagnostica (non sempre, perch lanalisi bioinformatica complessa) una patologia tramite il sequenziamento del solo esoma. N.B.: ogni base deve essere coperta un certo numero di volte per avere una valenza statistica, almeno un 50x significa che ci passo sopra almeno 50 volte per identificare una mutazione a livello di una singola base (coverage). Quando si fa lesoma a un individuo, si trovano circa 20000 varianti: esclusi i vari polimorfismi, SNPs, esclusi quelli presentati da altri individui, si arriva a circa 160 mutazioni potenzialmente dannose (possono essere mutazioni silenti, mutazioni di geni recessivi, etc) Prima sindrome identificata con questo metodo: Sindrome di Miller, caratterizzata da micrognazia, palatoschisi, etc.

Cera un solo gene responsabile della patologia, mutato in entrambi gli alleli.

04/11/2011 Allele: forma alternativa di un gene ad un determinato locus. Bisogna vedere le frequenze dei genotipi rispetto ai fenotipi genetica di popolazione. Dobbiamo riuscire a calcolare la frequenza di alleli e di genotipi nella popolazione. La legge che accomuna sia la frequenza genica che la frequenza genotipica la LEGGE DI HARDY-WEINBERG: in una popolazione in cui gli incroci sono casuali, gli alleli di un determinato locus sono allequilibrio di Hardy-Weinberg. Questo significa che se lallele A ha frequenza p e lallele a ha frequenza q, allora p+q=1, cio i due alleli insieme avranno frequenza del 100% (esempio: se A=80, a=20). 27

Ma, mischiando tra loro gli alleli, noi arriviamo ai genotipi, perci avremo: A A A A a Aa Le frequenze dei genotipi saranno: - AA = p2 - aa = q2 - Aa = 2pq Quindi la frequenza dei genotipi non altro che un quadrato di binomio: (p + q)2 = 1 2 p + q2 + 2pq = 1 a A a aa omozigoti AA; omozigoti aa; eterozigoti Aa

Esercizi:
I II III IV V

(1) Nellalbero riportato lindividuo III3 affetto da una rara malattia autosomica recessiva letale nei primi mesi di vita che presenta una frequenza nella popolazione di 1/40.000 nati. Calcolate la probabilit per la donna V2 di avere un figlio affetto a) se sposa suo cugino di III grado V1 b) se sposa un individuo della popolazione generale. 28

Se una persona sposa uno della stessa famiglia, devo calcolare il rischio tenendo conto del fatto che lallele segrega allinterno della famiglia, mentre se sposa un estraneo il suo rischio di essere portatore sar quello della popolazione generale (legge di Hardy-Weinberg) Gli individui malati sono 1/40.000 nati e sono individui aa, cio malattie q2: la frequenza degli individui malati nella popolazione (q2) quindi uguale a 1/40.000. Per prima cosa devo calcolare le probabilit del cugino di essere portatore: i genitori dellindividuo malato hanno probabilit di essere portatori 100%, perch sono sani e sono genitori di un individuo malato di patologia recessiva quindi II1 e II2 sono sicuramente Aa La sorella sana dellindividuo malato ha probabilit di essere portatrice pari a 2/3. Il figlio di questa donna, ha probabilit di essere portatore: 2/3 x 1/2 = 1/3 perch lei, essendo Aa, ha un 50% di probabilit (quindi 1/2) di trasmettere lallele recessivo. A sua volta, lindividuo V1 ha probabilit d essere portatore: 1/3 x 1/2 = 1/6 Ora devo calcolare la probabilit della donna di essere portatrice. II2 per forza portatrice: lallele a le stato trasmesso o dalla madre o dal padre e la probabilit che uno dei due genitori abbia trasmesso lallele anche al fratello del 50%, quindi la probabilit di II3 di essere portatore pari a 1/2, cio la probabilit che il genitore portatore labbia trasmesso anche a lui. Quindi, la probabilit dellindividuo III4 : 1/2 x 1/2 = 1/4 (*) La probabilit dellindividuo IV4 sar: 1/4 x 1/2 = 1/8 Perci la probabilit della donna di essere portatrice per lallele recessivo sar: 1/8 x 1/2 = 1/16 In questo caso, essendo i due individui parenti dellindividuo malato, la loro probabilit di essere portatori viene calcolata in base al loro grado di parentela, senza utilizzare la legge di HardyWeinberg essendoci gi un individuo malato in famiglia, la loro probabilit di essere portatori sar molto pi alta rispetto a quella della popolazione generale e dipende dal legame di parentela che hanno con lindividuo ammalato. a) La probabilit che la signora, sposando il cugino di terzo grado, abbia un figlio ammalato dunque: 1/6 x 1/16 x 1/2 x 1/2 = 1/384 N.B.: due individui portatori hanno sempre la probabilit di 1/4 di avere un figlio malato. b) Se invece la signora sposa un individuo della popolazione generale, devo calcolare la frequenza di eterozigoti portatori nella popolazione (ovviamente escludo i malati e i non portatori) secondo la legge di Hardy-Weinberg: 1/40000 = q2, che la frequenza della patologia nella popolazione (genotipo aa) Significa che: q = 1/40000 = 1/200 Posso ricavare p, poich: 29

