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Imunohistoqumica Sumrio

Definio....................................................................................................................... 2 Glossrio ....................................................................................................................... 2 Aplicao ...................................................................................................................... 2 Preparo do tecido .......................................................................................................... 3 Fixao...................................................................................................................... 3 Solues fixadoras .................................................................................................... 3 Desidratao e clareamento. ..................................................................................... 3 Incluso. .................................................................................................................... 3 Mtodos Imunohistoqumicos....................................................................................... 4 Recuperao Antignica ............................................................................................... 5 Problemas em imunohistoqumica................................................................................ 5 Mtodos de Bloqueio .................................................................................................... 6 Peroxidase endgena................................................................................................. 6 Fosfatase alcalina endgena...................................................................................... 6 Biotina endgena....................................................................................................... 6 Interaes hidrofbicas e inicas .............................................................................. 7 Controle de Qualidade .................................................................................................. 8 Dos reagentes ............................................................................................................ 8 Controles de qualidade recomendados...................................................................... 8 Apndice ....................................................................................................................... 9 Preparo das Lminas ................................................................................................. 9 Preparo das Solues .............................................................................................. 10 Protocolos.................................................................................................................... 12 Imunoperoxidase indireta........................................................................................ 12 Estreptoavidina Biotina Peroxidase .................................................................. 14

Definio
O termo imunohistoqumica surgiu das palavras: imunologia, histologia e qumica. A imunologia estuda o sistema imunolgico, a histologia estuda tecidos e rgos utilizando-se o microscpio, aps a sua colorao. Para facilitar a observao, diversos tipos de coloraes podem ser usados para identificar diferentes partes de um tecido. O processo de identificar antgenos nos tecidos com anticorpos, atravs de seco corada definido como imunohistoqumica.

Glossrio
Antgeno : qualquer substncia que sob condies apropriadas capaz de estimular a
formao de anticorpos.

Epitopo: o determinante antignico, o stio exato de ligao do anticorpo na


molcula do antgeno.

Biotina: vitamina (vitamina H) de baixo peso molecular (244.3), hidrossolvel,


derivada da dieta e de bactrias intestinais. Pode ser ligada covalentemente a cadeias de aminocidos ou acares de protenas e glicoprotenas.

Avidina: uma glicoprotena bsica com PM de aproximadamente 68.000, obtida a


partir da clara do ovo ocorrendo tambm no oviduto de vrias espcies de pssaros. Molcula quadrivalente, tetrmero com simetria 2:2, cada lado da molcula contendo um par de receptores para a biotina.

Estreptoavidina: obtida a partir do Streptomyces avidinii no contem carboidrato,


possui ponto isoeltrico prximo ao neutro, mantm as propriedades de ligao da avidina sem apresentar, entretanto problemas fsicos indesejveis.

Protena A protena derivada da parede celular do Staphylococcus aureus, que se :


liga (ligao no imunolgica) ao segmento Fc da IgG da maioria dos mamferos (homem, coelho, camundongo, suno e hamster).

HIER : Heat induced retrievel PIER : Protein induced retrievel

Aplicao
Os procedimentos de imunohistoqumica so aplicveis a seces de parafina e criostato, esfregaos e suspenses celulares.

Pr-requisito: o antgeno tecidual deve permanecer insolvel, a estrutura terciria do


antgeno no deve estar alterada para que o stio antignico se ligue ao anticorpo.

Preparo do tecido
Colheita da amostra, clivagem. Preservao do tecido Fixao ou congelamento em nitrognio lquido. Fixao
No h um fixador ideal. O fixador ideal deve preservar a morfologia, a imunorreatividade, prevenir a extrao difuso e deslocamento do antgeno durante as etapas que se seguem fixao e no interferir com as reaes subseqentes na localizao do antgeno.

Solues fixadoras

Aldedicas pontes convalentes


Formaldedo 4-10% Paraformaldedo 4% PLP periodato-lisinaparaformaldedo Glutaraldedo

Alcolicas coagulao de protenas


Carnoy 70% etanol 20% clorofrmio 10% ac.actico glacial. Metacarn 70% metanol 20% clorofrmio 10% ac.actico glacial.

Com adio de metais pesados


Zinco antgenos de membrana Mercrio B5. Ig intracelulares.

,.

Desidratao e clareamento.

A desidratao parece ter pouco efeito na imunorreatividade da maioria dos antgenos. Quanto ao clareamento, os efeitos lesivos acarretados pelo uso do xilol podem ser revertidos com o emprego da tripsina.

Incluso.
No se deve ultrapassar a temperatura de 60C quando da incluso em parafina.

