UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE MXICO FACULTAD DE QUMICA QUMICO FARMACUTICO BILOGO MICROBIOLOGA EQUIPO 2: M.B. Jess, M. F.

Janely, T. B. Diana S. y V. R. Carlos C. GRUPO: 62 PERIODO: 2013 FECHA: 19 de febrero de 2013

MICROSCOPIA
BASES DE PTICA GEOMTRICA UTILIZADA EN MICROSCOPIA Los objetos absorben y reflejan la luz de forma distinta dependiendo de sus caractersticas fsicas, como su forma o composicin. El color que percibimos de un objeto es el rayo de luz que rechaza. Nosotros captamos esos rebotes con diferentes longitudes de onda, por medio de los ojos. Si los rayos de luz atraviesan al objeto, este es invisible. Para entender la forma en que los sistemas pticos del microscopio crean imagen es importante saber como funcionan las lentes que forman estos sistemas. Una lente como tal es un cristal transparente que puede formar una imagen ya sea real o virtual al incidir en ella rayos de luz que vienen de un objeto iluminado, Imagen real: es aquella que se forma cuando tras pasar por el sistema ptico, los rayos de luz son convergentes. Esta imagen no la podemos percibir directamente con nuestro sentido de la vista, pero puede registrarse colocando una pantalla. Imagen virtual: La virtualidad de la imagen consiste en que no est all donde se percibe, se forma tan slo sobre la retina y no por fuera del ojo en el sitio donde se ve. El ojo est diseado para recoger haces divergentes de luz y hacerlos converger sobre la retina y para nuestro sentido de la vista los rayos parecen venir desde un punto por el que no han pasado realmente. La imagen se percibe en el lugar donde convergen las prolongaciones de esos rayos divergentes. Las lentes convergentes pueden crear imgenes reales de objetos que se proyectan en una pared, a una distancia donde convergen los rayos de luz que pasan por los puntos focales y el centro de la lenta; las imgenes que forman puede ser: De menor tamao si el objeto se encuentra a mayor distancia que la distancia de dos veces el punto focal

De mismo tamao si el objeto se encuentra a la distancia de dos veces el punto focal De mayor tamao si el objeto se encuentra alejado de la lente en una distancia mayor que la del eje focal pero menor que la de dos veces el punto focal.

Y crea una imagen virtual aumentada cuando el objeto se encuentra a una distancia menor que la del punto focal.