p + q = 1, avr che p = 1 q p = 1 1/200 = 199/200 Posso approssimare p a 1 (cosa sempre fattibile quando un allele ha una frequenza molto bassa come in questo caso -1/200- per velocizzare i calcoli) Quindi otterremo, essendo i portatori sani Aa, quindi 2pq nellequazione: Frequenza eterozigoti nella popolazione = 2(1)(1/200) = 1/100 Quindi, la probabilit che la signora, sposando un individuo della popolazione generale abbia un figlio malato : 1/16 x 1/100 x 1/2 x 1/2 = 1/6400

(2) Se un disordine recessivo legato al cromosoma X colpisce una donna su 1.000.000 in una popolazione, qual la frequenza attesa dei maschi affetti? E quella delle donne portatrici? N.B.: la donna per essere ammalata in questo caso deve essere per forza omozigote recessiva. Donne malate XX = q (1/1.000.000) Donne portatrici XX = 2pq Donne sane XX = p Uomini sani XY = p Uomini malati XY = q In una malattia legata al cromosoma X, la frequenza dei maschi ammalati uguale alla frequenza dellallele malattia. q = 1/1.000.000 q = 1/1.000 Essendo lallele q molto raro, posso considerare p = 1 (Sarebbe 999/1.000) Cos ora possiamo calcolare sia i maschi ammalati che le femmine portatrici. I maschi ammalati non sono altro che la frequenza dellallele malattia, perci 1/1.000 Mentre le femmine portatrici sono: 2pq = 2 x 1 x 1/1.000 = 1/500

TEST GENETICO 30

Definizione: analisi di DNA, RNA, cromosomi, proteine o particolari metaboliti al fine di rilevare, a fini clinici, genotipi, mutazioni, fenotipi o cariotipi correlati a malattie ereditarie I test genetici vengono fatti per: - conferma diagnostica di una malattia (chiarisce il sospetto clinico); - identificare un individuo portatore sano per una patologia ereditaria; - diagnosi prenatale di malattie ereditarie; - diagnosi presintomatica di malattie ereditarie; - riconoscere la suscettibilit per patologie complesse

(*) In casi come questo, non tengo conto della possibilit che anche la madre dellindividuo III4 sia casualmente portatrice sana, perch in casi come questo, quando un patologia molto rara, il risultato cambierebbe di poco: 1/4 + 1/100 = 26/100 che molto vicino a 1/4 N.B.: in questo caso devo sommare perch i due eventi che considero, e cio che abbia ereditato lallele a dalla madre o dal padre, si escludono lun laltro, dal momento che al massimo lindividuo pu essere portatore. 08/11/2011 Tipi di test diagnostici: Test diagnostico: in presenza di un sospetto clinico di una malattia, permette di confermarne o precisarne la diagnosi Test presintomatico: in una famiglia con un difetto genetico noto per una patologia a insorgenza tardiva, permette di identificare i portatori prima dellesordio della malattia conclamata Test predittivo: in una famiglia con un difetto genetico noto che conferisce suscettibilit a una malattia, permette di identificare i soggetti a rischio Test prenatale: fornisce informazioni sullo stato genetico del nascituro

