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TD2 : Le transport

Rappel sur les diffrents types de transport :


1 - Deux souches d'E.coli MC4100 (sauvage) et MKH13 (mutant) sont cultives dans le milieu de base M63 glucose 10 mM nal (M63 0M), additionn de NaCL 0,5 M nal (M63 0,5 M) et de Glycine Btaine 1 mM nal (M63 0,5 M + GB) ou de proline 1 mM nal (M63 0,5 M + Pro). La glycine btaine est un compos driv de l'acide amin glycine. la croissance est suivie par mesure de densit optique 600 nm pendant 6 heures. Interprter les rsultats obtenus.

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E.coli MC4100 M63 0 M M63 0,5 M

g = 0,7 h g = 2 h

(sans NaCl) (avec NaCl)

Avec NaCl, le temps de gnration est plus lev (3fois plus lent). (En TP : Chapman milieu avec beaucoup de NaCl -> E.Coli ne pousse pas) E.coli n'est pas halotolrante ou halophile. g = 0,7 h M63 0,5 M + GB g = 0,9 h M63 0,5 M + Pro Pour GB, on rcupre une croissance normale. Pour Pro, on rcupre une croissance presque normale. La GB est donc un osmo-protecteur. La pro est galement un osmo-protecteur mais moins efcace.

E.Coli MKH13 g = 1h -> croissance un peu plus lente M63 0 M g = 3h Les 3 autres -> aprs ajout de NaCl : pousse 3 fois plus lentement galement. -> ajout de GB et Pro :aucun effet. La GB et la Pro ne jouent plus leur rle de mutant. Hypothse : le mutant n'arrive pas faire entrer la GB et la Pro. Mutation au niveau des transporteurs.

2 - Aux bactries MC4100 (1 mg de protines correspond un volume interne 2,2 microlitres), on ajoute de la GB marque au carbone 14 la concentration de 0?5 mM dans 5 ml de milieu M63 0,5 M. Aux temps indiqus dans le tableau qui suit un petit volume de bactries est prlev. Les cellules sont rcupres par ltration et la radioactivit incorpore est mesure au compteur scintillation. D'autres mesures non dcrites ici ont permis de dterminer que 56,4 dpm correspondaient 1 nmol de [GB] intracellulaire/mg de protines. Trancher parmi diffusion passive, diffusion facilite ou transport actif.

Min
Dpm


0 0


1 1410


2 2190


4 3019


8 3843

15 4831

30 5820

45 6204

60 6204

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L'afue de la courbe permet d'liminer la diffusion simple. Pour la suite, on se place l'quilibre : Si diffusion facilite : [GB]int = [GB]ext. Si transport actif : [GB]int >> [GB]ext (50 1000 fois plus)


[GB]int : 54,4 dpm -> 1nmol [GB]intracellulaire / mg de protine -> 2,2 microlitres 6204 dpm -> 110 nmol [GB] : 2,2 microlitres

-> 50 nmol/microlitre 50 micromole/mL 50 mmol/L

-> [GB]int = 50 mM

A l'quilibre : 100 fois plus de [GB]int que de [GB]ext donc transport actif (mais on ne sait pas quel type primaire, secondaire ou tertiaire) 3 - Cette mme exprience ralise sur la souche MKH13 montre qu'aucune radioactivit n'est dtecte dans les cellules. Commenter

La GB ne rentre pas donc les transporteurs sont muts

4 - On ralise une srie d'expriences avec la souche MC4100 en faisant varier la concentration en GB an de dterminer les vitesses initiales (exprimes en units arbitraires). Les rsultats obtenus sont prsents dans le tableau qui suit. Interprter. Concentra tion en 0 GB en mM


0,013 714


0,025


0,050


0,250

Vitesse en units 0 arbitraire


1112
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1444


2209

Plus la concentration augmente, plus la vitesse augmente jusqu' une vitesse max qui correspond la saturation du transporteur. -> dtermination de l'afnit du transporteur pour GB (Km)


V 714 1112 1144 2209 1/Vi 0,00140 0,00089 0,00069 0,00045 0,013 0,025 0,050 0,250 [S] 76,4 40 20 4 1/[S]

-> Voir courbe


- 1/Km = - 30 mM^(-1) Vmax = 2500 UA Km = 0,033 mM = 33 microlitres

MC4100 -> Km = 33 microM


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5 - Cette exprience ralise sur des cellules de 2 autres souches d'E.coli GM50 et BK32 (mutants) a permis de dterminer le Km de la glycine btaine. Il est estim 1 microM pour la souche GM50 et 40 microM pour la souche BK32. Interprter.

GM50 -> BK32 ->

Km = 1 microM Km = 40 microM

-> afnit forte -> afnit plus faible

Hypothse : changement de conformation du transporteur. - une mutation donne une meilleur afnit - une mutation donne une afnit plus faible modication de l'expression du transporteur - quantit plus ou moins forte de transporteurs

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Chez E.coli, il y a 5 types de transporteurs pour le galactose.

Dans la souche sauvage : 2 systmes de transports pour la GB. BK32 -> 1 seul transporteur GM50 -> 1 seul transporteur (un autre) GM50 : les transporteurs de faible afnit sont muts. BK32 : les transporteurs de forte afnit sont muts

-> Quantit transporteurs faible >> quantit transporteur forte afnit. MKH13 -> les 2 systme sont muts.

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