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INFORME: DETERMINACION DE LA VITAMINA C Y CROMATOGRAFIA

Nombre: Aguilar Coria Ximena Gabriela Docente: Ing. Grima Velasco

noviembre 23
2012

Universidad Mayor de San Andrs Facultad de Ingeniera

Cromatografa Liquida de Alta resolucin HPLC LABORATORIO QUIMICA ANALITICA CUANTITATIVA ________________________________________________________________

Cromatografa Liquida de Alta resolucin HPLC 1. ANTECEDENTES.


La Cromatografa lquida de alta eficacia o High performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografa en columna utilizada frecuentemente en bioqumica y qumica analtica. Tambin se la denomina a veces Cromatografa lquida de alta presin o High pressure liquid chromatography (HPLC), aunque esta terminologa se considera antigua y est en desuso. El HPLC es una tcnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatogrfica.

2. PRACTICA.
Realizar la curva de Calibracin de la glucosa si por el mtodo de cromatografa Liquida HPLC, se tienen los siguientes resultados de estndares de Glucosa, Xilosa, Arabinosa y manosa. Los tiempos de retencin se encuentran por: (recuerden que los tiempos de retencin varan en un cierto rango para cada Cromatograma) Glucosa: 12,5 a 13,1 min Xilosa: 14,03 a 14,42 min Arabinosa: 17,04 a 17,68 min Manosa : 18,1 a 18,30min CROMATOGRAMA DE ESTANDARES DE CARBOHIDRATOS

Concentracin de estndares C(g/l)) S1 S2 S3 S4

(g/l) 10 8 6 4

GLUCOSA AREA 3501570 2767953,33 2088435,67 1393183,33

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S5

725882,667

C vs. Area
12 10 Concentraccion 8 6 4 2 0 0 1000000 2000000 Area 3000000 4000000 C vs. Area Linear (C vs. Area) y = 3E-06x - 0.0492 R = 0.9997

Determinar la concentracin de la glucosa por HPLC de una muestra de fermentacin, si ste se diluye de 1 a 10 ml acondicionando el pH en la Columna HPX-87P (especfica para carbohidratos) y filtrando con una membrana Millipore (filtro), el resultado del cromatograma nos da los siguientes resultados:

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El tiempo de retencin de la glucosa se encuentre entre: Glucosa: 12,5 a 13,1 min Entonces llevamos este tiempo de retencin a los resultados del cromatograma all podemos apreciar que los valores que se acercan son: Tiempo de Retencin (min) Area 11,471 23167 13,012 253486 Entonces tomamos el mximo de 13,012 y lo llevamos a la recta de calibracin y = 3E-06x - 0,0492 R = 0,9997 y = 3E-06* (253486)- 0,0492 y= 0,027258 (g/l)

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12 10 Concentraccion 8 6 4 2 0 0 1000000 2000000 Area 3000000 4000000 C vs. Area Series2 Linear (C vs. Area) y = 3E-06x - 0.0492 R = 0.9997

3. CUESTIONARIO
Que pH de trabajo se debe acondicionar la muestra para la utilizacin de la columna HPX-87P? (marca Biorad) El pH puesto puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero tambin neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografa puede variar, pero en general mejoran la separacin cromatogrfica. Qu cuidados se debe tener con muestras para la determinacin por HPLC? CARACTERISTICAS DE LA FASE MOVIL Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmvil, otras modificaciones de la fase mvil pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como que la entropa de la interfase compuesto-disolvente est controlada precisamente por la tensin superficial, la adicin de sales tiende a aumentar el tiempo de retencin. DIMETRO INTERNO El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que determina la cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y tambin influye en su sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms grande (>10 mm) se utilizan normalmente en la purificacin de compuestos para su utilizacin posterior. En cambio, las columnas de dimetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el anlisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del consumo de disolventes que conllevan.

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MEDIDA DE LAS PARTCULAS La mayora de HPLC tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partculas esfricas de silica. Estas partculas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5\mum de dimetro las ms utilizadas. Partculas ms pequeas ofrecen una mayor superficie y una mejor separacin, pero la presin que se requiere por obtener una velocidad lineal ptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del dimetro de la partcula. Esto significa que disminuir la medida de las partculas a la mitad, aumentara la resolucin de la columna, pero a la vez, aumentara la presin necesaria en un factor de ocho. TAMAO DE PORO Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Los poros pequeos proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida proporcionan una cintica mejor, especialmente para los compuestos de tamao ms grande; por ejemplo, una protena que sea ligeramente ms pequea que el tamao de los poros puede entrar, pero difcilmente saldr con facilidad. PRESIN DEL SISTEMA La presin de las bombas es variable segn el modelo y fabricante Qu Tamao poro de filtro es recomendable utilizar para acondicionar las muestras analizadas por HPLC? El tamao de poro debe ser pequeo ya que proporcionan una mayor superficie Describir el funcionamiento de una Bomba de HPLC. Su rendimiento se mide en su habilidad para generar un flujo constante y reproducible. La presin puede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmsferas). Los aparatos ms modernos de HPLC incorporan mejoras para poder trabajar a presiones ms altas y, por lo tanto, poder utilizar partculas de tamao ms pequeo en las columnas (< 2 micrometros). Describir tipos de detectores de una mquina HPLC. En sistemas cromatogrficos que utilizan detectores ultravioleta, la respuesta de sos depende de la absortividad de los correspondientes analitos, por lo que normalmente se utilizan los denominados factores de respuesta.

4. BIBLIOGRAFIA
Dolan, J. W. y Snyder, L. R. 1989 Troubleshooting LC Systems: A Comprehensive Approach to Troubleshooting LC Equipment and Separations. Humana Press, Totowa, New Jersey.

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Dong, M.W. 2006. Modern HPLC for Practicing Scientists. John Wiley and Sons, New York. (http://lchromatography.com/hplcfind/index.html.