Calibracion de Un Cromatografo e HPLC

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PROCEDIMIENTO QU- 004 PARA LA CALIBRACIN EQUIPOS DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
Edicin digital 1
Este procedimiento ha sido revisado, corregido y actualizado, si ha sido necesario. La presente edicin se emite en formato digital. Hay disponible una edicin en papel que se puede adquirir en nuestro departamento de publicaciones. Este procedimiento de calibracin es susceptible de modificacin permanente a instancia de cualquier persona o entidad. Las propuestas de modificacin se dirigirn por escrito, justificando su necesidad, a cualquiera de las siguientes direcciones: Correo postal Centro Espaol de Metrologa C/ del Alfar, 2, 28760 Tres Cantos, Madrid Correo electrnico cem@cem.es
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MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO
NDICE Pgina 1. 2. 3. 4. OBJETO ........................................................................................... 4 ALCANCE ......................................................................................... 4 DEFINICIONES ................................................................................ 4 GENERALIDADES ......................................................................... 15 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 5. Abreviaturas ............................................................................ Principios cromatogrficos ...................................................... Calibracin .............................................................................. Mtodo de la interpolacin entre dos puntos .......................... 15 17 20 21
DESCRIPCIN ................................................................................ 22 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. Equipos y materiales............................................................... Operaciones previas ............................................................... Proceso de calibracin............................................................ Toma y tratamiento de datos .................................................. 23 24 27 29
6.
RESULTADOS................................................................................ 31 6.1. Clculo de incertidumbres....................................................... 31 6.2. Interpretacin de resultados.................................................... 39
7. 8.
REFERENCIAS .............................................................................. 42 ANEXOS ......................................................................................... 42 Anexo. Ejemplo numrico ............................................................... 43
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1. OBJETO
El presente procedimiento tiene por objeto describir uno de los posibles mtodos para la calibracin de Equipos de Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin (HPLC), para su uso posterior en determinaciones cuantitativas, de analitos.
2. ALCANCE El presente procedimiento es de aplicacin a cromatgrafos de lquidos, usados para la realizacin de determinaciones cuantitativas y cuya calibracin se realice mediante el mtodo de interpolacin entre dos puntos. Este procedimiento se deber aplicar exclusivamente concentraciones comprendidas dentro de un rango de trabajo lineal. a
Este procedimiento solo es vlido para analitos presentes en disoluciones que puedan ser inyectadas en un cromatgrafo de lquidos. Para la realizacin de determinados anlisis puede ser necesarias pruebas adicionales de validacin que garanticen que no existe influencia de la matriz en la determinacin. No se incluyen en este procedimiento otras operaciones necesarias para confirmar el correcto funcionamiento del equipo y que en algunos casos van unidas al tipo de detector empleado (verificacin instrumental).
3. DEFINICIONES Calibracin [3] (2.39) Operacin que bajo condiciones especificadas establece, en una primera etapa, una relacin entre los valores y sus incertidumbres de
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medida asociadas obtenidas a partir de los patrones de medida, y las correspondientes indicaciones con sus incertidumbres asociadas y, en una segunda etapa, utiliza esta informacin para establecer una relacin que permita obtener un resultado de medida a partir de una indicacin. NOTA 1 Una calibracin puede expresarse mediante una declaracin, una funcin de calibracin, un diagrama de calibracin, una curva de calibracin o una tabla de calibracin. En algunos casos, puede consistir en una correccin aditiva o multiplicativa de la indicacin con su incertidumbre correspondiente. NOTA 2 Conviene no confundir la calibracin con el ajuste de un sistema de medida, a menudo llamado incorrectamente autocalibracin, ni con una verificacin de la calibracin. NOTA 3 Frecuentemente se interpreta que nicamente la primera etapa de esta definicin corresponde a la calibracin. Coeficiente de Variacin Relacin entre la desviacin tpica y el valor absoluto esperado:
CV = s x
Desviacin tpica experimental [1] (B.2.17) Para una serie de n mediciones de un mismo mensurando, la magnitud s que caracteriza la dispersin de los resultados, dada por la frmula:
s=
(x
n i =1
n 1
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siendo x i el resultado de la i-sima medicin y x la media aritmtica de los n resultados considerados.

