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A microbiologia o ramo da biologia que estuda os microorganismos que so definidos, em princpio, como seres microscpicos.

. Apesar de ser uma viso bastante simplificada, de modo geral, correta. Estes seres englobam uma grande diversidade biolgica cujos principais grupos so os vrus, as bactrias, as arqueas, as algas, os protozorios e os fungos. Os microorganismos so encontrados em praticamente todos os ambientes naturais como solo, ar, gua, esgoto, plantas, corpo humano e outros animais. Desta forma, para estudar os microorganismos de um determinado material/ambiente, todo o procedimento deve ser realizado em um ambiente livre de microorganismos (ou ambiente estril). Isto significa que todo o microorganismo encontrado no experimento ser oriundo do material/ambiente estudado. Existem algumas manobras durante a manipulao do material que impedem a entrada de microorganismos, as manobras asspticas. Tais manobras envolvem basicamente um bico de Bunsen (Figura 1) e a realizao de toda a manipulao dever ser feita dentro da chamada zona de segurana. A zona de segurana a regio em torno da chama mais prxima possvel sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras. A utilizao do Bico de Bunsen essencial pois visa a diminuio de microorganismos no campo de trabalho atravs do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possvel selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e no forma fuligem. importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato importante para que o processo de flambagem seja executado adequadamente, j que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama so: zona neutra ( uma zona fria e, portanto, no deve ser utilizada para a flambagem), zona redutora e zona oxidante (so zonas onde j ocorre a combusto e, portanto, j podem ser usadas para a flambagem).

1. Figura 1 Foto da combusto de GLP em ar em um bico de Bunsen e zonas da chama.

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O material utilizado na manipulao (meios de cultura, vidraria, entre outros) tambm deve ser livre de microorganismos. Para torn-los estreis ou para controlar o crescimento bacteriano neste material, diversos mtodos de assepsia e desinfeco, qumicos ou fsicos, so utilizados. A tabela 1 mostra os principais mtodos qumicos e fsicos de assepsia e desinfeco.
Tabela 1 Mtodos qumicos e fsicos de assepsia e desinfeco.

Mtodos qumicos Agente Uso Modo de ao Desnaturao protica dissoluo de lipdeos Desnaturao protica Alterao da membrana celular bacteriana Tempo de exposio Curto (10-15 min) Efeito imediato Curto (10-30 min)

lcoois (70-80%) Antisspticos Desinfectantes Fenis Compostos Quaternrios de amnio Desinfectantes Antisspticos Sanitizantes Desinfectantes (instrumentos cirrgicos) Tratamento da gua Antisspticos Desinfectantes Antisspticos Desinfectantes Desinfectantes (instrumentos e superfcies) Antisspticos

Cloro Iodo Iodforos Aldedos***

Inativao enzimtica agente oxidante Inativao enzimtica Inativao enzimtica Desnaturao protica agente alquilante Inativao enzimtica Mtodos fsicos

Efeito imediato Efeito imediato Efeito imediato Curto (formas vegetativas) Prolongado (esporos) S agem enquanto em contato 20 minutos

Metais pesados

Calor mido (autoclave) Calor seco (estufa a 1700C) Filtrao

Vidraria, meios de Desnaturao de cultura, artigos protenas hospitalares etc Instrumentos Desnaturao de metlicos, leos e protenas e oxidao vidrarias Lquidos, meios de cultura Vidrarias, plsticos, superfcies, preservao de alimentos Reteno de partculas maiores que o poro do filtro (0,25 m) Formao de dmeros de pirimidina no DNA e de radicais livres

Duas horas

Imediato

Radiao (ionizante, ultravioleta)

15 minutos (UV)

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Neste experimento, o material utilizado ser esterilizado por autoclavao. Outros procedimentos podem ser realizados para evitar ou restringir o crescimento de microorganismos em meios de cultura. Um exemplo a adio de antibiticos aos meios de cultura. Antibiticos so compostos que tm efeito citotxico ou citosttico sobre clulas bacterianas. Os antibiticos mais utilizados so os que inibem a sntese da parede celular bacteriana (ex: beta-lactmicos) , os que inibem a sntese protica das bactrias (ex: aminoglicosdicos), os que inibem a replicao bacteriana (ex: quinolonas) e os que causam citotoxicidade por produo de intermedirios reativos (ex: nitrofuranos). Em hospitais, bastante comum o isolamento e identificao de microorganismos de um paciente com doena de etiologia bacteriana. Durante este processo, faz-se testes de susceptibilidade das cepas de bactrias a diversos antibiticos (antibiograma) para maior eficcia do tratamento, principalmente em casos de infeco por cepas resistentes.
OBJETIVOS

Verificar a presena de microorganismos em diversos objetos/ambientes em meios de cultura com ou sem antibitico. Para tal, todo o procedimento dever ser realizado utilizando manobras asspticas em um ambiente estril.
PARTE EXPERIMENTAL

