Transductores y Sensores Biosensores

TR ANSDUCTORES Y SENSORES BIOSENSORES

Los sensores naturales son tan viejos como los organismos vivos. Estos bioreceptores son transductores naturales que convierten todo tipo de seales fsicas y qumicas del ambiente en seales elctricas, resultando en potenciales de accin que pueden ser procesados por una computadora natural, nuestro sistema nervioso. La presencia de bioreceptores no se limita a los rganos de nuestros sentidos sino que aparecen en todos los procesos involucrados en los organismos vivos y clulas. La aparicin de los sensores artificiales y su progresiva expansin permiti poner en contacto a los aparatos electrnicos con el mundo exterior, dotando de "sentidos" a la tecnologa. Por lo tanto, podemos definir un biosensor como un dispositivo bioqumico-electrnico que permite identificar, transformar y cuantificar un evento biolgico. Est compuesto por la combinacin de un bioreceptor, componente biolgico y un transductor, mtodo de deteccin. En la Fig. 1 se muestra el principio de operacin de un biosensor el cual, comenzando desde el analito, puede proveer toda la informacin necesaria para su evaluacin. Esta informacin puede ser procesada y almacenada. El biosensor est en contacto directo con la muestra a travs del bioreceptor, que le confiere la selectividad a travs de un sitio selectivo que identifica al analito y lo transforma de alguna manera. Generalmente el bioreceptor es una enzima inmovilizada que transforma el analito en un producto que es detectable por el transductor. Estos cambios que se producen al identificar al analito pueden ser: variaciones de temperatura, de masa, constante dielctrica, potencial de media celda, de conductividad inica, de turbidez de la muestra, entre otros. Por lo tanto, dependiendo de esta modificacin bioqumica que se produzca se escoge el transductor. El transductor debe dar una seal ptima, sensible, fcil de monitorear y con el mnimo de ruido. El transductor puede ser electroqumico, termomtrico, fotomtrico o piezoelctrico y de acuerdo al tipo de bioreceptor con el que se combina pueden formarse mltiples tipos de biosensores. Como era de esperar, la tecnologa ha llegado an ms lejos en algunos casos que nuestro sistema sensorial. Los sensores se han convertido en "sentidos ultraperfeccionados" que llegan a lugares a los que nosotros no tenemos acceso, captan imgenes y movimientos con una resolucin inimaginable para el ojo humano, y detectan estmulos que nosotros no percibimos, como las ondas electromagnticas o los ultrasonidos. La informacin que aportan ha cobrado un valor extraordinario en todos los mbitos de la actividad humana, desde la Alimentacin y la Medicina hasta la Seguridad Nuclear o la bsqueda de vida en otros planetas.

Fig. 1. Etapas en la determinacin con un biosensor

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I. EL BIORECEPTOR
El bioreceptor es crucial pues produce el efecto fsico-qumico que ser detectado por el transductor. Esto involucra procesos como biocatlisis, acoplamientos inmunolgicos o quimiorecepcin. 1. Tipos de bioreceptores Los bioreceptores ms empleados son: Catalizadores biolgicos (enzimas). Las enzimas pueden ser extradas de una o ms fuentes biolgicas (in situ) para aplicaciones especficas y pueden usarse solas o con sus cofactores. Las enzimas que se consiguen comercialmente presentan las siguientes ventajas: se reproducen por lotes, tiempo de vida y caractersticas conocidas, disponibilidad inmediata. Las desventajas de las enzimas purificadas son que no son siempre estables y necesitan la presencia de sus cofactores para operar en forma apropiada. En algunos casos se necesitan cadenas enzimticas para realizar las transformaciones, lo que debe asegurarse la operacin ptima del biosensor en forma global. Microorganismos. Son entidades estructurales que poseen todas las enzimas necesarias y sus cofactores en un ambiente optimizado por la naturaleza. Pueden reproducir y compensar prdidas en la actividad enzimtica con el tiempo. Tejidos y organelas. El tejido tiene la ventaja de la cohesin, y tiene una estructura que es lo suficientemente robusta para adherirse a un transductor sin necesidad de recurrir a tcnicas de inmovilizacin de protenas. Pueden usarse: Tejidos de animales y vegetales: estos tejidos son fuentes naturales de material enzimtico por lo cual pueden construirse biosensores muy estables. Organelas: se pueden encontrar biocatalizadores cloroplastos, mitocondrias y microsomas. en lisosomas,