NOTAS 1. Considerando la serie de n valores como muestra de una distribucin, x es 2 un estimador insesgado de la media , y s es un estimador insesgado de la varianza de dicha distribucin.
2
2.
La expresin s
n es una estimacin de la desviacin tpica de la
distribucin de x y se denomina desviacin tpica experimental de la media. 3. La desviacin tpica experimental de la media en ocasiones se denomina, incorrectamente, error de la media.
Detector Elemento del cromatgrafo que suministra una seal, en general, proporcional a la concentracin de la especie de inters (analito); existen diferentes tipos: Detectores de Absorbancia Ultravioleta con monocromadores. Detectores de Absorbancia en el infrarrojo. Detectores de Fluorescencia. Detectores de ndice de Refraccin. Detectores de Dispersin de Luz. Detectores Electroqumicos. Detectores por Espectrometra de Masas. Incertidumbre de medida [3] (2.26)
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Parmetro no negativo que caracteriza la dispersin de los valores atribuidos a un mensurando, a partir de la informacin que se utiliza NOTA 1 La incertidumbre de medida incluye componentes procedentes de efectos sistemticos, tales como componentes asociadas a correcciones y a valores asignados a patrones, as como la incertidumbre debida a la definicin. Algunas veces no se corrigen los efectos sistemticos estimados y en su lugar se tratan como componentes de incertidumbre. NOTA 2 El parmetro puede ser, por ejemplo, una desviacin tpica, en cuyo caso se denomina incertidumbre tpica de medida (o un mltiplo de ella), o una semiamplitud con una probabilidad de cobertura determinada. NOTA 3 En general, la incertidumbre de medida incluye numerosas componentes. Algunas pueden calcularse mediante una evaluacin tipo A de la incertidumbre de medida, a partir de la distribucin estadstica de los valores que proceden de las series de mediciones y pueden caracterizarse por desviaciones tpicas. Las otras componentes, que pueden calcularse mediante una evaluacin tipo B de la incertidumbre de medida, pueden caracterizarse tambin por desviaciones tpicas, evaluadas a partir de funciones de densidad de probabilidad basadas en la experiencia u otra informacin. NOTA 4 En general, para una informacin dada, se sobrentiende que la incertidumbre de medida est asociada a un valor determinado atribuido al mensurando. Por tanto, una modificacin de este valor supone una modificacin de la incertidumbre asociada. Material de referencia [3] (5.13) Material suficientemente homogneo y estable con respecto a propiedades especificadas, establecido como apto para su uso previsto en una medicin o en un examen de propiedades cualitativas
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NOTA 1 El examen de una propiedad cualitativa comprende la asignacin de un valor a dicha propiedad y de una incertidumbre asociada. Esta incertidumbre no es una incertidumbre de medida. NOTA 2 Los materiales de referencia con o sin valores asignados pueden servir para controlar la precisin de la medida, mientras que nicamente los materiales con valores asignados pueden utilizarse para la calibracin o control de la veracidad. NOTA 3 Los materiales de referencia comprenden materiales que representan tanto magnitudes como propiedades cualitativas. EJEMPLO 1 Ejemplos de materiales de referencia que representan magnitudes: a) agua de pureza declarada, cuya viscosidad dinmica se emplea para la calibracin de viscosmetros. b) suero humano sin valor asignado a la concentracin de colesterol inherente, utilizado solamente como material para el control de la precisin de la medida. c) tejido de pescado con una fraccin msica determinada de dioxina, utilizado como calibrador. EJEMPLO 2 Ejemplos de materiales de referencia que representan propiedades cualitativas: a) carta de colores mostrando uno o ms colores especificados. b) ADN conteniendo una secuencia especificada de nucletido. c) orina conteniendo 19-androstenediona. NOTA 4 Algunas veces un material de referencia se incorpora a un dispositivo fabricado especialmente. EJEMPLO 1 Sustancia de punto triple conocido en una clula de punto triple. EJEMPLO 2 Vidrio de densidad ptica conocida, en un soporte de filtro de transmitancia. EJEMPLO 3 Esferas de granulometra uniforme montadas en un portamuestras de microscopio.
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NOTA 5 Algunos materiales de referencia tienen valores asignados que son metrolgicamente trazables a una unidad de medida fuera de un sistema de unidades. Tales materiales incluyen vacunas a las que la Organizacin Mundial de la Salud ha asignado Unidades Internacionales (UI). NOTA 6 En una medicin dada, un material de referencia puede utilizarse nicamente para calibracin o para el aseguramiento de la calidad. NOTA 7 Dentro de las especificaciones de un material de referencia conviene incluir su trazabilidad, su origen y el proceso seguido (Accred. Qual. Assur.:2006). NOTA 8 La definicin segn ISO/REMCO es anloga, pero emplea el trmino proceso de medida para indicar examen (ISO 15189:2007, 3.4), el cual cubre tanto una medicin de la magnitud como el examen de una propiedad cualitativa. Material de referencia certificado (MRC) [3] (5.14) Material de referencia acompaado por la documentacin emitida por un organismo autorizado, que proporciona uno o varios valores de propiedades especificadas, con incertidumbres y trazabilidades asociadas, empleando procedimientos vlidos. EJEMPLO Suero humano, con valores asignados a la concentracin de colesterol y a la incertidumbre de medida indicados en un certificado, empleado como calibrador o como material para el control de la veracidad de la medida. NOTA 1 La documentacin mencionada se proporciona en forma de certificado (vase la Gua ISO 31:2000). NOTA 2 Procedimientos para la produccin y certificacin de materiales de referencia certificados pueden encontrarse, por ejemplo, en las Guas ISO 34 e ISO 35.
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NOTA 3 En esta definicin, el trmino incertidumbre se refiere tanto a la incertidumbre de la medidacomo a la incertidumbre del valor de la propiedad cualitativa, tal como su identidad y secuencia. El trmino trazabilidad incluye tanto la trazabilidad metrolgica del valor de la magnitud como la trazabilidad del valor de la propiedad cualitativa. NOTA 4 Los valores de las magnitudes especificadas de los materiales de referencia certificados requieren una trazabilidad metrolgica con una incertidumbre de medida asociada (Accred. Qual. Assur.:2006). NOTA 5 La definicin de ISO/REMCO es anloga (Accred. Qual. Assur.:2006) pero utiliza el calificativo metrolgica tanto para una magnitud como para una propiedad cualitativa. Matriz Conjunto de sustancias que acompaan a un analito en una muestra concreta. Se caracteriza por un nombre que indica el tipo de producto (ej. vino, leche, etc.). Patrn de medida [3] (5.1) Realizacin de la definicin de una magnitud dada, con un valor determinado y una incertidumbre de medida asociada, tomada como referencia. EJEMPLO 1 Patrn de masa de 1 kg, con una incertidumbre tpica asociada de 3 g. EJEMPLO 2 Resistencia patrn de 100 , con una incertidumbre tpica asociada de 1 . EJEMPLO 3 Patrn de frecuencia de cesio, con una incertidumbre tpica relativa asociada de 2 x 10-15. EJEMPLO 4 Electrodo de referencia de hidrgeno, con un valor asignado de 7,072 y una incertidumbre tpica asociada de 0,006.
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EJEMPLO 5 Serie de soluciones de referencia, de cortisol en suero humano, que tienen un valor certificado con una incertidumbre de medida. EJEMPLO 6 Materiales de referencia con valores e incertidumbres de medida asociadas, para la concentracin de masa de diez protenas diferentes. NOTA 1 La realizacin de la definicin de una magnitud dada puede establecerse mediante un sistema de medida, una medida materializada o un material de referencia. NOTA 2 Un patrn se utiliza frecuentemente como referencia para obtener valores medidos e incertidumbres de medida asociadas para otras magnitudes de la misma naturaleza, estableciendo as la trazabilidad metrolgica, mediante calibracin de otros patrones, instrumentos o sistemas de medida. NOTA 3 El trmino realizacin se emplea aqu en su sentido ms general. Se refiere a tres procedimientos de realizacin, El primero, la realizacin stricto sensu, es la realizacin fsica de la unidad a partir de su definicin. El segundo, denominado reproduccin, consiste, no en realizar la unidad a partir de su definicin, sino en construir un patrn altamente reproducible basado en un fenmeno fsico, por ejemplo el empleo de lseres estabilizados en frecuencia para construir un patrn del metro, el empleo del efecto Josephson para el volt o el efecto Hall cuntico para el ohm. El tercer procedimiento consiste en adoptar una medida materializada como patrn. Es el caso del patrn de 1 kg. NOTA 4 La incertidumbre tpica asociada a un patrn es siempre una componente de la incertidumbre tpica combinada (vase la Gua ISO/IEC 98-3:2008, 2.3.4) de un resultado de medida obtenido utilizando el patrn. Esta componente suele ser pequea comparada con otras componentes de la incertidumbre tpica combinada. NOTA 5 El valor de la magnitud y de su incertidumbre de medida deben determinarse en el momento en que se utiliza el patrn.
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NOTA 6 Varias magnitudes de la misma naturaleza o de naturalezas diferentes pueden realizarse mediante un nico dispositivo, denominado tambin patrn. NOTA 7 En el idioma ingls, algunas veces se utiliza la palabra embodiment (materializacin) en vez de realization. NOTA 8 En ciencia y tecnologa, el vocablo ingls standard se usa con dos significados distintos: como una norma, especificacin, recomendacin tcnica o documento escrito similar, y como un patrn de medida (en el idioma francs talon). Este vocabulario se refiere nicamente al segundo significado. NOTA 9 El trmino patrn se utiliza a veces para designar otras herramientas metrolgicas, por ejemplo un programa de medida patrn (software patrn). (Vase ISO 5436-2). Patrn de medida de trabajo [3] (5.7) Patrn utilizado habitualmente para calibrar o verificar instrumentos o sistemas de medida NOTA 1 Un patrn de trabajo se calibra habitualmente con relacin a un patrn de referencia. NOTA 2 Un patrn de trabajo utilizado en verificacin se designa tambin como patrn de verificacin o patrn de control. Repetibilidad de medida [3] (2.21) Precisin de medida bajo un conjunto de condiciones de repetibilidad. Condicin de repetibilidad de una medicin [3] (2.20) Condicin de medicin, dentro de un conjunto de condiciones que incluye el mismo procedimiento de medida, los mismos operadores, el mismo sistema de medida, las mismas condiciones de operacin y el
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mismo lugar, as como mediciones repetidas del mismo objeto o de un objeto similar en un periodo corto de tiempo NOTA 1 Una condicin de medicin es una condicin de repetibilidad nicamente respecto a un conjunto dado de condiciones de repetibilidad. NOTA 2 En qumica, el trmino condicin de precisin intra-serie se utiliza algunas veces para referirse a este concepto. Resolucin de la Columna [4] Medida cuantitativa de la capacidad de una columna para separar dos analitos. Se define como Rs:
Figura 1. Resolucin de la columna de un cromatgrafo