El punto focal de una lente convergente se encuentra en donde coinciden todos los rayos de luz cuando pasan perpendicularmente atreves de ella Resolucin: Se define as la capacidad de un objetivo de poder distinguir la distancia mnima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados. Esta determinada por 4 factores La longitud de onda de la luz incidente: La luz se difracta cuando pasa a travs de pequeas ranuras o cerca del borde de un objeto opaco y emerge como un semicrculo. Cuando dos puntos se encuentran cercanos uno de otro, producen frentes de onda que tienden a unirse y, por tanto, parecen uno solo, El resultado es una prdida de detalle. Una solucin es iluminar el espcimen con una longitud de onda ms corta. El Apertura numrica: Es una medida que indica la capacidad del objetivo de poder captar los rayos refractados por las estructuras finas de las cuales est constituido el objeto que se observa. La apertura numrica de un objetivo se calcula empleando la formula matemtica siguiente: NA = n x sen n representa el ndice de refraccin de la interface que separa el cubreobjetos de la muestra examinada y la lente frontal del objetivo y es la mitad del ngulo de apertura, este ngulo corresponde a la mitad del cono de luz formado desde la muestra hasta la lente del objetivo la mxima abertura que puede alcanzar es de 90 Del objetivo: Cuanto mayor sea la apertura numrica de un objetivo, ste tendr una mayor capacidad de mostrar detalles finos en la imagen que forma. No tiene relacin con el radio de la lente de la lente, pero si interfiere la cercana del objetivo a la muestra a mas cercana mayor ngulo de apertura y por lo tanto mayor apertura numrica. El ndice de refraccin interfiere porque desva los rayos fuera de la lente del objetivo, o lo refleja y entonces no llegan todos los rayos a la lente del objetivo Cuando el cono de luz viaja hacia el objetivo y no tiene un gran ngulo, este pasa al objetivo de forma que los haces de luz estn muy juntos y eso impide que se note separados uno del otro, sin embargo si se logra ampliar mas el cono de luz al punto que abarque en la totalidad la lente del objetivo se identificaran como separado, otro factor es el ndice de refraccin del medio entre el lente y la muestra, a mayor diferencia del ndice de refraccin del medio con la del vidrio de lente y muestra mayor desviacin de los rayos; utilizar un medio con ndice de refraccin similar a los vidrios de la lente y la muestra permite que los rayos conserven su direccin lo que ocasiona que mas rayos entren a la lente del objetivo perfeccionando la imagen Del condensador: Forma un cono de luz a la inversa de cmo se forma el cono de luz entre la muestra y el objetivo, esto ayuda porque mas rayos de luz entran a la muestra y por lo tanto se tendrn mas detalles de la misma (anlogo a incrementar los pixeles de una pantalla); y tambin porque los rayos no entran de forma recta, y al pasar por la muestra se desviaran aun mas por el ndice de refraccin de la muestra incrementando el ngulo del rayo desviado Microscopio: simple y compuesto: Simple: Es una sola lente biconvexa con la cual se permite observar multitud de objetos microscpicos. Est provisto de una lente o sistema de lentes convergentes dispuestas de manera que proporciona una imagen virtual, derecha y mayor que el objeto, que est situado entre la lente y el foco. Su amplificacin es bastante limitada y suele utilizarse para la diseccin de pequeos animales. Este tipo e microscopio tambin se denomina lupa. Pueden ser monoculares o binoculares. Compuesto: Un microscopio compuesto es llamado as porque posee dos o ms sistemas de lentes, uno conocido por objetivo y otro llamado ocular. El sistema de lentes objetivos forma una imagen real de la misma, amplificada. Para lo que necesitan una fuente de luz que se enfoque sobre la muestra la cual ser una tercera lente llamada lente del condensador. Por lo regular los oculares amplan la muestra en 10x. y los lentes objetivos tienen por lo regulara un poder de resolucin de 4 o 5x, 10x, 40x y 100x; siendo capaz de amplificar la imagen de la muestra 40 o 50, 100, 400 y 1000

veces. Por lo tanto la imagen que es apreciada con los ojos tiene un aumento igual al producto de la amplificacin de los dos sistemas de lentes.

Microscopio de campo claro: En campo claro toda la luz desde el espcimen y sus alrededores es colectada por el objetivo para formar una imagen contra un fondo brillante. El campo claro es la forma ms simple de microscopa donde la luz pasa a travs de o reflejada del espcimen. La iluminacin no se altera por aditamentos que cambien las propiedades de la luz (como polarizadores o filtros), utilizando todos los aspectos mencionados. Actualmente el microscopio de campo claro, usando una serie de aditamentos puede ser adaptado para ser usado en cuatro tipos de microscopia: de campo claro, de campo obscuro, la de fluorescencia y la de contraste de fases (cada microscopio ofrece una imagen distintiva y puede emplearse para observar aspectos diferentes de la morfologa microbiana). Adems de que para la fuente de luz ya usan focos led para evitar que las muestras en fresco se sequen o que se descompongan. Microscopia de campo obscuro: Aunque la tincin es un mtodo muy utilizado en microscopia ptica presenta el inconveniente de que mata a las clulas y puede alterar sus propiedades morfolgicas. Existen dos tipos de microscopia ptica que permiten mejorar el contrate sin el empleo de colorantes, la microscopia de contraste de fases y la de campo obscuro. El microscopio de campo obscuro es un microscopio ptico en el que el sistema de iluminacin incide sobre la muestra slo lateralmente. Donde el condensador normal es reemplazado por un condensador de campo negro que no permite a la luz ser transmitida directamente a travs del espcimen hacia el objetivo. Ya que se enfoca un cono hueco de luz sobre la muestra, de manera que no penetren en el objetivo rayos no reflejados y no refractados. La nica luz que es capaz de alcanzar el objetivo es la dispersada por la muestra y, en cons ecuen cia, los microorganismos se observan brillantes sobre un fondo obscuro. Muchas estructuras internas pueden verse en microorganismos eucariotas grandes. La resolucin que se observa en los microscopios de campo obscuro es bastante alta y en ellos puede observarse objetos difcilmente percibidos por microscopia de fondo claro o de contraste de fases. Incluso se emplea para identificar bacterias como Treponema pallidum, que presentan un dimetro tan pequeo que difcilmente pueden visualizarse mediante un microscopio de campo claro. La microscopia de fondo obscuro es tambin un mtodo excelente para observar la movilidad en los microorganismos, ya que esta tcnica permite observar los bordes celulares y los flagelos. Ejemplos: Saccharomyces cerevisiae Paramecium