Inmunorreceptores. Debido a la reaccin antgeno-anticuerpo se produce una dbil variacin del potencial que puede detectarse, pero deben utilizarse distintos procesos para mejorar la respuesta del transductor. Quimiorreceptores. Se emplean los receptores celulares especficos de membranas celulares que se excitan qumicamente para producir cambios conformacionales. Ej: neurorreceptores para detectar drogas y toxinas. 2. Inmovilizacin de los bioreceptores Un paso crucial en la construccin de un biosensor es inmovilizar las protenas de inters (Ej: enzimas). Esto asegura mximo contacto con la muestra, y estabilizacin de la protena para poder emplearla en forma repetida. 2.1. Inmovilizacin de enzimas En la Fig. 2 se muestran distintos tipos de tcnicas de inmovilizacin de enzimas. Atrapamiento fsico Las enzimas tienen alto peso molecular y gran tamao, lo suficiente como para atraparlas en geles de poliacrilamida o membranas de dilisis. El primer electrodo de enzima fue construido por Updike y Hicks atrapando glucosa oxidasa en una capa de gel de poliacrilamida, que a su vez se adhera a un electrodo de oxgeno. El atrapamiento fsico no se usa generalmente porque la presencia de enzimas en una solucin no permite una actividad enzimtica a largo plazo.

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Fig. 2. Tcnicas de inmovilizacin de enzimas.

Inmovilizacin por enlace cruzado (cross-linking) Este proceso usa un agente bi o multifuncional para formar un puente entre distintas especies biocatalticas o protenas. Esto resulta en un incremento considerable del peso molecular, y los compuestos que se forman son insolubles. Es posible enlazar molculas de una misma enzima, o coreticular dos o ms protenas diferentes (enzima con enzima, enzima con protena, etc). Un agente utilizado en cross-linking es el glutaraldehdo. Este agente bifuncional tiene dos grupos aldehdos en sus extremidades que reaccionan con el grupo amina de una enzima o protena. Los mtodos de cross-linking son: mtodo de inmersin (para inmovilizar ureasa), mtodo de enlace directo, uso de aerosoles, uso de membranas y, membranas prefuncionalizadas. Inmovilizacin electromagntica Si una enzima puede incorporarse en un soporte magntico, entonces puede usarse un campo electromagntico para inmovilizarla. La ventaja de este mtodo es que los componentes biocatalticos pueden ser cambiados tan frecuentemente como se desee. La enzima puede despegarse deteniendo la corriente en el solenoide. La dificultad es la fijacin de la enzima a las partculas magnticas. La interaccin bioespecfica usada es frgil e irreversible, y la enzima puede ser despegada bajo ciertas condiciones de pH. Inmovilizacin multienzimtica La naturaleza protenica de las enzimas significa que contienen un gran nmero de grupos reactivos que pueden ser simultneamente inmovilizados, lo que permite que el sustrato pueda ser reciclado, aumentando la sensibilidad de la respuesta del electrodo. El uso de mediadores para reducir el potencial aplicado en los electrodos amperomtricos, y la interferencia, algunas veces requiere inmovilizacin multienzimtica. La inmovilizacin multienzimtica necesita la catlisis de reacciones de descomposicin sucesivas que requieren muchas enzimas diferentes, pero eventualmente los productos pueden ser detectados por un electrodo.