Mtodos Imunohistoqumicos

Ag
P P

Ac

PAP

Biotina
P Peroxidase

Avidina
P

P X

P X

P X P

P X

P X

P X

Direto

Indireto

PAP

A-B-P

ABC

Recuperao Antignica
A fixao em formalina promove ligaes mltiplas entre os grupos aminos e a formao de pontes de metileno entre os vrios aminocidos presentes nos peptdeos de uma determinada protena e desta com as protenas adjacentes. Estas mltiplas ligaes bloqueiam o acesso de anticorpos aos epitopos alvo, mascarando o antgeno. O desmascaramento se refere em geral aos mtodos enzimtico ou com utilizao do calor aplicados com objetivo de melhorar a imunorreatividade dos tecidos. A demonstrao de que a digesto enzimtica por protease melhorava a imunorreatividade dos tecidos por Huang em 1976 ganhou popularidade entre os Laboratrios ao permitir a utilizao de um maior nmero de anticorpos que poderiam ser aplicados aos tecidos processados de maneira rotineira. Como o nmero de anticorpos que se beneficiam com esta tcnica limitado quando comparado ao HIER e sendo tcnica de difcil reprodutibilidade pelas caractersticas empricas na determinao da concentrao, tempo de digesto e tipo de protease aconselhvel otimizar o uso de uma ou no mximo duas proteases. No LPBC a digesto enzimtica feita com o uso de tripsina a 0,1% a 37C, 30min. O HIER primeiro relatado por Shi e cols., 1991 feita em tampo citrato a 0,01M pH6.0 (Catorelli e cols.) em forno de microondas de 450Wats por 10 minutos mantendo uma temperatura constante de 90C.

Problemas em imunohistoqumica
A atividade de enzimas endgenas, a ligao inespecfica de anticorpos a componentes teciduais quer por ligaes hidrofbicas ou interaes inicas constituem as principais causas de colorao de fundo sem especificidade e indesejvel em imunohistoqumica. As principais causas de colorao de fundo so:
Ligao ao receptor FC Presena de Biotina endgena Ligao a lectinas teciduais Reao cruzada inespecfica do Ac quando o epitopo do Ag a ser corado partilhado com outras protenas Difuso do Ag a ser investigado do local de sntese para o tecido circundante Presena do Ag em altas concentraes no plasma perfundindo o tecido anteriormente a sua fixao Ingesto do Ag por fagcitos, resultando em colorao no normalmente observada nestas clulas Injria fsica do tecido causada por dessecao ou por incompleta fixao do tecido Autlise Resduos do meio de embebio, desparafinizao incompleta Contaminao pelo anticorpo secundrio com anticorpos naturais que se ligam de forma inespecfica no tecido Reao cruzada do anticorpo secundrio devido a reao cruzada entre espcies Hiperdigesto por enzimas proteolticas Pigmentos teciduais coloridos similares ao produto final da reao

Mtodos de Bloqueio

Peroxidase endgena

Normalmente ocorre atividade de peroxidase em hemcias, pseudoperoxidase, granulcitos, mieloperoxidase, hepatcitos, sistema nervoso central e tecidos sensveis a estrognio. As peroxidases endgenas, citocromo oxidase e catalase produzem produtos de reao com diaminobenzidina (DAB). Quando do uso de HRP horseradish peroxidase o bloqueio da peroxidase endgena deve ser procedimento de rotina. H vrios mtodos de bloqueio o mais comumente utilizado em cortes parafinados 0,3 a 0,5% de perxido de hidrognio em metanol por 10 a 30 min temperatura ambiente. Como reagentes oxidativos podem danificar o stio antignico preconiza-se realizar o bloqueio da PE aps a incubao com o Ac 1 na tcnica de imunoperoxidase indireta e aps o secundrio quando se utiliza o Ac 2 biotinilado. Um outro excelente bloqueador da PE a azida sdica, utilizada a 0,1% em mistura com 0,3% de H2O2 na soluo tampo remove satisfatoriamente a atividade de mieloperoxidase de granulcitos e de pseudoperoxidase de hemcias. Tambm o mtodo de escolha para materiais criopreservados.

Fosfatase alcalina endgena

A fosfatase alcalina (FA) est amplamente distribuda nos tecidos humanos. Isoenzimas de FA so encontradas em altas concentraes na mucosa intestinal, nos tbulos proximais do rim, em regies calcificadas, na superfcie de clulas endoteliais arteriais e de capilares, nas clulas reticulares do estroma, em neutrfilos, nos linfcitos da zona do manto em seces criopreservadas de linfonodos, bao e tonsilas. O bloqueio efetivo obtido com a adio de Levamisole 1-5mmol/l na soluo substrato da enzima. A fosfatase cida no afetada pelo Levamisole para prevenir esta atividade essencial que o pH da soluo substrato esteja em pH 8.0 ou acima.