MICROSCOPIO CONTRASTE DE FASES El microscopio de contraste de fases es empleado para clulas vivas no teidas; y habitualmente se utiliza en investigacin por que permite la observacin de montajes en hmedo donde las clulas permanecen viables. Fue introducido en 1936 por el matemtico holands Frits Zernike y se basa en el hecho de que las clulas poseen un ndice de refraccin (que es un factor que

retrasa la luz cuando se atraviesa la muestra). La luz que pasa atreves de una clula esta, por tanto en una fase distinta de la que atraviesa el medio. Este pequeo efecto se amplifica mediante un dispositivo especial situado en la lente objetivo del microscopio de contraste de fases que se denomina anillo de fases, dando lugar a la formacin de una imagen obscura sobre un fondo brillante. El anillo incluye una placa de fases, que representa la aportacin esencial de Zernike y que amplifica las variaciones de las fases. Cuanto mayor es el ndice de refraccin de las clulas, mayor es el retardo de longitud de onda. La microscopia de contraste de fases es especialmente til para detectar componentes bacterianos, como endosporas y cuerpos de inclusin que contiene poli-b-hidroxibutirato, polimetafosfato, azufre u otras sustancias. MICROSCOPIO DE FLORESCCENCIA El microscopio de florescencia se utiliza para visualizar muestras capaces de emitit florescencia, es decir, capaces de emitir una determinada longitud de onda cuando ndice sobre ellas una longitud de onda menor. La florescencia puede deberse a que algunas clulas poseen sustancias fluorescentes naturales como la clorofila u otros compuestos fluorescentes. La microscopia de florescencia se usa habitualmente en los diagnsticos clnicos microbiolgicos as como en ecologa microbiana para enumerar bacterias en medios naturales o en suspensiones celulares. acterias en medios naturales o en suspensiones celulares. Aberraciones Hay varios tipos de distorsiones, que incluyen las aberraciones cromtica y de esfericidad y de curvatura de campo, que se presentan en la microscopia de pequeo aumento como resultado de las propiedades de las lentes. La distorsin de la imagen sucede cuando el sistema de lentes del microscopio falla en enfocar la imagen del espcimen en un mismo plano. La luz que pasa por los lentes es refractada o desviada y en teora, la luz paralela que entra a las lentes biconvexas deber ser enfocada en un solo punto, el punto focal de las lentes. La aberracin cromtica resulta del hecho de que la luz con varias longitudes de onda se refracta ligeramente de manera diferente cuando pasa a travs de lentes biconvexas Las lentes del microscopio no deben actuar como prismas, por lo que es esencial que dichas lentes sean corregidas para este tipo de distorsin. La aberracin cromtica ha sido corregida en las lentes acromticas y apocromticas usando lentes en varias capas construidas con diferentes tipos de cristales. La aberracin cromtica tambin se puede disminuir usando luz monocromtica, es decir, de una sola longitud de onda. La aberracin de esfericidad ocurre cuando la luz que pasa por la porcin delgada de una lente biconvexa no se enfoca exactamente en el mismo plano que cuando la luz pasa por la parte ms ancha de ella, lo que hace evidente por la prdida de contraste en la imagen. Este tipo de defecto en la imagen se ha corregido bastante en las lentes apocromticas usando lentes cncavas para compensar la refraccin diferencial y enfocar la luz un mismo plano. Los rayos de luz deben ser enfocados en un solo plano para que la imagen que se obtenga en el campo microscpico sea clara, y esto es un defecto importante en muchas lentes de microscopios. Otro defecto que puede surgir de la aberracin de esfericidad, es llamado distorsin y ocurre cuando la imagen formada por los rayos de luz perifrica se unen en un plano diferente a los de la imagen formada por los rayos de luz axiles. As, la amplificacin de la imagen varia con la distancia del eje de las lentes, produciendo distorsin arica o en barril de la imagen El astigmatismo est relacionado con la distorsin y ocurre cuando las lentes tienen aumentos diferentes en varios acimuts. Tanto la distorsin como el astigmatismo alteran la imagen de tal manera que no corresponde al aspecto real del espcimen. La curvatura de campo es otro defecto en el que se produce una imagen curva de un campo plano debido a que las porciones marginales del campo microscpico enfocan en un plano diferente al de la porcin central del campo. Este defecto se presenta aun en los ms finos objetivos apocromticos y generalmente se reduce usando oculares compensadores. Este tipo de oculares corrigen los defectos residuales en la imagen que forman los objetivos que dan como resultado la curvatura de campo. Los objetivos planoapocromticos reducen de manera importante la curvatura de campo microscpico. Los objetivos planocromticos de campo plano tambin se encuentran en el mercado, estas lentes se usan en muchos de los microscopios para estudiantes. Microscopia electrnica:

El advenimiento del microscopio electrnico marc un avance muy significativo sobre los microscopios pticos para la visualizacin de microorganismos. Muchas de las estructuras ms pequeas que conforman a los microorganismos han podido ser aclaradas mediante el uso del microscopio electrnico. Con ste se obtiene mejor resolucin, con lo cual, se pueden obtener mucho mayores amplificaciones que con el microscopio ptico. Hay dos tipos bsicos de microscopios electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin (MET) donde las lentes son electromagnticas y todo el sistema funciona a alto vaci y el microscopio electrnico de barrido (MEB) Microscopio electrnico de transmisin: es similar al microscopio compuesto, excepto que un haz electrnico se sustituye por una fuente luminosa y una serie de electroimanes se sustituye por las lentes (foto de electrnico de transmisin). La fuente de los electrones es un filamento de tungsteno caliente en un can electrnico. Los electrones son disparados por el filamento y acelerados como un fino haz electrnico que pasa por el nodo mediante un alto voltaje que se establece entre el filamento y el nodo. EL haz electrnico se enfoca sobre el espcimen mediante una lente electromagntica condensadora al variar la corriente hacia los lentes. En lugar de colocar al espcimen en un portaobjetos, normalmente se coloca en una malla de cobre dentro de la columna del microscopio electrnico que est libre de aire. El microscopio electrnico de transmisin tiene un objetivo, como el microscopio ptico, pero en lugar de un lente ocular, el MET tiene una lente proyector que dispone la imagen sobre una pantalla de observacin fluorescente o placa fotogrfica, lo cual es necesario porque el haz de electrones no se puede ver directamente. En un microscopio electrnico se ha suprimido el aire de la ruta del haz de electrones para prevenir choques con molculas gaseosas que lo dispersaran, haciendo imposible resolver una imagen de gran aumento.. Adems, al quitar el aire se reduce el calor asociado al haz de electrones, disminuyendo la destruccin de especmenes biolgicos a su paso, y del filamento, que de no ser as, se deterioran rpidamente. El MET permite una resolucin mucho mayor y as amplificaciones tiles ms grandes que con el microscopio ptico debido a que la longitud de onda del haz de electrones, generada en alto voltaje acelerado, es mucho ms corta que la luz en el alcance ptico debido a la longitud de onda del haz de electrones La microscopia electrnica de transmisin sirve para estudiar todo tipo de materiales siempre y cuando cuenten con la preparacin adecuada y tengan dimensiones dentro del rango nanomtrico o incluso sub-micromtrico. Por sus caractersticas, es una herramienta importante para la caracterizacin estructural de materiales nanoestructurados, de los cuales se puede obtener no solo informacin morfolgica, sino tambin cristalogrfica y de composicin qumica con la ayuda de la espectroscopia de dispersin de energa de rayos-X (EDS). En la modalidad de STEM es posible hacer estudios de dispersin de partculas y mapeos qumicos. Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible, pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas. Las partes principales de un microscopio electrnico de transmisin son: Can de electrones, que emite los electrones que chocan o atraviesan el espcimen (dependiendo que tipo de microscopio electrnico es), creando una imagen aumentada. Lentes magnticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios pticos no funcionan con los electrones. Sistema de vaco es una parte muy importante del microscopio electrnico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, se debe hacer un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas caractersticas. Placa fotogrfica o pantalla fluorescente que se coloca detrs del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser un ordenador.