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Inmovilizacin de cofactores Un cofactor (o coenzima) puede ser inmovilizado en un soporte insoluble al mismo tiempo que una enzima, gracias a que forman una unidad indisociable con la apoenzima. Adems, el cofactor puede permanecer lo suficientemente mvil despus de su inmovilizacin para pasar de un sitio activo de una apoenzima al sitio activo de otra para su regeneracin. La inmovilizacin fsica de los cofactores es imposible debido a su tamao tan reducido y por lo tanto debe ser unido covalentemente ya sea a una enzima o un soporte insoluble. A veces la regeneracin de un cofactor no requiere otra enzima sino simplemente otro sustrato. El cofactor es inmovilizado en un sitio activo de una enzima para obtener la reaccin enzimtica con el primer sustrato, y luego el cofactor es regenerado por un segundo sustrato. Inmovilizacin de mediadores Los mediadores se usan para regenerar los cofactores involucrados en las reacciones redox catalizadas por enzimas. La movilidad de un cofactor se reduce si la enzima no est en solucin y se requiere un mediador para transportar electrones entre el electrodo y el cofactor. Pueden usarse ferrocenos y sales orgnicas conductoras. Los mediadores se inmovilizan usando redes polimricas inertes o electroactivas. Sensores miniatura Se utilizan en microsensores implantables para anlisis clnicos in vivo. Pueden ser sensores potenciomtricos o amperomtricos. 2.2. Inmovilizacin de microorganismos Como los microorganismos son de mayor tamao que las enzimas pueden ser inmovilizados por atrapamiento fsico. Pueden atraparse en geles agar o de poliacrilamida, o en membranas de dilisis o filtracin. Tambin se pueden inmovilizar clulas enteras en suspensiones de colgeno tratadas con glutaraldeido. 2.3. Inmovilizacin de inmunoagentes Existen dos tipos de inmunosensores: aquellos que en forma directa explotan una variacin de un parmetro como resultado de un acoplamiento inmunolgico y aquellos que recurren a una enzima para liberar un producto, o consumir un co-sustrato, que es detectable por un transductor. El primer paso en ambos casos es fijar un antgeno, un anticuerpo, o un compuesto que tenga bioafinidad con el analito, sobre el transductor. Inmovilizacin de anticuerpos El objetivo de inmovilizar un anticuerpo en un transductor es detectar el antgeno correspondiente. Los anticuerpos tienen estructuras protenicas y pueden ser inmovilizados de la misma forma que las enzimas, en forma directa (enlaces covalentes) o usando membranas. Inmovilizacin de antgenos Los antgenos no siempre poseen estructuras protenicas como para inmovilizarlos en la misma forma que los anticuerpos o las enzimas, y por lo tanto se los une a portadores inicos. Inmovilizacin de los compuestos con bioafinidad Los compuestos con bioafinidad pueden usarse para preparar protenas complejas por procesos similares al acoplamiento inmunolgico. Los compuestos se inmovilizan usando membranas obtenidas por copolimerizacin de 1,8-diamino-4-amino-metiloctano con triacetato de celulosa. Las membranas se sumergen en una solucin que contiene ovalbmina y luego HABA (cido benzoico 2[(4-hidroxifenil)azo]), el compuesto con bioafinidad, se une con carbodiimida. 2.4. Inmovilizacin de tejidos y organelas Se corta un trozo de tejido animal o vegetal que se inserta entre dos membranas semipermeables que luego se adjuntan al transductor. El transductor generalmente es un electrodo de pO2, pCO2, o pNH3 los cuales tienen su propia membrana hidrofbica permeable a un gas. Los tejidos animales pueden ser de hgado de conejo o bovinos, msculo o mucosa intestinal de conejo. Los componentes celulares tambin se usan, por ejemplo mitocondrias. Estas organelas hacen ms selectivo al

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biosensor porque contienen enzimas ms especficas. Los tejidos vegetales se inmovilizan usando retencin mecnica. Estos biosensores tienen un tiempo de respuesta mayor que los sensores de enzima correspondientes. Para obtener respuestas ms rpidas se incorpora el tejido en pastas de carbn para facilitar el contacto entre el sitio biocataltico y el componente sensible. 2.5. Inmovilizacin de quimiorreceptores Los quimiorreceptores se adhieren en su estado natural a un electrodo potenciomtrico para crear sensores llamados receptrodes. De esta forma pueden crearse neurorreceptores para medir toxinas y otros agentes qumicos. Por ejemplo, el uso de receptores de acetilcolina permite la determinacin de acetilcolina a travs de la deteccin de una impedancia especfica comparada con otros neurotransmisores.