Rs = 2 [(t R )B (t R )A ] (w A + w B )
Con un valor Rs > 1,5, se permite la separacin completa de dos componentes Tiempo de Retencin [4]
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Tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hasta que el pico de concentracin del analito alcanza el detector. Sirve para diferenciar analitos.
Figura 2. Tiempo de retencin. Trazabilidad metrolgica [3] (2.41) Propiedad de un resultado de medida por la cual el resultado puede relacionarse con una referencia mediante una cadena ininterrumpida y documentada de calibraciones, cada una de las cuales contribuye a la incertidumbre de medida NOTA 1 En esta definicin, la referencia puede ser la definicin de una unidad de medida, mediante una realizacin prctica, un procedimiento de medida que incluya la unidad de medida cuando se trate de una magnitud no ordinal, o un patrn. NOTA 2 La trazabilidad metrolgica requiere una jerarqua de calibracin establecida. NOTA 3 La especificacin de la referencia debe incluir la fecha en la cual se utiliz dicha referencia, junto con cualquier otra informacin metrolgica relevante sobre la referencia, tal como la
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fecha en que se haya realizado la primera calibracin en la jerarqua. NOTA 4 Para mediciones con ms de una magnitud de entrada en el modelo de medicin, cada valor de entrada debiera ser metrolgicamente trazable y la jerarqua de calibracin puede tener forma de estructura ramificada o de red. El esfuerzo realizado para establecer la trazabilidad metrolgica de cada valor de entrada debera ser en proporcin a su contribucin relativa al resultado de la medicin. NOTA 5 La trazabilidad metrolgica de un resultado de medida no garantiza por s misma la adecuacin de la incertidumbre de medida a un fin dado, o la ausencia de errores humanos. NOTA 6 La comparacin entre dos patrones de medida puede considerarse como una calibracin si sta se utiliza para comprobar, y si procede, corregir el valor y la incertidumbre atribuidos a uno de los patrones.
4. GENERALIDADES 4.1. Abreviaturas b CMR CVMAX

CVy I
1
Ordenada en el Origen. Concentracin del Material de Referencia Certificado (valor del Certificado). Coeficiente de Variacin mximo. Coeficiente de Variacin de la prueba realizada con 10 medidas, para el patrn 1.
CVy I
2
Coeficiente de Variacin de la prueba realizada con 10 medidas, para el patrn 2.
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EL HPLC m Rs
sy sy
1
Error de lectura producido por la operacin de enrase. Cromatgrafos de Lquidos de Alta Resolucin. Pendiente. Resolucin de la columna. Desviacin tpica de la seal del patrn 1. Desviacin tpica de la seal del patrn 2. Desviacin tpica de la seal del patrn 1, obtenida inicialmente y usada para estimar la incertidumbre de repetibilidad cuando no se realiza un nmero de repeticiones suficiente.
sy l
1
sy l
2
Desviacin tpica de la seal del patrn 1, obtenida inicialmente y usada para estimar la incertidumbre de repetibilidad cuando no se realiza un nmero de repeticiones suficiente.
VC VF1 VF2 VI1 VI2 VM xm
Volumen asignado por la clase. Volumen Final de la Dilucin para el patrn 1. Volumen Final de la Dilucin para el patrn 2. Volumen Inicial de la Dilucin para el patrn 1. Volumen Inicial de la Dilucin para el patrn 2. Volumen medido. Concentracin del analito en la muestra.
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x1 x2 ym
y1
y1
ACT
Concentracin del patrn 1. Concentracin del patrn 2. Respuesta del analito en la muestra. Respuesta del equipo correspondiente al patrn 1. Respuesta del equipo en el momento de la
calibracin, para el patrn 1.