Biotina endgena
A biotina vitamina e coenzima encontrada em diversos tecidos, particularmente no fgado, pulmo, bao, tecido adiposo, glndula mamria, rim e crebro. A atividade da BE pode ser suprimida pelo uso de tampes alcalinos, a pr-incubao com avidina ou com leite desnatado. O mtodo mais comumente utilizado a tcnica de supresso pela ligao biotina-avidina.

PBS 2x 5 min Avidina 0,1% 10 min TA Escorrer e rinsar com PBS ou PBS 2x 5 min Biotina 0,01% 10 min TA PBS 2x 5 min

A pr-incubao com avidina permite o bloqueio da BE porque a biotina s capaz de se ligar a uma nica molcula de avidina. A aplicao subseqente de biotina essencial para que se bloqueie receptores livres da avidina no ocupados pela BE.

Interaes hidrofbicas e inicas


Os conjugados de Peroxidase (HRP tipo IV) so protenas bsicas e podem se ligar de modo inespecfico a stios aninicos teciduais. A utilizao de detergentes no inicos (Triton X-100 a 0,5%) ou de protenas inertes tais como soro fetal bovino, soro albumina bovina ao competir com os stios de ligao reduz a absoro inespecfica. As ligaes inespecficas devidas a Interaes hidrofbicas e inicas so mais freqentemente observadas em tecido conjuntivo pela presena de colgeno elastina, laminina e proteoglicanos, epitlio e adipcitos. As ligaes hidrofbicas entre protenas teciduais e anticorpos so influenciadas pela fixao, fixadores aldedicos, pelo Ac 1, Ig so particularmente hidrofbicas e pelo tipo e concentrao inica do tampo. O mtodo mais eficiente de bloquear as interaes hidrofbicas o uso de protena bloqueadora em separado ou junto ao diluente do AC.

Leite desnatado a 10% antes do Ac 1 30 min 37 C

Diluentes para o AC primrio e Secundrio Ac monoclonal BSA a 2% Ac policlonal - Soro normal da espcie do tecido a 10% Caso persista colorao de fundo mesmo aps teste de controle de titulao, intercalar aps o AC 1 incubao por 30 min a TA de soro normal da mesma espcie do AC 2.

Controle de Qualidade
Dos reagentes Do mtodo: controles positivos e negativos.

Controles Negativos
Substituio do Ac 1 por isotipo da mesma espcie Absoro do Ac 1 com o Ag

Controles de qualidade recomendados


Omisso do Ac 1 Substituio do 1 Ac por soro no imune Substituio do 1 Ac por outro Ac dirigido par um Ag diverso ao em estudo Absoro do 1 Ac com o Ag utilizado em sua gerao Incluso no painel de vimetina controle do dano tecidual.

Apndice

Preparo das Lminas


Lavagem das lminas Mergulhar as lminas em soluo de detergente neutro Extran a 0,5% em gua por 30 min. Desprezar o detergente e lavar em gua corrente at completa remoo do detergente (no mnimo por 2 h) Lavar as lminas em gua destilada vrias vezes Colocar as lminas em soluo de HCl 2N por 5 min. Lavar em gua destilada por 1 min Lavar em soluo de HCL 1% em etanol 70% por 5 min Lavar em gua destilada Secar em estufa a 70 Guardar as lminas limpas em caixas para evitar contaminao por poeira.

Poly-L-Lysina Colocar as lminas em soluo de poly-L-lysina (1:10), utilizar recipientes plsticos Secar em estufa a 60 por uma hora ou overnight a TA Guardar as lminas limpas em caixas para evitar contaminao por poeira.

100 ml de Poly-L-lysina / 90 lminas Estocar a soluo diluda em gua deionizada a 2-8 e desprezar caso fique turva.

Silanizao de lminas O APTS (silano) pode causar queimaduras na pele, portanto, o mesmo dever ser manipulado com luvas e com cuidado. Preparar 3 cubas de vidro com tampa, na capela: 1. acetona PA 2. soluo APTS (Sigma A3648) a 4% em acetona 3. acetona PA

10 Silanizao: Imerso das lminas em acetona (cuba 1) por 2 min, esgotar muito bem o excesso de acetona para no diluir a soluo de APTS Imerso em APTS a 4% (cuba 2) por 2 minutos, esgotar bem o excesso Imerso em acetona (cuba3) por 4 vezes, esgotar bem o excesso Secagem em estufa, deixar esfriar e guard-las em caixas. O contedo das cubas 1 e 3 podem ser descartados na pia com gua corrente, o contedo da cuba 2 no dever ser descartado na pia, conservar em recipiente devidamente identificado para posterior descarte.