II. TRANSDUCTORES EMPLEADOS EN BIOSENSORES

El transductor provee la evidencia de que ha ocurrido una reaccin en el bioreceptor. La eleccin del transductor depende del tipo de reaccin, y las sustancias liberadas o consumidas. Generalmente, la eleccin apropiada del transductor es el modelo comercial que existe para el mtodo de deteccin requerido. Hay un gran nmero de electrodos disponibles para deteccin electroqumica, por ejemplo, electrodos sensibles a pH, a aniones o cationes, y a gases (pO2, pCO2, pNH3). El componente sensible puede comprarse independientemente y luego adherirlo al biosensor. La eleccin del transductor tambin depende la aplicacin deseada del biosensor. Si va a ser usado en ambientes biolgicos, debe satisfacer criterios de biocompatibilidad, especialmente con respecto a la deposicin de protenas, lpidos o clulas sobre su superficie. Si va a ser utilizado in vivo, debe ser de tamao reducido, y con forma adecuada para no daar excesivamente los tejidos. Adems deben tenerse en cuenta las caractersticas txicas, metlicas, o componentes polimricos cuando se va a implantar por largo tiempo. La interferencia qumica puede afectar la transduccin, por lo que tambin debe tenerse en cuenta en el momento de la eleccin del transductor. El transductor debe aprovechar ptimamente las modificaciones fisicoqumicas que resulten de las reacciones biolgicas. Por ejemplo, si una reaccin provoca una variacin de la entalpa, se produce un incremento muy dbil de la temperatura y por lo tanto un termistor es un transductor trmico ms adecuado que una termocupla. El mismo transductor puede usarse en modos de operacin diferentes, que se eligen de acuerdo al objetivo deseado. Por ejemplo, una fibra ptica puede usarse como un transductor extrnseco, con un componente biorreactivo inmovilizado en su punta, o como un transductor intrnseco explotando la interaccin entre las inmunoprotenas de su superficie y las ondas evanescentes de la superficie. Los transductores pueden ser: Electroqumicos Potenciomtricos Amperomtricos Semiconductores Termomtricos Piezoelctricos Fotomtricos

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1. Transductores electroqumicos 1.1. Potenciomtricos 1.2. Amperomtricos 1.3. Semiconductores

2. Transductores termomtricos Un sensor enzimtico trmico, o entalpimtrico, mide la concentracin de un sustrato usando la variacin de entalpa de una reaccin enzimtica. Existen distintos mtodos para medir temperatura (pticos, mecnicos, elctricos) pero los elctricos son los ms usados para la construccin de biosensores trmicos debido a que la seal elctrica puede obtenerse directamente de la variacin de la temperatura. Pueden usarse termistores o termocuplas para la medicin de temperatura. Las termocuplas simples no son lo suficientemente sensibles para detectar las variaciones de entalpa de las reacciones enzimticas. Los termistores y termopilas s pueden detectar pequeas variaciones de temperatura. Los termistores son mezclas de xidos metlicos con semiconductores cristalinos. La alta resistividad de estos materiales les confiere una rpida respuesta temporal gracias a su pequeo tamao y capacidad calorfica reducida. La resistencia de un termistor es funcin de la temperatura, lo cual se ocupa como principio para la transduccin. Las termopilas se construyen alternando uniones termoelctricas y se usan para construir biosensores. Generan seales pasivas lo que las hace particularmente aptas para mediciones en soluciones fluidas. Se emplean dos termistores, uno de los cuales est a una temperatura de referencia. La enzima inmovilizada se coloca directamente sobre el termistor de trabajo (Fig. 3). La enzima transforma el sustrato y libera o consume caloras que pueden medirse in situ por los termistores (o termocupla). En una determinacin se colocan dos termistores, uno mide las variaciones de la temperatura del medio, y el otro las variaciones de temperatura por la reaccin enzimtica ms las del medio. La diferencia de las dos temperatura es la variacin por la actividad enzimtica.

Fig. 3. Esquema de un transductor termomtrico.

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3. Transductores piezoelctricos Las mediciones piezoelctricas usan la aparicin de una polarizacin elctrica, o una variacin en la polarizacin existente, en materiales anisotrpicos dielctricos, por ejemplo cuarzo, cuando se aplica una fuerza en la direccin apropiada. Este efecto piezoelctrico es reversible. Un sensor piezoelctrico mide la masa depositada en la superficie de un cristal piezoelctrico, detectando la variacin en la frecuencia de resonancia caracterstica (FRC) del cristal. Intuitivamente, al aumentar el peso del cristal su FRC disminuye, esto es anlogo a las cuerdas de una guitarra, que cuanto ms gruesa es, resuena a una menor frecuencia. Un sensor piezoelctrico consiste en un cristal de cuarzo, electrodos metlicos y el receptor que brinda la selectividad. En la Fig. 4 se presenta un esquema de un sensor piezoelctrico. La frecuencia de resonancia disminuye con el aumento de masa:

dF = 2.3.106.F 2 .

dM A

donde F es la frecuencia fundamental, dF es la variacin de frecuencia, dM es la masa adsorbida y A es el rea de la superficie cubierta por el receptor. Una frecuencia tpica de trabajo es 10 MHz. Con -12 este mtodo se pueden detectar 10 gramos.