y2
Respuesta del equipo correspondiente al patrn 2. Respuesta del equipo en el momento de la
y 2ACT
calibracin, para el patrn 2.
i
ef
Grados de libertad de cada componente. Grados efectivos de libertad de la magnitud de salida.
4.2. Principios Cromatogrficos La cromatografa agrupa un conjunto importante y diverso de mtodos, que permite separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. En todas las separaciones cromatogrficas, la muestra se disuelve en una fase mvil, que en este caso (HPLC) es un lquido, y cuya nica funcin es transportar el analito a travs de la columna. Esta fase mvil se hace pasar a travs de una fase estacionaria inmiscible, que es una fase lquida inmovilizada sobre la superficie de un slido inerte, que se mantiene fija sobre una columna. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la
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muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la estacionaria. Aquellos componentes que son retenidos con fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente a travs de la columna, debido al flujo de la fase mvil; por el contrario, los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Las caractersticas principales de esta tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y su gran aplicabilidad. Existen diferentes tipos de cromatografa de lquidos: Cromatografa de Reparto. Cromatografa de Adsorcin. Cromatografa Inica. Cromatografa de Exclusin por Tamaos o en Geles. Se elige cada tipo a utilizar en funcin de las caractersticas qumicas del analito a determinar. Los componentes principales de un cromatgrafo de lquidos son: Lquidos portadores y sistemas para el tratamiento de los disolventes. Sistemas de bombeo. Sistema de Inyeccin de la Muestra. Columnas. Detectores.
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Sistema de procesamiento de seal y tratamiento de datos. A continuacin se indica un esquema bsico de los instrumentos que componen un cromatgrafo de lquidos:
DISOLVENTES Sistema de Mezcla y Almacenamiento
SISTEMA DE BOMBEO Y CONTROL DEL CAUDAL
COLUMNA
IN YECTOR
SISTEMA DE ADQ UISICIN DETECTOR Y TRATAMIENTO DE DATOS
Figura 3. Esquema bsico de los instrumentos que componen un cromatgrafo de lquidos La cromatografa se puede emplear para la identificacin cualitativa (que no es objeto de este procedimiento) y para la determinacin cuantitativa de los analitos separados. La cromatografa en columna cuantitativa se basa en la comparacin de la altura, o del rea, del pico del analito con la producida por una o ms disoluciones del analito de concentracin conocida.
NOTA: Se entiende por especie la sustancia o in de inters que puede ser separada en la columna y detectada por el detector elegido. En general en HPLC siempre se utiliza como magnitud el rea de la seal.
4.3. Calibracin La caracterstica principal en estos equipos es la medida de una magnitud fsica que es transformada en una seal elctrica y registrada en el sistema de registro y tratamiento de datos. Esta seal en unas condiciones determinadas (temperatura, tiempos de retencin, etc.), se puede relacionar con un parmetro qumico (concentracin, etc.) de una especie determinada. Debido a esto, en estos equipos se realiza una operacin consistente en obtener la respuesta dada por el equipo al medir una serie de muestras de valor conocido (Material de Referencia Certificado) y obtener la relacin entre respuesta y concentracin; esta operacin es una calibracin a la que se denominar Calibracin Indirecta. Este tipo de calibracin rene unas determinadas caractersticas: a. No es nica para el equipo, sino que se realiza por parmetro. b. Requiere evaluar si la relacin obtenida es satisfactoria para el uso previsto del equipo. c. Al verse afectada por otros factores puede requerir, en determinadas ocasiones no de forma rutinaria, el empleo de materiales de referencia especiales (de matriz similar a las muestras) Entre los diferentes tipos de calibraciones indirectas que son posibles realizar, se pueden citar: Interpolacin entre dos puntos.
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Recta de Calibrado. Funcin de Calibrado. Mtodo de Adiciones. Estndar Interno con recta. Estndar Interno con punto nico.
En este procedimiento se ha optado por elegir el mtodo de interpolacin entre dos puntos. 4.4. Mtodo de la interpolacin entre dos puntos Este mtodo para el anlisis cromatogrfico cuantitativo implica la utilizacin de dos disoluciones de Materiales de Referencia Certificados (patrones). A continuacin se obtienen los cromatogramas de los patrones y se representan las alturas o reas de pico en funcin de la concentracin. La seleccin de la seal frente a la que se representa la concentracin (reas o alturas), se determina a partir de las caractersticas de ambas: Altura de pico Medida desde la base hasta la parte superior. Es un parmetro fcilmente medible, pero tiene como inconveniente que es muy sensible a las variaciones de una serie de parmetros, entre los que estn: velocidad de la fase mvil, velocidad de inyeccin, etc. rea de pico
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Su medida es ms complicada, pero con los equipos dotados de integradores electrnicos se puede obtener resultados muy reproducibles. Depende en menor medida de los parmetros que afectaban a las alturas de pico, aunque dependiendo del tipo de detector pueden producirse desviaciones. Depender de la reproducibilidad y linealidad del inyector, y de las del detector. La representacin de los datos de cada patrn debera originar una lnea recta. Siendo cada uno de los patrones un punto de la misma:
y 1 = m x1 + b y 2 = m x2 + b
siempre que la relacin respuesta/concentracin se mantenga en el intervalo definido entre las concentraciones x1 y x2. A partir de esta suposicin se pueden calcular los valores de m y b, partiendo de los valores de los parmetros experimentales (y1, y2, x1, x2). Conocidas la pendiente (m) y la ordenada en el origen (b) a partir de los valores de la seal obtenidos para los patrones (sistema de ecuaciones anterior), del valor de seal obtenido en el anlisis de la muestra (ym), se podr obtener su concentracin como:
xm =
ym b m
5. DESCRIPCIN A continuacin se indican, de una forma general, las consideraciones a tener en cuenta sobre los equipos, los Materiales de Referencia y los reactivos que participan en las actividades de calibracin de
Cromatgrafos de Lquidos, as como las operaciones necesarias, para llevar a cabo dicha actividad.
5.1. Equipos y Materiales Cromatgrafo de Lquidos Equipos auxiliares (columnas, detectores, inyectores automticos, etc.), utilizados junto con el cromatgrafo y caractersticos del analito a determinar. Mezclas de disolventes adecuados, para utilizarlos como fase mvil, con calidad cromatogrfica. Si es necesario utilizar agua deber ser de calidad ultrapura o qumicamente pura. Material Volumtrico calibrado: Pipetas clase A. Micropipetas con repetibilidad y exactitud suficiente al menos 2 % de ambas. Matraces Aforados clase A. Microjeringas (si el cromatgrafo de lquidos carece de inyector automtico). Debern definirse volumen y caractersticas de exactitud y precisin Balanza analtica, con una resolucin de 0,1 mg (slo si los materiales de referencia o los patrones utilizados en la interpolacin deben ser pesados). Disolvente, adecuado al parmetro a ensayar, libre de impurezas que puedan afectar a la respuesta del equipo en los tiempos de retencin del analito y patrones (generalmente
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pureza cromatogrfica), para realizar las diluciones de los patrones si fuera necesario. Soluciones de un Material de Referencia Certificado de una concentracin conocida del analito a determinar. Dicha concentracin debe incluir el rango en el que se esperan determinar las muestras. La separacin entre ellas debe ser tal que se mantenga la linealidad de la recta. Como criterio aproximado se podra indicar que la relacin entre ellas no sea mayor de 10.
NOTA: La disolucin de concentracin adecuada puede ser preparada a partir de un material de referencia de concentracin superior, por diluciones adecuadas utilizando el material volumtrico descrito. La disolucin puede contener solo un analito o una mezcla de varios.
Cpsulas o viales portamuestras Manual/es de instrucciones o procedimiento/s de uso y mantenimiento de los equipos, sus partes y/o accesorios. 5.2. Operaciones previas Antes de iniciar la calibracin se realizarn las siguientes operaciones previas: 5.2.1. Control de condiciones ambientales Dadas las caractersticas constructivas y funcionales del equipo, esta calibracin se realizar siempre en el laboratorio, y no requiere en general condiciones ambientales particulares, pudiendo desarrollarse en el intervalo comprendido entre 18 C y 28 C. En todo caso debern consultarse las condiciones indicadas en el manual de uso del equipo.