Material e Reagentes Balana semi-analtica Esptulas de pesagem Bqueres ou erlenmeyers de 250 mL Proveta de 100 mL 1 garrafa de vidro com tampa autoclavvel (ex. garrafa de gua tnica) Reagentes para preparao do meio de cultura (ver tabela 2) Autoclave Tubos Falcon ou provetas de 50 mL estreis 2 Placas de Petri caneta de retroprojetor swabs ou cotonetes estreis fita crepe fita de autoclave gua estril ampicilina (antibitico)
Reagentes LB Broth Ampicilina Glicose gua Agar bacteriolgico Para 1000 mL de meio com antibitico 25 g 100 g/mL 20 g Para completar 1L 15 g Para ___ mL de meio

2. Tabela 2. Meio LB-gar suplementado com glicose na presena ou ausncia de ampicilina

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Procedimentos Procedimentos PARTE A Preparao do meio de cultura dos microorganismos Sempre que for fazer um experimento, faa APENAS a quantidade de meio de cultura que for usar. Nesta prtica, utilizaremos duas placas de Petri contendo meio de cultura. Calcule o quanto de cada reagente voc precisa para preparar 20 mL de meio por placa de Petri. Pese cada reagente separadamente e junte-os em um bquer, EXCETO o gar. Transfira o gar para a garrafa de vidro. Acrescente ao bquer um volume de gua menor do que o volume final do seu meio (i.e., se voc for preparar 1000 mL de meio, acrescente 800 mL de gua). Agite a soluo contendo gua + reagente at dissolver totalmente. Passe a soluo para a proveta de 100 mL Complete com gua at o volume desejado Transfira o meio lquido para a garrafa com gar. Escreva o nome da soluo, a data e o nome de quem fez o meio em um pedao de fita crepe e cole na garrafa. Autoclave por 15 minutos.

PARTE B Preparao das placas de Petri Enquanto espera a autoclavagem, anote na parte de baixo da placa se o meio ter antibitico ou no, o seu nome (ou nome do grupo) e a data. Divida a parte de baixo da placa em quatro partes iguais com uma caneta de retroprojetor (Figura 2). CUIDADO PARA NO ABRIR A PLACA FORA DO BICO DE BUNSEN!!!

Figura 2. Esquema de diviso das placas com e sem antibitico.

PARTE C Depois que o meio de cultura foi autoclavado, espere o meio esfriar at conseguir encostar a garrafa no antebrao. Acenda o bico de Bunsen.

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A partir deste ponto, TODA a manipulao dever ser feita na zona de segurana do bico de Bunsen. Verta 20 mL de meio em uma das placas e deixe a placa semi-aberta. Verta outros 20 mL em um tubo falcon ou proveta estril e adicione o antibitico ampicilina. Verta o meio com antibitico na placa de Petri e deixe a placa semiaberta. Espere o meio solidificar. Faa os testes da seguinte forma: (sempre perto da chama) Quadrante Controle: no passe nada; Quadrante Etanol 70%, lave as mos com etanol 70% e depois esfregue o dedo no meio de cultura; Quadrantes Teste1 e Teste 2, esfregue um swab ou cotonete em alguma superfcie onde voc queira testar se h microorganismos. Pode ser em cima da bancada, na pele, em notas de 1 real, cabelo etc. Ou, teste diferentes formas de lavar as mos: com sabo de cco, detergente, sabonetes etc. Utilize o mesmo tratamento dos Teste 1 e 2 nas duas placas (com e sem antibitico). Quando terminar, feche a placa de Petri e coloque de cabea para baixo e coloque na estufa para crescimento durante toda a noite.

VERIFICAO QUESTES DE VERIFICAO

1. Explique o que aconteceu com o seu experimento. 2. Houve crescimento de algum microorganismo no seu experimento controle? E no etanol 70%? Justifique? 3. Quais foram os testes que voc fez e explique o resultado. Qual seria o controle negativo e qual seria o controle positivo? Justifique? 4. Que tipos de microorganismos que cresceram nas placas? Voc poderia inferir este resultado visualmente? 5. Em vista do experimento realizado, quais as medidas de assepsia devem ser tomadas ao se manipular amostras biolgicas? O que significa ambiente estril? 6. Mostre as diferenas entre um material limpo e um material estril. 7. Explique resumidamente o funcionamento de uma capela de fluxo laminar e qual foi a alternativa que utilizamos em seu lugar? Por que? Em que situaes esta alternativa vlida?
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Vermelho, A.B.; Pereira, A.F.; Coelho, R.R.R; Souto-Padrn, T. Prticas de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan (2006) http://www.veco.com.br, acessado em 10/10/2006. http://www.mip.ufsc.br/APOSTILA%20DE%20MICROBIOLOGIA.doc, 10/10/2006. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/antibiotics.html#relatedissues, 10/10/2006. acessado acessado em em