Fig. 4. Esquema de un sensor piezoelctrico.

Aplicaciones Empleando enzimas Deteccin y cuantificacin de organofosfatos: se emplea la enzima colinesterasa, la cual forma compuestos con los derivados organofosfatados, permitiendo su deteccin en fase gaseosa. El aumento de peso sobre el cristal se debe a los compuestos formados. Empleando agentes inmunolgicos Deteccin y cuantificacin de bacterias: La variacin de masa se produce por el acoplamiento antgeno-anticuerpo. Inmovilizando el anticuerpo anti-Candida para la bacteria Candida albicans, se pueden medir concentraciones entre 106 y 5.108 bact/ml. Cuantificacin de Digoxina Se inmoviliza anti-Digoxina sobre el cristal de cuarzo. Se coloca el sensor en el ambiente con el antgeno. Se deja secar el sensor con el complejo antgeno-anticuerpo. Se mide frecuencia en fase gaseosa.

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Se obtiene una relacin lineal entre concentracin de Digoxina y frecuencia entre 100 y 800 ng/ml. 4. Transductores fotomtricos Se basan en la medicin de la variacin de las propiedades pticas de un medio o un receptor inmovilizado. La luz puede atravesar, reflejarse o emitirse del material analizado. Las fibras pticas pueden usarse para construir biosensores. La luz entre una muestra y una fuente o detector se transporta a lo largo del interior de las fibras siguiendo los principios de reflexin total. La luz se propaga a lo largo de la fibra en diferentes modos, de acuerdo a un ngulo de incidencia dado. La reflexin total en una fibra nunca es perfecta y por lo tanto algo de radiacin electromagntica penetra la cubierta de la fibra. Esto se llama ondas evanescentes, y pueden usarse para detectar variaciones de las propiedades pticas de pelculas qumicas y biolgicas que se colocan alrededor de la fibra. Comnmente el material (reactivo) que cambia sus propiedades pticas (absorcin, fluorescencia, y luminiscencia) es inmovilizado en la punta o alrededor de una fibra ptica. Absorcin de luz El detector mide la reduccin de la intensidad de la luz de la fuente. Esta reduccin es causada por un producto absorbente que proviene de la reaccin entre la sustancia inmovilizada y el analito. Generalmente se utilizan ondas de longitud de onda monocromtica, y los rayos, incidente y emitido, tienen la misma longitud de onda. Como se muestra en la Fig. 5, se basan en el recubrimiento de la punta de una fibra ptica con un indicador coloreado incorporado a una matriz polimrica. Se emplean en medidores de pH.

Fig. 5. Esquema de un sensor ptico.

Fluorescencia La longitud de onda de la emisin fluorescente es diferente de la longitud de onda de la onda de excitacin, y una sola fibra es suficiente para transportar la radiacin de excitacin y emisin. Tambin se usa una sola fibra para medir fluorescencia, que ocurre cuando un compuesto absorbe en la misma regin espectral que la emisin presente. Es muy sensible y detecta muy bajas concentraciones. Se emplean indicadores fluorescentes inmovilizados en la punta de una fibra. Un cambio de pH provoca un cambio en la fluorescencia del indicador. Se emplea luz lser para iluminar la punta. Bio o Quimioluminiscencia La Bioluminiscencia est asociada a la emisin de luz de organismos vivos como las lucirnagas. Bsicamente, una reaccin es catalizada por la luciferasa y libera un compuesto en su estado excitado, que emite luz cuando vuelve al estado de reposo. Se emplea para cuantificar ATP o procesos que usen ATP como cofactor.

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La Quimioluminiscencia proviene de reacciones qumicas, en las que ocurre una oxidacin que involucra oxgeno molecular, o perxido de hidrgeno (H2O2). Estos sensores sirven para medir H2O2 .