NOTA:
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Determinados detectores pueden requerir un control de las variaciones de temperatura ms severas.
5.2.2.
Elaboracin de patrones de calibracin Se realizaran a partir del Material de Referencia Certificado, haciendo las diluciones que sean necesarias para que la concentracin se encuentre incluida en el rango de determinacin. Las diluciones se prepararn justo antes de realizar la calibracin. Estas disoluciones podrn estar preparadas previamente, si el laboratorio posee evidencias que demuestran que la concentracin preparada no vara con el tiempo de almacenamiento. Se deber confirmar que el material de referencia cumple los requisitos de trazabilidad adecuados y definidos, y que su periodo de caducidad no ha sido sobrepasado. Se asegurar que el material de referencia se encuentra a temperatura ambiente. En el caso de conservacin en nevera, se atemperar antes de usarlo por un periodo de al menos 2 horas.
NOTA: Si los compuestos son voltiles no se esperar a atemperar y todas las preparaciones se realizarn por pesada, para minimizar posibles errores por volatilizacin del compuesto de inters.
5.2.3.
Puesta en marcha del equipo Debern tenerse en cuenta las indicaciones del fabricante. En general y para la puesta en marcha del equipo se seguirn los siguientes pasos: a. Apertura de las botellas de los gases (helio, hidrgeno, etc.), indicados en el ensayo a realizar. b. Encendido del equipo y del software.
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c. Apertura de los manmetros de presin de los gases, y regulacin. d. Estabilizacin durante un periodo de 20 minutos a 30 minutos. e. Conectar o comprobar los detectores ultravioleta, fluorescencia, etc. f. Colocacin de la columna adecuada para el ensayo, si anteriormente no estaba colocada. g. Seleccin de la temperatura del horno de columnas. h. Comprobacin del circuito neumtico. i. Estabilizacin de todo el sistema durante 15 minutos. j. Bombear agua por todo el sistema hasta eliminar totalmente cualquier residuo de materia orgnica. k. Bombear 200 ml de agua de calidad HPLC con un caudal de 5 ml/min. l. Pasar finalmente de 30 ml a 50 ml de metanol, acetonitrilo o disolvente apropiado. m. Regulacin del gas portador (helio, etc.). n. Comprobar la presin de la columna. o. Inyectar un patrn de calibracin, calcular el rea y altura de pico y compararlo con los obtenidos en das anteriores (opcional, para confirmar el correcto estado del detector antes de su uso).
NOTA: Algunos pasos pueden ser eliminados si el equipo permanece en marcha habitualmente
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Si surgiera cualquier cuestin, consultar el manual del equipo o la ayuda del software, o bien ponerse en contacto con el servicio tcnico del equipo. Una vez realizados estos pasos se puede comenzar la secuencia de anlisis en el cromatgrafo de lquidos. Las condiciones de trabajo durante la calibracin, deben ser las mismas que las que posteriormente se utilizarn en las medidas de las muestras sometidas al ensayo para el cual se est calibrando el equipo. 5.3. Proceso de calibracin 5.3.1. Seleccin de los parmetros instrumentales Mediante comprobacin de las condiciones de trabajo (temperatura del inyector, temperatura de la columna, parmetros del detector empleado -longitud de onda, temperatura, etc.-, caudal bombeado, volumen de inyeccin, velocidad de flujo), as como las condiciones reflejadas en el software del equipo. 5.3.2. Fijacin de las condiciones de procesamiento de la seal Seleccin del tipo de respuesta: rea o altura. Seleccin del modo de integracin. Seleccin del umbral mnimo para considerar la existencia de seal y proceder a integracin. 5.3.3. Acondicionamiento del equipo Mediante el anlisis de un blanco, constituido por una alicuota del disolvente utilizado para la realizacin de los patrones.
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5.3.4.
Comprobacin de la ausencia de seal Despus del anlisis del blanco. La ausencia de seal en la prctica consiste en el establecimiento por parte del laboratorio de un intervalo de tolerancia. En caso contrario repeticin del anlisis, hasta la obtencin de un valor de referencia adecuado.
5.3.5.
Realizacin del anlisis A continuacin se analiza cada una de las dos disoluciones patrn (Material de Referencia Certificado).
NOTA: El rango de concentraciones de estas disoluciones fijar el rango de determinacin de la concentracin del analito.
5.3.6.
Comprobacin del cromatograma Confirmando: a) La aparicin de picos en los tiempos de retencin esperados. b) La resolucin de la columna entre picos es siempre superior a 1,5. c) La forma de los picos es adecuada, no presentando colas o artefactos (desviaciones de la forma gaussiana del pico). d) Si la integracin se realiza automticamente, la ventana seleccionada ha sido adecuada y los criterios establecidos se han respetado. e) En caso de integracin manual proceder a la realizacin de la misma.
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Anotacin de los datos requeridos (apartado 5.4). 5.3.7. Repeticin del anlisis Repeticin del anlisis de las disoluciones patrn el nmero de veces estipulado, para ello realizar los pasos indicados en 5.3.5. y 5.3.6. En general es aconsejable realizar 10 repeticiones. 5.3.8. Obtencin de la pendiente y ordenada en el origen A partir de las ecuaciones (3) y (4) del apartado 5.4., se calcular la pendiente y la ordenada en el origen. 5.4. Toma y tratamiento de datos 5.4.1. Toma de datos Para garantizar la trazabilidad de las medidas realizadas durante la calibracin, es necesario registrar y evaluar las actividades llevadas a cabo, adems de los resultados obtenidos. Para ello es conveniente disponer de formatos de registros adecuados (registros manuales o informticos), donde como mnimo debern registrarse los siguientes datos: Parmetro objeto de la calibracin (analito). Equipo a calibrar (cromatgrafo). Equipos (balanza) y material volumtrico (si se trata de material individual -micropipetas-) utilizados para la elaboracin de los patrones y estndares internos. Lotes de los Materiales de Referencia Certificados.
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Respuestas obtenidas del equipo, durante el anlisis de los patrones y clculos realizados con ellas para la determinacin de la pendiente y ordenada en el origen. Fecha. Analista. Se deben conservar obtenidos o al menos: todos los cromatogramas
Condiciones Instrumentales. Respuestas del equipo. Tiempos de Retencin. Sistemas de Integracin e intervalo de tiempos usado en cada pico ventana de integracin- (en el caso de integracin por reas). Adems se deber registrar cualquier otro dato que se considere necesario para asegurar la trazabilidad y reproducibilidad del proceso. 5.4.2. Tratamiento de datos El mtodo de calibracin mediante la utilizacin de la interpolacin entre dos puntos, es un caso de calibracin indirecta, donde se relaciona la respuesta del equipo frente a la concentracin de una serie de muestras/patrones. Con los datos obtenidos se calcular la pendiente y la ordenada en el origen que se utilizar posteriormente para la cuantificacin del compuesto.
y 1 = m x1 + b
(1)
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y 2 = m x2 + b m= y 2 y1 x 2 x1
(2) (3)
b=
x 2 y 1 x1 y 2 x 2 x1
(4)
Las concentraciones de los patrones se obtienen a partir de las del Material de Referencia Certificado mediante diluciones, utilizando las siguientes expresiones:
x1 = CMR
VI
VF VI
(5)
x2 = CMR
VF
(6)
6. RESULTADOS 6.1. Calculo de Incertidumbre Para realizar el clculo de incertidumbre en la calibracin del cromatgrafo de lquidos, hay que tener en cuenta cuales son las principales fuentes de error durante la calibracin. Algunas de ellas se indican a continuacin:
Variaciones de los resultados de las medidas experimentales de reas o alturas. Incertidumbre en la concentracin, debidos a la variabilidad de los operadores en el enrase. Incertidumbre de la concentracin del Material de Referencia.
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Incertidumbre debida a la diferencia de los volmenes de las distintas unidades del material volumtrico utilizadas.
NOTA: Pueden ser otras si se realizan pesadas.
La asignacin y expresin de incertidumbres se realizar siguiendo los criterios de la Gua para la expresin de la Incertidumbre [1] y de la Gua EA-4/02 [2]. En nuestro caso las magnitudes de entrada y salida sern: Magnitud de Salida
m = f( y 2 , y1 , VF2, VF1, CMR, VI2, VI1) Magnitudes de Entrada