Preparo das Solues


Tampo PBS Para 1 litro de soluo 1,38g de NaH2 PO4 H2 O 6,96g de K2 HPO4 7,2g de NaCl Dilu-los em 1litro de gua destilada, checar o pH e guardar em geladeira. Tampo TBS Soluo estoque : 6,06g de Tris HCl 1,39g de Tris base 100ml de gua destilada Soluo estoque : Soluo salina de 0,15M: 0,89g de NaCl 100ml de gua destilada Soluo para uso: TBS: 1/10: Diluir 1 parte de TrisHCl pH7.6 em 9 partes de soluo salina 0,15M. Tampo citrato pH 6.0 2,1g de cido ctrico 1000ml de gua destilada, acertar o pH com NaOH 2 M, sero adicionados aproximadamente 13ml de base.

PBS + 2% BSA PBS BSA 10ml 200mg (Bovine serum albumin)

11 Leite desnatado a 10% H2 O d. 100ml Leite 10g PBS + 1% SFB PBS SFB Tripsina Cloreto de clcio 100mg Tripsina 100mg (Sigma cat n. T78128) Cloreto de sdio 900mg H2Od 100ml Tripsina PBS 100mg (Gibco 1:250, cat n. 27250-018) 100mg 100ml 1ml

Hematoxilina de Gill Para 100ml de soluo Hematoxilina Iodato de sdio Sulfato de alumnio.18 H2 O cido actico glacial Etileno glicol Azida sdica H2O destilada 200mg 20mg 1,76mg 2ml 25ml 250ul Completar para 100ml

Tempo de colorao 3 minutos.

DAB (soluo estoque) DAB 25mg (Sigma D5637) H2O d. 10ml

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Protocolos
Imunoperoxidase indireta
Identificao do antgeno HBS Teste de titulao do Ac Primrio Material de estudo: seces de fgado humano fixados em Bouin. Segundo Objetivo: verificar a importncia da titulao do Ac primrio.

Desparafinizao Xilol 3x 10 min cada Acetona pa 5 min Hidratao lcool absoluto 2x de 5 min cada lcool 70% 3 min lcool 50% 3 min lcool 30% 3 min Lavar em gua corrente e destilada rapidamente Lavar em PBS 2x 5min Bloqueio de ligaes inespecficas Leite desnatado a 10% em gua destilada 15 min a TA Anticorpo primrio - IgG de cabra anti-HBSAg (Dako) 1:1000 + soro AB 5% + SFB 1%em PBS - 1h a TA 1:500 + soro AB5% em PBS - 1h a TA Bloqueio da Peroxidase endgena Metanol + 3% de H2 O2 - 10 min TA

13 Lavar em gua destilada 3x Lavar em PBS 2x 5min Anticorpo secundrio anti-IgG de cabra Peroxidase 1:200 + soro AB 10% em PBS - 45 min 37C Lavar em PBS 2x 5min DAB Preparar em frasco escuro. Filtrar na hora de uso Tampo 1000ml DAB (sol estoque) 24 ul H2O2 1ul

14

Estreptoavidina Biotina Peroxidase


Material de estudo : Seces de pata de camundongo infectadas com Leishmania amazonensis. Segundo Objetivo:verificar a importncia do bloqueio da peroxidase endgena.

Desparafinizao Xilol 3x 10 min cada Acetona pa 5 min Hidratao lcool absoluto 2x de 5 min cada lcool 70% 3 min lcool 50% 3 min lcool 30% 3 min Lavar em gua corrente e destilada rapidamente Lavar em PBS 2x 5min Bloqueio de ligaes inespecficas Leite desnatado a 10% em gua destilada 15 min a TA Anticorpo primrio - IgG de coelho anti-L.a (LINC) 1:1000 + soro camundongo normal a 10% em PBS overnight a 4 C Estabilizar a TA 30min Lavar em PBS 2x 5min Anticorpo secundrio anti-IgG de coelho Biotinilada 1: 1.600 + soro camundongo normal a 10% em PBS - 45 min 37C Lavar em PBS 2x 5min Bloqueio da Peroxidase endgena. (NO FAZER EM UMA DAS LMINAS) Metanol + 3% de H2 O2 + 0.1% Azida sdica - 10 min TA

15 Lavar em gua destilada 3x Lavar em PBS 2x 5min Estreptoavidina Peroxidase 1: 2000 em PBS Lavar em PBS 2x 5min

DAB Soluo estoque: 25mg de DAB/10ml de gua destilada. Preparar em frasco escuro. Filtrar na hora de uso. Soluo de uso Tampo 1000ml DAB (sol estoque) 24 ul H2O2 1ul Lavar em gua corrente 5 min e destilada 3x

Contracolorao e Montagem Hematoxilina de Gill 3 min. Filtrar na hora de uso. Lavar em gua corrente 5 min e destilada 3 min. Desidratao lcool absoluto 2x 5 min Clareamento Xilol 2x o ltimo deixar por 5 min Montar em blsamo do Canad diludo em xilol.

e-mail: taniacs@ig.com.br Salvador, 08-10/05/2000