III. TIPOS DE BIOSENSORES

Los biosensores pueden clasificarse de acuerdo al tipo de bioreceptor o del transductor usado. En este caso estn clasificados por tipo de bioreceptor porque este componente es quien determina la accin primaria del biosensor. 1. Biosensores de enzima Un biosensor de enzima es la combinacin de un transductor y una capa delgada enzimtica, que se usa normalmente para medir concentracin de un sustrato. La reaccin enzimtica transforma el sustrato en un producto de reaccin que el transductor puede detectar. La concentracin de una sustancia se mide segn cmo afecte su presencia a la velocidad de reaccin enzimtica. Principios de operacin En la Fig. 6 se presenta un biosensor de enzima. La superficie sensible del transductor est en contacto con una capa enzimtica, y se asume que no hay transferencia de masa a travs de esta interfase. La superficie externa de la capa enzimtica est inmersa en una solucin que contiene el sustrato bajo estudio. El sustrato migra hacia el interior de la capa y se convierte en productos de reaccin cuando reacciona con la enzima inmovilizada. Para alcanzar un rpido equilibrio de concentracin la membrana enzimtica debe ser tan delgada como sea posible. La solucin debe agitarse para asegurar un suministro constante de sustrato. En resumen, los diferentes pasos son: 1. Transporte del sustrato desde el seno de la solucin hacia la capa enzimtica. 2. Difusin del sustrato en esta capa, acompaado por la transformacin enzimtica del sustrato en productos de reaccin. 3. Migracin del producto hacia el transductor. 4. Conversin de la concentracin del producto en esta superficie en una seal elctrica por el transductor.

Fig. 6. Representacin esquemtica de la difusin de un sustrato S y su producto P en una capa enzimtica sobre un transductor.

Los biosensores basados en enzimas pueden formarse usando principios de transduccin electroqumicos, pticos, trmicos o gravimtricos. Los basados en principios electroqumicos se denominan electrodos de enzima y miden la formacin de un producto o el consumo de un sustrato, si el producto o sustrato es electroactivo.

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El principio amperomtrico se ha usado extensamente en electrodos de enzima en los cuales se mide el consumo de oxgeno o la formacin de perxido de hidrgeno con un electrodo polarogrfico. Por ejemplo, la glucosa se oxida por la reaccin enzimtica de la glucosa oxidasa (GOD) segn:

Glu cos a + O2 GOD Gluconolactato + H 2 O2

Tanto el O2 como sustrato y H2O2 como producto pueden ser detectados. El electrodo de glucosa consiste de un electrodo polarogrfico con una capa de GOD inmovilizada cubierta por una membrana permeable a glucosa, como se muestra en la Fig. 7. La concentracin de glucosa se mide por el cambio de la corriente del electrodo de oxgeno o del electrodo de perxido. Cuando se emplea medicin de oxgeno, se necesita la operacin diferencial de dos electrodos de oxgeno, con o sin GOD, en cambio la produccin de perxido de hidrgeno puede medirse con un solo electrodo por lo cual, se utiliza esta tcnica ms frecuentemente.

Fig. 7. Ejemplo de un electrodo de glucosa polarogrfico.

Los electrodos de enzima tambin se forman por electrodos in selectivo (ISE) y transistores de efecto de campo de in selectivo (ISFET), ambos basados en el principio potenciomtrico. A estos sensores se los denomina ENFET (Fig. 8). Consisten en un ISE o ISFET cubiertos por una capa de enzima inmovilizada y una membrana protectora. En los electrodos de enzima potenciomtricos, se mide el producto de las reacciones enzimticas. Por ejemplo, la hidrolizacin de urea es catalizada por la ureasa,
+ Urea + 2 H 2 O + H + Ureasa 2 NH 4 + HCO3

y luego NH3 se forma como:

+ NH 4 + OH NH 3 + H 2 O

Segn estas reacciones la urea puede medirse a travs de un electrodo de NH3. Tambin hay otros electrodos potenciomtricos para medir aminocidos, penicilina, etc.

Fig. 8. Esquema de un ENFET. Las enzimas se inmovilizan en 2.