Magnitud de Salida
b = g( y 2 , y1 , VF2, VF1, VI2, VI1) Magnitudes de Entrada

A partir de las expresiones (3) y (4) y suponiendo que los patrones se preparan por dilucin de un nico Material de Referencia Certificado (caso habitual), sustituyendo los trminos se obtiene:
m=
(y
CMR VI VF VI VF
2 1 1
y 1 ) VF VF
2
(7)
b=
6.1.1.
VI VF y 1 VI VF y 2
2
(V
I2
VF VI VF
1 1
(8)
Ley de la propagacin de las incertidumbres
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Aplicando la ley de propagacin de las incertidumbres, teniendo en cuenta que todas las magnitudes que quedan en la frmula son independientes y no estn correlacionadas:
VF2 VF1 2 2 um = u y 2 CMR VI VF VI VF 2 1 1 2
+ u2 y1
2 2
VF2 VF1 CMR VI VF VI VF 2 1 1 2
V VI (y 2 y1) F1 2 2 + uVF C V V V V 2 I 2 F1 I1 F2 MR
2
+ u2 VF1
2
V VI (y 2 y1) F2 1 C V V V V I 2 F1 I1 F2 MR
2
+
2
(9)
(y 2 y1) VF VF 2 2 1 + uCMR 2 CMR VI VF VI VF 2 1 1 2
+ u2 VI 2
V 2 VF (y 2 y1 ) F1 2 + C V V V V 2 MR I 2 F1 I1 F2
V 2 VF (y 2 y1 ) 2 F2 1 + uVI 1 C V V V V I 2 F1 I1 F2 MR
)2
2
2 ub
2 uVI 2
VF VF VI (y 2 y 1 ) 2 1 + u2 1 VF1 V V V V 2 I1 F2 I2 F1
VI VI VF (y 2 y 1 ) 2 + 1 2 V V V V 2 I1 F2 I2 F1
2 + u y1
VF1 VI2 VI VF VI VF 1 1 2 2
2 + uV I1
2
VF VF VI (y 1 y 2 ) 2 2 + 1 V V V V 2 I2 F1 I1 F2
(10)
VI VI VF (y 1 y 2 ) 2 1 + u2 + uVF 1 2 y2 2 V V V V 2 I1 F2 I2 F1
VF2 VI1 VI VF VI VF 1 1 2 2
6.1.2.
Clculo de las componentes de la incertidumbre a. Incertidumbre de la respuesta La respuesta (y1 e y2) ha sido estimada como media de una serie de resultados (n). a.1. Su incertidumbre se calcular segn una estimacin de tipo A, en funcin de la desviacin tpica experimental:
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2 uy =
1
2 sy
n
2 sy
2
(11)
2 uy =
2
(12)
2 s y1 =
n 1 y1 y 1 n 1 j =1 j
(13)
2 sy2 =
n 1 y2j y 2 n 1 j =1
(14)
a.2. Si el nmero de repeticiones n, ha sido pequeo (menor que 10 e incluso 1), pero se dispone de un valor de s y l y sy l obtenido inicialmente para 10
1 2
medidas, se realizar una estimacin de las incertidumbres basndose en el siguiente esquema: se calcularan los coeficientes de variacin de cada patrn:
CVy I =
1
sy I
1
y1
(15)
CVy I =
1
sy I
2
y2
(16)
Y se obtendr el mximo de los dos (CVMAX), calculndose a continuacin:

2 uy =
1
2 CVMAX y 12
ACT
n
2 2 CVMAX y 2
ACT
(17)
2 uy =
2
(18)
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a.3. El laboratorio deber evaluar que los coeficientes de repetibilidad de la seal obtenidos inicialmente se mantienen con el paso del tiempo, repitiendo peridicamente las mismas pruebas de anlisis de patrones. No se ha tenido en cuenta la resolucin de la integracin de la seal porque en general la variabilidad de la seal es mucho mayor que la resolucin y por tanto esta no influye. No se ha tenido en cuenta la deriva de la seal entre dos medidas, debido a que se realizan consecutivamente.
NOTA: El laboratorio debe seleccionar condiciones instrumentales y rangos de concentracin que garanticen que la variabilidad de la seal es mucho mayor que la resolucin, esto se consigue con seguridad, en la prctica, a partir de seales superiores a 1000. Otras posibles contribuciones no se han tenido en cuenta al tratarse de una calibracin indirecta, que no da como resultado un valor de correccin igual en todos los laboratorios, sino una relacin que es la existente en este momento y para este equipo. El laboratorio deber evaluar que los coeficientes de repetibilidad de la seal obtenidos inicialmente se mantienen con el paso del tiempo, repitiendo peridicamente las mismas pruebas de anlisis de patrones.
b. Incertidumbre de la Concentracin del Material de Referencia Certificado Ser la obtenida del certificado del Material de Referencia, teniendo en cuenta el factor de cobertura k que lo acompaa:
uC =
MR
UC
MR
(19)
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NOTA: 1. En caso de que no se utilizase el valor certificado del MRC, adems habra que sumar a la incertidumbre expandida al final la correccin no realizada. 2. El general, la deriva del MRC debera haber sido evaluada e incluida en la incertidumbre declarada (segn normativa internacional). En caso de que se albergaran dudas, sera necesario estimar un lmite mximo de variacin entre el valor actual y el certificado y dividirlo por 3 , combinando cuadrticamente este valor con UCMR/k para obtener uCMR. 3. En general las incertidumbres debidas a la influencia de la temperatura en la densidad de la disolucin se considerarn despreciables.
c. Incertidumbre de volumen Su clculo depender de como se hayan controlado los equipos utilizados. En el caso de que se hayan verificado comprobando que sus marcas de enrase cumplen las tolerancias de clase establecidas para el material volumtrico (o cualquier otra establecida por el laboratorio) y que se usen habitualmente realizando una sola medida.
VM = VC + EL
(20)
NOTA: La verificacin consiste en comprobar que el error ms la incertidumbre es menor que la tolerancia.
Se aplica a los dos patrones, tanto al volumen inicial (VI1, VI2) como al final (VF1, VF2). De donde:
2 2 2 uV = uV + uE
M C L
(21)
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c.1. Incertidumbre del volumen de cada unidad Se considera que cualquier unidad que haya sido comprobada cumple el intervalo de clase en cualquier momento de su vida til, por lo que se tomar la tolerancia de la clase como un intervalo mximo, y aplicando la distribucin rectangular:
uV =
C
Tolerancia 3
(22)
c.2. Incertidumbre del error de lectura Se realizarn experimentos en el propio laboratorio para establecer un error mximo de enrase en las condiciones de uso, y se calcular la incertidumbre aplicando una distribucin rectangular, de anchura EMAX, y de valor central 0:
uE =
L
EMAX 3
(23)
c.3. No se tendrn en cuenta otras componentes como: Deriva, ya que en general para el material volumtrico usado en condiciones normales (sin lquidos agresivos, ni cambios de temperatura), se considera despreciable frente a las debidas a las diferencias entre unidades. Variacin del volumen por la temperatura: se ha despreciado este trmino teniendo en cuenta su escasa influencia (del orden de 10-4 del volumen medido) respecto del resto de los trminos.
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6.1.3.
Clculo de la incertidumbre expandida De acuerdo a lo indicado en las ecuaciones (9) y (10), se calcular la incertidumbre tpica de la pendiente (um) y de la ordenada en el origen (ub). Para calcular la incertidumbre expandida, se deber evaluar el nmero de grados de libertad de cada una de las componentes con el fin de conocer el factor de cobertura k utilizado, para calcular la incertidumbre expandida que corresponde a la probabilidad de cobertura de aproximadamente el 95 %:
Um = um k
(24)
El valor de k depender de los grados de libertad efectivos de u m , que dependen a su vez de los grados de libertad de las dems componentes, segn la expresin:
ef =
u 4( y ) N ui4 ( y )
(25)
i =1
Los grados efectivos de cada componente dependen del sistema de estimacin establecido.
Seal (y) ha sido obtenido a partir de la desviacin tpica de una distribucin normal estimada a partir de 10 repeticiones, obtenida en el momento o inicialmente. Concentracin de material de referencia (CMR) importada de un certificado, que dispone de su k correspondiente.
A partir del k del certificado se pueden conocer los grados de libertad efectivos segn la tabla 1:
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ef k
3 3,31
4 2,87
5 2,65
6 2,52
7 2,43
8 2,37
10 2,28
20 2,13
50 2,05
2,00
13,97 4,53
Tabla 1
Componentes de volumen: Han sido obtenidos de distribuciones rectangulares. Si estas se han obtenido asegurando que con un alto lmite de fiabilidad los lmites de variacin establecidos no se sobrepasan, se considera que los grados de libertad son infinitos.
NOTA: En condiciones habituales donde el k del Material de Referencia Certificado es 2, el documento EA-4/02 [2] en su apartado 5 permite el uso de k = 2 para el clculo de la incertidumbre de m y de b, siempre que se cumplan condiciones de normalidad y fiabilidad, que suponen que haya ms de tres magnitudes con una contribucin similar, y que las contribuciones de tipo A hayan sido evaluadas con al menos 10 repeticiones.
6.2. Interpretacin de resultados
Si la calibracin se realiza en el mismo momento que los anlisis, podra (opcionalmente) evaluarse mediante el establecimiento de tolerancias para los trminos Um/m y Ub/m, que influyen en la incertidumbre de medida de la muestra. Dichas tolerancias dependern de los valores de incertidumbre que desee el laboratorio. En caso contrario deber evaluarse si la relacin entre la pendiente y la ordenada en el origen actual y la precedente ha superado una tolerancia especificada (seleccionada por el laboratorio) y debe estudiarse su influencia en los resultados anteriores, debido a la prdida o aumento de sensibilidad de equipo. En general se aconseja que la calibracin se realice en cada uso.
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PENDIENTE (m)
Magnitud Estimacin Media de 10 o n repeticiones Media de 10 o n repeticiones Volumen Nominal Incertidumbre Tpica Coeficiente de Sensibilidad
CMR (VI VF VI VF
2 1 2 1 1
Grados de Libertad
y2 y1
CV y 2 n
ACT
VF VF
) )
CV y 1 n
ACT
CMR (VI VF VI VF
2 1 2 1 1
VF VF
VC
Tolerancia 3
VF2 VI (y 2 y 1 )
1
F2
CMR VI VF VI VF
2 1 1
( ( ( (
) ) ) )
EL
F2
E MAX 3
Tolerancia 3
VF2 VI (y 2 y 1 )
1 2
CMR VI VF VI VF
2 1 1
VC
F1
Volumen Nominal
VF2 VI (y 2 y 1 )
2 1
CMR VI VF VI VF
2 1 1
EL
F1
E MAX 3
U k
Tolerancia 3
VF2 VI (y 2 y 1 )
2 1
CMR VI VF VI VF
2 1 1
Correspondiente a k
CMR
Valor Certificado
(y 2 y1 ) VF VF
2 CMR VI VF VI VF
2 1 1
(
1
VC
I2
Volumen Nominal
VF2 VF (y 2 y 1 ) CMR VI VF VI VF
2 1 1
( ( ( (
) ) ) )
EL
I2
E MAX 3
Tolerancia 3
VF2 VF (y 2 y 1 )
1 2
CMR VI VF VI VF
2 1 1
VC
I1
Volumen Nominal
VF2 VF (y 2 y 1 )
2 1
CMR VI VF VI VF
2 1 1
EL
I1
E MAX 3
VF2 VF (y 2 y 1 )
2 1
CMR VI VF VI VF
2 1 1
Tabla 2
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ORDENADA EN EL ORIGEN (b)

Magnitud Estimacin Volumen Nominal Incertidumbre Tpica
Tolerancia 3
Coeficiente de Sensibilidad
VF VF VI (y 2 y 1 )
Grados de Libertad
VC
I2
(V
1 1
I2
VF VI VF
1 1
EL
VC
I2
E MAX 3
Tolerancia 3
VF VF VI (y 2 y1 )
(V
1
I2
VF VI VF
1 1
F1
Volumen Nominal
VI VI VF (y 2 y 1 )
(V (V
1
I2
VF VI VF
1 1
) )
EL
F1
E MAX 3
CV y 1 n
Tolerancia 3
ACT
VI VI VF (y 2 y 1 )
2 2
I2
VF VI VF
1 1
y1
Media de 10 o n repeticiones Volumen Nominal
(V
(V
1
VF VI
1 1
I2
VF VI VF
1
)
2
VC
VF VF VI (y 1 y 2 )
2 2
I1
I2
VF VI VF
1 1
) )
)
)
EL
VC
I1
E MAX 3
Tolerancia 3
VF VF VI (y 1 y 2 )
(V
1
I2
VF VI VF
1 1
F2
Volumen Nominal
VI VI VF (y 1 y 2 )
(V
1
I2
VF VI VF
1 1
EL
F2
E MAX 3
CV y 2 n
ACT
VI VI VF (y 1 y 2 )
(V
1
I2
VF VI VF
1 1
y2
Media de 10 o n repeticiones
(V
VF VI
2 1
I2
VF VI VF
1
Tabla 3
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7. REFERENCIAS
[1] [2] [3]
Gua para la Expresin de la Incertidumbre de Medida. CEM. Segunda edicin en espaol, 2000. Gua EA-4/02. Expression of the Uncertainty of Measurement in Calibration. Edicin 2. EA. 1999. Vocabulario Internacional de Metrologa. Conceptos fundamentales y generales, y trminos asociados (VIM). 3 edicin en espaol 2008. D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman. Principios de anlisis Instrumental. Quinta Edicin. McGraw-Hill, 2000.
[4]
8. ANEXOS
En este capitulo se recoge en un anexo un ejemplo numrico detallado.
Pgina 42 de 48
ANEXO Ejemplo Numrico
Se proceder a realizar la calibracin de un cromatgrafo de lquidos mediante el mtodo de la interpolacin entre dos puntos, para obtener los valores de la pendiente (m) y la ordenada en el origen (b):
m=
(y 2 y1 ) VF
CMR VI2 VF1 VI1 VF2
VF1
) b = (V
2
VI VF y 1 VI VF y 2
1 1 2
I2
VF VI VF
1 1
Los valores de concentraciones de los patrones, que establecen el rango donde se podrn medir las muestras son 0,1 mg/l y 0,5 mg/l. En este caso se considera que se pueden realizar 10 repeticiones:
N REP. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MEDIA ( y ) DESVIACIN TPICA (sy) COEFICIENTE DE VARIACIN INICIAL (CVI) y1 166 817 172 379 168 728 171 356 166 426 169 414 169 426 167 625 169 425 170 214 169 181 1 885,725 0,011 46 (*) y2 509 491 502 127 495 892 500 314 506 328 504 123 499 326 501 318 504 325 506 318 502 956,2 3 972,728 0,007 898
(*) El coeficiente de variacin as marcado, corresponde al mximo (CVMAX) de entre los dos patrones.
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Todo ello corresponde a la aplicacin de las siguientes frmulas:
yj
y=
j =1
sy =
n 1 yj y n 1 j =1
CVI =
sy y
Posteriormente se obtienen los valores de y1 e y2 actuales, como media de tres repeticiones:

y1ACT y2ACT
Rep. 1 Rep. 2 Rep. 3

MEDIA CV
189 889 191 260 190 126

190 425 0,003 8
498 862 499 254 497 762

498 626 0,001 55
Dado que los coeficientes de variacin (CV) son menores que los del primer da, se sustituyen por la CVMAX = 0,011 46 De donde:
U y1 =
190425 0,01146 3
U y2 =
498626 0,01146 3
MATERIAL DE REFERENCIA
Concentracin Inicial (CMR) Incertidumbre Factor de cobertura (k)
10 mg/l 0,2 mg/l 2
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DILUCIN
VALOR NOMINAL (ml) VOLUMEN INICIAL 1 VOLUMEN FINAL 1 VOLUMEN INICIAL 2 VOLUMEN FINAL 2 1 100 5 100 CLASE (ml) 0,005 0,08 0,01 0,08 ENRASE (ml) 0,01 0,5 0,05 0,5
Con los datos recogidos hasta el momento se completarn las tablas 2 y 3 indicadas en el apartado 6.1.3. del presente procedimiento. Sustituyendo los trminos indicados por valores numricos:
PENDIENTE (m)
MAGNITUD ESTIMACIN y2 y1 502 956,2 169 181
2
UTPICA 1 256,29 596 318 0,046 0,289 0,046 0,289 0,1 0,006 0,029 0,003 0,006
COEFICIENTE GRADOS CONTRIBUCIN DE DE TPICA SENSIBILIDAD LIBERTAD 2,5 3 140,72 9 -2,5 -1 490,80 9 10 430,475 10 430,475 -2 086,095 -2 086,095 -83 443,8 -208 609,5 -208 609,5 208 609,5 208 609,5 481,76 3 011,02 -96,36 -602,20 8 344,4 -1 204,41 -6 022,03 602,20 1 204,41
VCF
100 0 100 0 10 5 0 1 0
EL
F2
VC
F1
EL VC
F1
CMR
I2
EL
I2
VC
I1
EL
I1
Pgina 45 de 48
Se tendr en cuenta que dado que el factor Material de Referencia es k = 2, y lo indicado la 6.1.3., el factor de cobertura utilizado ser 2, siguientes datos finales de la calibracin del lquidos:
PENDIENTE (m) VALOR (m) INCERTIDUMBRE COMBINADA (um) INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (Um) ORDENADA EN EL ORIGEN (b)
MAGNITUD ESTIMACIN UTPICA 0,006 0,028 0,046 0,289 596,32 0,003 0,006 0,046 0,289 1 256,29
de cobertura del nota del apartado obtenindose los cromatgrafo de
834 438 11 441,78 22 883,56
COEFICIENTE GRADOS CONTRIBUCIN DE DE TPICA SENSIBILIDAD LIBERTAD 20 860,95 20 860,95 1 043,05 1 043,05 1,25 -104 304,75 -104 304,75 -1 043,05 -1 043,05 0,25 120,44 602,20 48,176 301,10 745,398 -301,10 -602,10 -48,176 -301,10 314,07 9 9
VC
I2
5 0 100 0 169 181 1 0 100 0 502 956,2
EL
I2
VC
F1
EL
F1
y1
VC
I1
EL
I1
VC
F2
EL
F2
y2
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Se tendr en cuenta que dado que el factor de cobertura del Material de Referencia es k = 2, y lo indicado la nota del apartado 6.1.3., el factor de cobertura utilizado ser 2.
NOTA: Si se calculan los grados de libertad se obtiene un valor de 79 que corresponde a un valor de k = 2,00.
Se obtienen los siguientes datos finales de la calibracin del cromatgrafo de lquidos:

ORDENADA EN EL ORIGEN (b) VALOR (b) INCERTIDUMBRE TPICA COMBINADA (ub) INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (Ub) 85 737,2 1 292,55 2 585,10
La incertidumbre expandida de medida se ha obtenido multiplicando la incertidumbre tpica de medicin por el factor de cobertura k = 2 que, para una distribucin normal, corresponde a una probabilidad de cobertura de aproximadamente del 95 %.
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NIPO: 706-09-005-2
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Calibracion de Un Cromatografo e HPLC

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09

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

RESULTADOS................................................................................ 31 6.1. Clculo de incertidumbres....................................................... 31 6.2. Interpretacin de resultados.................................................... 39

REFERENCIAS .............................................................................. 42 ANEXOS ......................................................................................... 42 Anexo. Ejemplo numrico ............................................................... 43

Procedimiento QU-004. Edicin digital 1

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

Procedimiento QU-004. Edicin digital 1

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

Procedimiento QU-004. Edicin digital 1

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

siendo x i el resultado de la i-sima medicin y x la media aritmtica de los n resultados considerados.

n es una estimacin de la desviacin tpica de la

Procedimiento QU-004. Edicin digital 1

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

Procedimiento QU-004. Edicin digital 1

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

Procedimiento QU-004. Edicin digital 1

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

Procedimiento QU-004. Edicin digital 1

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

Procedimiento QU-004. Edicin digital 1

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

Procedimiento QU-004. Edicin digital 1

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

Figura 1. Resolucin de la columna de un cromatgrafo

Procedimiento QU-004. Edicin digital 1

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

Procedimiento QU-004. Edicin digital 1

MINISTERIO DE INDUSTRIA, TURISMO Y COMERCIO

4. GENERALIDADES 4.1. Abreviaturas b CMR CVMAX

Coeficiente de Variacin de la prueba realizada con 10 medidas, para el patrn 2.

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VC VF1 VF2 VI1 VI2 VM xm

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calibracin, para el patrn 1.

Respuesta del equipo correspondiente al patrn 2. Respuesta del equipo en el momento de la

calibracin, para el patrn 2.

Grados de libertad de cada componente. Grados efectivos de libertad de la magnitud de salida.

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DISOLVENTES Sistema de Mezcla y Almacenamiento

SISTEMA DE BOMBEO Y CONTROL DEL CAUDAL

SISTEMA DE ADQ UISICIN DETECTOR Y TRATAMIENTO DE DATOS

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Determinados detectores pueden requerir un control de las variaciones de temperatura ms severas.

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