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Biopsia dei villi corionici e amniocentesi: la biopsia dei villi non altro che una biopsia della placenta, mentre nellamniocentesi si preleva una certa quantit di liquido amniotico. Dal prelievo dei villi, si ha subito un cariotipo mettendo a crescere le cellule e osservando la metafase si ha una risposta in 3/4 giorni e poi vengono messi in coltura e dopo una decina di giorni posso fare lanalisi diretta sul DNA. Gli amniociti vanno messi per forza in coltura e abbiamo una risposta dopo circa due settimane. La villocentesi si fa intorno all11esima settimana, mentre lamniocentesi intorno alla 16esima. Da entrambe si verifica il cariotipo fetale, ma la villocentesi da pi facilmente falsi positivi (0,61%), poich una mutazione post-zigotica, che interviene dopo la formazione dello zigote, pu ancora interessare la placenta e non andare a interessare il feto.

La diagnosi molecolare pu essere: - DIRETTA: quando la sequenza del gene nota andiamo direttamente a verificare la sequenza del gene rispetto a quella di riferimento per identificare una mutazione nel gene che causa malfunzionamento del suo prodotto; - INDIRETTA: la sequenza del gene non nota, ma nota la sua posizione nel genoma, si fa la diagnosi tramite lanalisi del linkage. Mentre nella diagnosi diretta sufficiente un campione di DNA del paziente, in quella indiretta devo avere a disposizione campioni di tutta la famiglia allargata, sia individui sani che ammalati o portatori, per poter seguire la segregazione: quindi sicuramente pi indaginosa e a volte non informativa.

Esempio: famiglia dove segrega una malattia autosomica dominante: la coppia ha gi avuto figli ammalati, chiede il rischio di un altro figlio malato del 50 % Per possiamo analizzare la famiglia e, una volta individuata la mutazione, si pu verificare se lallele malato stato trasmesso dal genitore al feto con certezza del 100%.

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Caso particolare: signora che si sposata due volte, era ammalata, aveva una sorella ammalata e ha avuto un figlio malato. Malattia di Cowden lindividuo III1 presenta poliposi iperplastica del colon, lesioni cutanee verrucose, gozzo, obesit, macrocefalia e sordit, mentre la madre presentava polipi rettali, carcinoma colonrettale, carcinoma della mammella, macrocefalia, obesit, fibromatosi uterina. Si tratta quindi di una forma di malattia di Cowden, malattia autosomica dominante per cui ci sono dei criteri per fare la diagnosi clinica che non sempre sono presenti in toto nellindividuo malato criteri maggiori per la diagnosi: carcinoma mammario carcinoma tiroideo (non midollare) macrocefalia carcinoma endometriale criteri minori: lesioni tiroidee benigne ritardo mentale polipi amartomatosi intestinali mastopatia fibrocistica lipomi fibromi malformazioni e tumori urogenitali fibromatosi uterina

criteri patognomonici per la diagnosi: - malattia di Lhermitte-Duclos (gangliocitoma displastico del cervelletto) - trichilemmomi (tumore benigno della cute che origina nella parte inferiore della guaina esterna della radice pilifera) - cheratosi acrale - papillomi cutanei - papillomi mucosi Identificata delezione di una base che determina presenza di un codone di stop prematuro nel gene PTEN da qui ora ho la possibilit di effettuare la diagnosi diretta sugli altri individui appartenenti alla stessa famiglia. Signora con carcinoma midollare della tiroide la cui madre stata operata a sua volta di carcinoma della tiroide chiede rischio per i figli di sviluppare la medesima malattia MEN2A(autosomica dominante): sindrome da neoplasie endocrine multiple di tipo 2 (oppure anche carcinoma familiare midollare della tiroide) Dovuta a mutazione del gene del recettore tirosin-kinasi RET: mutazioni a livello di alcune cisteine nel dominio transmembrana/intracellulare. E uno dei pochi casi in cui viene fatta la diagnosi presintomatica anche su minore, perch in questo caso di pu togliere la tiroide e dare la terapia sostitutiva, evitando in questo modo linsorgenza del tumore nei bambini. Quindi, in questo caso, non mi limito a dire che c la probabilit del 50% di averlo trasmesso: faccio diagnosi presintomatica e, nel caso, intervengo.