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El principio termomtrico tambin se utiliza para mediciones en algunos electrodos de enzima debido a que las reacciones enzimticas siempre producen calor en un rango de 20 a 100 kJ mol-4. La cantidad de sustancia puede estimarse del calor producido. Inyectando una muestra estabilizada a una temperatura en una pequea columna con enzimas inmovilizadas con una velocidad de flujo constante, puede medirse el calor producido como la diferencia entre las terminales de entrada y salida de la columna. Las sustancias tpicas que se analizan por principios termomtricos son etanol, glucosa, lactato, cido oxlico, penicilina, sucrosa, y urea. Un termistor recubierto con una enzima inmovilizada puede ser un biosensor simple y se llama termistor unido a enzima. La mayora de los biosensores usados en medicina son biosensores de enzima debido a su especificidad, fcil implementacin, y por la disponibilidad comercial de enzimas y su correspondiente transductor. El uso in vivo requiere la resolucin de problemas de biocompatibilidad, especialmente aquellos referidos al depsito de fibrina y plaquetas en la membrana enzimtica. Entre las aplicaciones se encuentra el sensor de GOD para determinar glucosa en sangre y orina para el diagnstico de diabetes. Otros biosensores tambin son capaces de medir metabolitos en un medio biolgico. Los electrodos de urea y creatinina pueden controlar funciones renales; el electrodo de colesterol se usa para la deteccin y prevencin de arteriosclerosis; el electrodo de acetilcolina puede monitorear los neurotransmisores relacionados a la transmisin qumica en la sinapsis; y el electrodo de lactato puede evaluar esfuerzo muscular. Tambin hay enzimas con actividad antitumoral, cicatrizante y con otras acciones teraputicas. Por ejemplo, la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de leucemias y cnceres diseminados que requieren asparragina para desarrollarse. Se ha diseado un hemodializador de fibra hueca que contiene asparaginasa inmovilizada. La tripsina o la colagenasa se utilizan para eliminar los tejidos muertos de heridas, quemaduras, lceras, etc.; para acelerar el crecimiento de nuevos tejidos e injertos de piel, y tambin para inhibir el crecimiento de algunos microorganismos contaminantes. Este tipo de enzimas se pueden inmovilizar en celulosas o fibras que formarn parte del tejido de apsitos y vendas. 2. Inmunosensores Los sensores inmunolgicos o biosensores reconocen el acoplamiento entre un antgeno y un anticuerpo. El antgeno (Ag) y el anticuerpo (Ab) forman un complejo antgeno-anticuerpo (AgAb), Ab + Ag AgAb donde puede definirse una constante K porque la reaccin es constante y reversible en el equilibrio. K es la constante de afinidad,

K=

[ Ab Ag ] [ Ab ][ Ag ]

Cuando se introduce Ag y Ab se mantiene constante, la cantidad de Ag introducida se determina por el incremento de AgAb. Si el anticuerpo Ab se inmoviliza y fija en la superficie del sensor, como se muestra en la Fig. 9, la formacin de AgAb causar un cambio en potencial de electrodo [3], o de la masa o de las propiedades pticas, que pueden ser detectados directamente con una variedad de transductores [2]. La deteccin potenciomtrica de la reaccin antgeno-anticuerpo se demostr en un estudio en el cual se inmoviliz gonadotropina corinica humana (hCG), o un anticuerpo contra hCG, en un alambre de titanio, y se observaron los cambios de potencial cuando se agreg el anticuerpo o antgeno correspondiente. Para detectar este cambio se utilizan transistores de efecto de campo in selectivo llamados IMFET. Pueden formarse inmunosensores altamente sensibles utilizando reacciones enzimticas, en los cuales se fija una cantidad de antgeno marcado con una enzima. Como se muestra en la Fig. 9, antgenos marcados o no, se unen con anticuerpos inmovilizados. Despus de remover los antgenos libre, la actividad enzimtica se mide introduciendo un sustrato y detectando el cambio del producto a travs de alguna tcnica adecuada. Los inmunosensores tienen un gran potencial en medicina debido a la especificidad de las reacciones inmunolgicas. Estos biosensores se usan para medir drogas como theophylline (alcaloide que se extrae del te), y para determinar la hormona HCG para el diagnstico de embarazo, alfafetoprotena para la identificacin de cncer, y el antgeno de superficie de hepatitis B.

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Fig. 9. Inmunosensores de deteccin gravimtrica, electroqumica y ptica.