El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra.

Microscopa electrnica de barrido. Es usada cuando en una muestra slo se pretende estudiar las estructuras externas de un organismo no son necesarios los cortes ultrafinos, pudindose realizar la observacin de las clulas intactas o de los componentes celulares de modo directo por el microscopio electrnico de transmisin tras una tcnica denominada tincin negativa En la microscopia de barrido, la muestra a estudiar, se recubre primero con una fina capa de un metal pesado como el oro. El haz de luz de electrones de este instrumento barre la superficie de la muestra y los electrones desviados por la capa de metal se recogen y proyectan sobre una pantalla para producir una imagen. En este microscopio se pueden observar muestras de cierto tamao y la profundidad de campo es excelente. Adems, permite obtener un amplio rango de aumentos desde 15 hasta 100,000 veces, pero slo se puede ver la superficie de los objetos. Las micrografas electrnicas tomadas por el microscopio electrnico de transmisin o por el de barrido proporcionan imgenes en blanco y negro. La microscopa electrnica de barrido es una tcnica que sirve para analizar la morfologa de materiales slidos de todo tipo (metales, cermicos, polmeros, biolgicos, etc.), con excepcin de muestras lquidas. La resolucin nominal del equipo es de 3 nm lo cual permite estudiar caractersticas de los materiales a una escala muy pequea. Este microscopio cuenta con la tcnica de espectroscopa de Dispersin de Energa (EDS) que sirve para hacer anlisis elemental. Con esta tcnica se pueden detectar todos los elementos qumicos con nmero atmico mayor a 4 de manera cualitativa y semicuantitativa. Una de las grandes ventajas respecto a otro tipo de microscopa es la facilidad de preparacin de muestras ya que slo en casos especiales se puede tornar laboriosa. Un MEB moderno consta esencialmente de las siguientes partes: Una unidad ptica-electrnica, que genera el haz que se desplaza sobre la muestra. Un portamuestra, con distintos grados de movimientos. Una unidad de deteccin de las seales que se originan en la muestra, seguida de un sistema de amplificacin adecuado. Un sistema de visualizacin de las imgenes ( tubo de rayos catdicos ). Un sistema de vaco, un sistema de refrigeracin y un sistema de suministro elctrico, relativamente similares a los del MET. Un sistema de registro fotogrfico, magntico o de video. Un sistema de procesamiento de la imagen con ayuda computacional ( optativo ). TABLA DE TIPOS DE MICROSCOPIO
Tipo de microscopio. De campo claro. Magnificacin. 1,000 a 2,000 Apariencia de la muestra. Teida o sin teir, las bacterias generalmente se tien para mejorar su contraste contra el fondo. Para bacterias sin teir, las cuales aparecen con brillo contra el fondo obscuro. Fluorescente. Aplicaciones. Para examinar la morfologa morfolgica de las bacterias, levaduras, algas y protozoarios. Para situaciones donde los altos contrastes son requeridos, particularmente para las estructuras microbianas (los bordes y los flagelos o cilios) Para tcnicas de diagnostico donde la tcnica de tincin fluorescente (anticuerpos) se fija al organismo que identifica. obscuros luminosos Para el estudio minucioso de las estructuras celulares y de los detalles de las clulas vivas. Para la exanimacin atmica de las estructuras celulares y de los virus que no se pueden observar con el microscopio de luz.

De campo obscuro.

1,000 a 2,000

De fluorescencia.

1,000 a 2,000

De contraste de fases.

1,000 a 2,000

Electrnico.

100,000 o mayor

Grados de contraste (contrastes positivos) o (contrastes negativos). Se ve en la pantalla.

REFERENCIAS Microscopia ptica Microscopio de campo claro Consultado el 15 de febrero de 2013[Disponible en]

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