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Aa

Aa

aa AA

Aa

aa

Carattere autosomico recessivo: in questo caso, importante, oltre alla diagnosi, stabilire con esattezza chi di questi individui realmente portatore (partendo dal rischio di 2/3). Esempio: FIBROSI CISTICA Determinata da gene molto grande, con moltissime mutazioni possibili, pi di mille descritte. Si fa lo screening per le mutazioni pi frequenti, che coprono circa l80%, mentre lanalisi dellintero gene arriva al 98% di sensibilit. In questo modo riduco moltissimo il rischio che lindividuo abbia la mutazione, ma non lo posso mai annullare completamente. Una coppia senza storia familiare ha a priori il rischio di 1/3000 che il rischio della popolazione generale: se si fa il test a entrambi i genitori e risulta negativo per entrambi, il rischio passa a 1/40.000, se uno dei due positivo, il rischio passa a circa 1/370, e in questo caso si pu estendere lanalisi nel gene dellaltro genitore per abbassare ulteriormente il rischio, se invece risultano entrambi positivi per una o pi delle mutazioni pi frequenti, allora il loro rischio sar del 25% (si fa diagnosi prenatale pi accurata di amniocentesi o villocentesi, perch qui ricerco direttamente una mutazione, mentre con le altre due posso individuare unalterazione e non sapere se lindividuo affetto o portatore eterozigote).

Carattere legato allX

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E importante stabilire quali sono le femmine portatrici di un difetto legato al cromosoma x: portatrice obbligata quando il padre ammalato e quando ha almeno un fratello e un figlio con lo stesso difetto, ma in tutti gli altri casi non lo sappiamo. Lindividuo II2 sicuramente portatrice per la distrofia muscolare di Duchenne: devo sapere se anche lindividuo III1 portatore. In questo caso, fondamentale conoscere lo stato di portatrice della ragazza sorella di un individuo malato: il test che viene eseguito e molto veloce, perch il gene della distrofina molto grande e presenta spesso ampie delezioni

tecnica Multiplex PCR Deletion: permette di identificare delezioni di alcune porzioni del gene. Nella stessa provetta vengono amplificati pi esoni di lunghezza diversa dello stesso gene contemporaneamente: i pi piccoli migreranno pi velocemente e i pi grandi pi lentamente sul supporto di gel di agarosio fino ad avere il pattern di migrazione della distrofina (primo individuo di controllo normale). Il secondo individuo presenta delezione dellesone A, mentre il terzo ha delezione degli esoni A e C e il quarto ha deleto lesone C diagnosi rapida Nella diagnosi negli uomini semplice, perch hanno una X sola e quindi le delezioni si vedono subito perch lesone non c del tutto. Nelle donne invece, anche se sono portatrici, laltro cromosoma X sar indenne e quindi avr sempre una banda per ogni esone PCR quantitative permettono di determinare se lamplificazione deriva da due alleli o da uno solo; oppure con la diagnosi indiretta si pu determinare se ha ricevuto dalla madre lo stesso cromosoma malato del fratello. Caso clinico: 35

Genitori sani, non consanguinei Prima figlia deceduta dopo 6 giorni di vita per insufficienza renale (rene policistico) Seconda gravidanza interrotta alla 20 settimana per presenza di reni iperecogeni. RENE POLICISTICO: malattia ereditaria caratterizzata dallo sviluppo di cisti nei dotti collettori. Spesso si associa ad un coinvolgimento epatico. Colpisce 1/40.000 bambini, mentre la prevalenza nella popolazione generale 1/85.000. Patologia grave: la forma delladulto, autosomica dominante, insorge intorno ai 30 anni, mentre le forme recessive pi gravi sono a insorgenza a livello prenatale. L'ecografia prenatale evidenzia reni iperecogeni, dilatati e, nei casi pi gravi, oligoidramnios (condizione patologica propria della gravidanza, caratterizzata dalla diminuzione del liquido amniotico al di sotto di 500 ml). L'insufficienza renale costituisce la maggiore complicazione. Dopo la nascita, oltre alla nefromegalia, sono comuni e spesso gravi l'ipertensione arteriosa e le infezioni delle vie urinarie. Il coinvolgimento epatico pu decorrere in maniera asintomatica o pu manifestarsi con ipertensione portale e infezioni del dotto biliare, con la presenza di colangiti. La funzione epatica si mantiene normale. Il trattamento dell'insufficienza renale terminale consiste nella dialisi e nel trapianto renale. Il gene responsabile di questa forma recessiva PKHD1 (mappa sul braccio corto del cromosoma 6 e contiene pi di 80 esoni e codifica per una proteina, la fibrocistina o poliduttina), trovato in uno dei due genitori, nella madre non so qual la mutazione. Genitori e feto (secondo) sono stati tipizzati con una serie di marcatori sul cromosoma 6:

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Il marcatore D6S1714 non informativo, perch entrambi i genitori sono omozigoti per lallele da 281 basi: tuttavia, la serie degli altri marcatori identificava i due cromosomi (in rosso) che la madre e il padre avevano trasmesso a feto malato, perci la combinazione di quei due cromosomi produce la malattia. In una terza gravidanza, si ricerca sia la mutazione di origine paterna (se manca il feto sicuramente sano), sia la tipizzazione con gli stessi marcatori:

Il padre aveva trasmesso la mutazione, ma questa volta la madre aveva trasmesso il cromosoma sano (cio non quello delle precedenti gravidanze), segnato in nero: il feto sano. combinazione di diagnosi diretta e indiretta: la sola diagnosi diretta in questo caso non disponeva di entrambe le mutazioni per fare diagnosi certe. Il quarto feto ha ricevuto di nuovo i due aplotipi malattia e la gravidanza stata interrotta.

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ECCEZIONI ALLEREDITARIETA MENDELIANA Rottura del dogma:

UN GENE

UNA MALATTIA

ETEROGENEIT GENETICA
SORDIT Retinite Pigmentosa

SERIE ALLELICHE

PENETRANZA INCOMPLETA ESPRESSIVIT VARIABILE INSORGENZA TARDIVA ANTICIPAZIONE

serie di fenomeni che rendono complessa la situazione durante una consulenza genetica Esempio: I

II

III

Due famiglie con genitori sani, in cui i figli presentano una forma di sordit neurosensoriale congenita: i due figli vogliono sapere qual la probabilit per loro di aver un figlio malato. La segregazione nelle due famiglie mostra una patologica autosomica recessiva, quindi la probabilit dei due individui di avere un figlio ammalato dovrebbe essere del 100%. invece hanno 4 figli, tutti che ci sentono perfettamente. 38

Perch? STESSO FENOTIPO, DUE GENOTIPI DIVERSI La consulenza non era errata: il 100% sarebbe corretto se i due individui fossero aa Questi due individui invece hanno un genotipo di questo tipo:
LOCUS A AA LOCUS B bb LOCUS A aa LOCUS B BB

LOCUS A Aa LOCUS B Bb

I figli sono tutti doppi portatori, ma non sono affetti. I due genitori non sono distinguibili dal punto di vista clinico, ma hanno due genotipi diversi. Si parla di ETEROGENEITA GENETICA stessa patologia causata da mutazioni in geni differenti Oggi questo la regola: per alcune malattie, leterogeneit talmente elevata che ci sono pi di 100 geni responsabili (tra cui le sordit e la retinite pigmentosa). Sordit 1:1000 nati presenta sordit In circa 50% di questi pazienti la sordit dovuta a mutazioni in un gene 2/3 presentano una modalit di trasmissione autosomica recessiva 1/3 presentano una modalit di trasmissione autosomica dominante 1-2% sono X-Linked Esistono forme sindromiche, tuttavia la maggior parte delle sordit a trasmissione autosomica recessiva sono non sindromiche Ampia eterogeneit genetica: >40 loci per le forme recessive >40 loci per le forme dominanti diversi loci per le forme X-Linked Recenti acquisizioni: 67% delle sordit AR non sindromiche sono dovute al locus DFNB1 in 13q11-q12 nelle popolazioni dellarea mediterranea. La delezione di una G 35(delG) allinterno di una sequenza contenente 5 G nel gene codificante per la Connessina 26 stata identificata nell80% dei pazienti con sordit al locus DFNB1 39