Estos biosensores no pueden usarse in vivo porque la amplificacin enzimtica involucrada requiere la adicin de un sustrato para la operacin del sensor. Adems, la formacin del complejo anticuerpo-antgeno es lenta y requiere un gran nmero de pasos. La definicin de inmunosensores corresponde a un biosensor ideal. Sin embargo, en la prctica la mayor parte de los dispositivos no cumplen alguno de los requisitos. Por ejemplo, gran parte de los inmunosensores desarrollados no dan una respuesta directa ante la presencia del analito; precisan de una seal secundaria producida por un marcador radiactivo, una enzima, un compuesto fluorescente o electroactivo, etctera. Son los denominados inmunosensores indirectos. Por otro lado, gran nmero de inmunosensores no trabajan en condiciones de total reversibilidad, son difciles de miniaturizar o no presentan la configuracin electrnica adecuada para ser utilizados in-situ masivamente. Los distintos inmunosensores pueden ser clasificados en funcin de la naturaleza fsica del transductor. De este modo existen inmunosensores electroqumicos, pticos, piezoelctricos, termomtricos o magnticos. Los tres primeros son los ms desarrollados.

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3. Biosensores microbianos Los sensores microbianos surgen de la combinacin de un microorganismo con un transductor capaz de detectar el metabolito involucrado. Los microorganismos poseen sistemas enzimticos que son los que dan la selectividad. Los microorganismos se inmovilizan generalmente en geles o usando membranas de dilisis. Los electrodos potenciomtricos y amperomtricos son tiles porque tienen una membrana hidrofbica en la cual se insertan los microorganismos (entre esta membrana y la membrana de dilisis). Las ventajas que presentan frente a los electrodos de enzimas aisladas son: - Los sensores microbianos son menos sensibles a inhibirse por solutos y ms tolerantes en ambientes de pH subptimo. - Tienen mayor tiempo de vida que los electrodos de enzimas. - Ms baratos (porque la enzima no necesita aislarse). - Mantienen las enzimas en su ambiente natural evitando los problemas de regeneracin de cofactores. Por otro lado la construccin de estos biosensores presenta algunos problemas: - Son inapropiados para mediciones in vivo y, en ambientes biolgicos complejos. - El gran nmero de enzimas presente en los microorganismos puede hacer bastante difcil las interpretaciones analticas. - El crecimiento microbacterial incrementa el tiempo de respuesta del sensor porque vara con el espesor de la capa activa y el coeficiente de difusin del sustrato, el cual cambia durante la operacin del biosensor. Estos biosensores pueden clasificarse como biosensores de medicin de respiracin o de metabolitos. Como se muestra en la Fig. 10 (a) los sensores de medicin de respiracin consisten de microorganismos aerbicos inmovilizados y un electrodo de oxgeno. Cuando un sustrato, que puede ser metabolizado por el microorganismo, se encuentra en una solucin saturada de oxgeno, ocurre una reaccin metablica por el consumo de oxgeno disuelto, entonces puede medirse el sustrato por la disminucin de la tensin de oxgeno. A travs de estos biosensores pueden medirse muchas sustancias como glucosa, azcares, cido actico, amonio, y alcoholes. Tambin puede medirse la demanda bioqumica de oxgeno (BOD). En la Fig. 10 (b) se muestra un sensor microbiano de medicin de metabolitos. Consiste de microorganismos inmovilizados y un sensor que detecta el metabolito producido por la reaccin catalizada por ese microorganismo. Usando distintos tipos de sensores de gases e iones, pueden medirse muchas sustancias detectando los diferentes metabolitos. Por ejemplo, el electrodo de celda utilizado para detectar H2 para medir cido frmico, el electrodo de CO2 para cido glutmico y lisina, y el electrodo de pH para cfalosporina y cido nicotnico. Algunas bacterias exhiben luminiscencia. Si se inmovilizan estas bacterias y se combinan con un fotodetector, se pueden medir sustancias que afecten la bioluminiscencia detectando el cambio en la luminiscencia con un sensor llamado biosensor fotomicrobiano. Algunas sustancias como la glucosa incrementan la luminiscencia, mientras que otras como el cromo, el mercurio, etc. Existen los sensores hbridos que son la combinacin de un biosensor microbiano y una membrana con enzimas inmovilizadas. Por ejemplo, el biosensor de urea se forma combinando un membrana de ureasa y un sensor microbiano de NH3 usando bacterias que causan nitracin. Este sensor es superior al potenciomtrico de amonio en el sentido de que la interferencia inica o compuestos voltiles como aminas es menos comn. Tambin se han propuesto sensores para detectar cambios qumicos mutagnicos. Como la mutagenecidad se correlaciona con la carcinogenicidad, se espera usar este tipo de biosensores para monitorear carcingenos.

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Fig. 10. Sensores microbianos (a) medicin de respiracin y (b) medicin metablica.

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