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Lingegneria genetica delle piante

di Francesco Pazzi

Introduzione Le agrobiotecnologie, ovvero, lutilizzo di organismi, sistemi e processi biologici per la produzione di beni e servizi nel campo agroalimentare, comprendono una gamma amplissima di applicazioni che vanno da processi tradizionali molto semplici, come quelli usati nella produzione di birra, vino e formaggi, a processi molecolari altamente sofisticati e complessi, come le tecniche del DNA ricombinante, impiegate per introdurre caratteristiche nuove nelle variet vegetali e animali commercialmente importanti. In generale, tutte queste applicazioni vengono suddivise in due grandi gruppi: biotecnologie tradizionali e biotecnologie moderne. Le prime comprendono il complesso delle tecniche convenzionali (lievitazione, fermentazione, ecc), mentre, le seconde, abbracciano tutti i metodi di modificazione genetica basati sulle tecniche del DNA ricombinante e della fusione cellulare includendo anche le innovazioni apportate ai processi biologici tradizionali. Grazie a queste tecniche oggi possibile intervenire sul patrimonio genetico di animali, piante, batteri e virus modificandone alcune caratteristiche. I possibili utilizzi sono numerosi e potenzialmente applicabili in campo medico (terapia genica, produzione di farmaci e vaccini), in campo ambientale (risanamento e ripristino di aree contaminate, biomonitoraggio, sviluppo di nuovi indicatori ambientali), in campo industriale (produzione di plastiche, resine, ecc.), in campo agroalimentare e zootecnico (piante ed animali transgenici resistenti a stress biotici ed abiotici o con modificate caratteristiche nutrizionali, impiego di marcatori molecolari per il breeding). I principali progressi nelle applicazioni pratiche delle biotecnologie in campo vegetale, sono stati compiuti negli ultimi venti anni mettendo a frutto le conoscenze accumulatesi in diverse discipline, tra le quali la genetica, la microbiologia, la biologia molecolare e la fisiologia vegetale. In particolare, le biotecnologie vegetali hanno preso lavvio dalla fusione delle metodiche di coltura in vitro di cellule e/o tessuti vegetali con la tecnologia del DNA ricombinante e con lo sviluppo di sistemi per inserire singoli geni direttamente nel nucleo cellulare (Tab. 1).

Tab. 1: scala temporale delle principali innovazioni che hanno contribuito allo sviluppo dellingegneria genetica. 1902 Rigenerazione di una pianta intera da una coltura di cellule in vitro. 1935 Mantenimento in coltura di linee cellulari di salice e tabacco. Viene dimostrato che il DNA il materiale contenente linformazione 1944 genetica. Viene definita la struttura tridimensionale del DNA e decifrato il codice 1953 genetico. 1958 Produzione di embrioni somatici da cellule di carota in coltura. 1970 Scoperta degli enzimi di restrizione. 1974 Primi studi di ingegneria genetica su Agrobacterium tumefaciens. 1977 Scoperta di un metodo enzimatico per il sequenziamento del DNA. Il gene umano dellinsulina viene fatto esprimere nel batterio Escherichia 1978 coli. Moltiplicazione del DNA in vitro mediante reazione polimerasica a catena 1980 (PCR). Produzione della prima pianta trangenica: una pianta di tabacco resistente ad 1983 un antibiotico. 1985 Primo test di campo con piante transgeniche di cotone. 1988 Invenzione del metodo biolistico. Viene autorizzata negli Stati Uniti la commercializzazione del primo prodotto 1994 di una pianta transgenica: il pomodoro Flavr Savr. Oggi Milioni di ettari coltivati a trangenico.

Per tecniche di coltura in vitro si intendono tutte quelle metodiche che consentono di coltivare piante o porzioni di esse in laboratorio, utilizzando terreni di coltura artificiali composti da: sali minerali, vitamine, fonti di carbonio (ad esempio saccarosio e glucosio) e amminoacidi. Le tecniche di coltura in vitro sfruttano una caratteristica peculiare delle cellule vegetali, la totipotenza, grazie alla quale possibile produrre delle piante adulte, fertili, partendo da una o poche cellule trasformate. Totipotenza indica infatti la capacit di una cellula vegetale adulta, gi differenziata, che ha cio acquisito tutte quelle caratteristiche morfologiche e funzionali che distinguono per esempio una cellula della foglia da una della radice, di ritornare ad uno stadio non differenziato. Nel campo della biologia molecolare Avery e collaboratori nel 1944 dimostrarono inequivocabilmente che il DNA (acido desossiribonucleico) il materiale genetico, cio, la molecola che contiene linsieme dellinformazione genetica. Linformazione genetica il patrimonio specifico della specie e dellindividuo che regola e controlla le funzioni cellulari, il loro processo di sviluppo e la loro risposta agli stimoli ambientali, ovvero contribuisce a determinare in relazione con lambiente, le 2

caratteristiche e lo sviluppo di un organismo vivente. I geni non sono altro che frammenti pi o meno lunghi di DNA. Nellarco di poco pi di ventanni si giunse a stabilire la struttura tridimensionale del DNA (Watson e Crick, 1953), a descrivere il flusso dellinformazione genetica dal DNA alle proteine, esecutrici materiali dei processi cellulari nonch a decifrare il codice genetico, cio a capire come la sequenza di nucleotidi che costituiscono la struttura primaria del DNA possa essere tradotta nella sequenza specifica di amminoacidi che compongono le proteine (Nirenberg 1961, Nirenberg 1964, Ghosh 1967). Agli inizi degli anni 70 Smith e Wilcox individuarono in vari microrganismi un enzima, chiamato enzima di restrizione, in grado di tagliare il DNA in un punto preciso della sua sequenza. Questa scoperta si rivel determinante nel processo di sviluppo delle tecniche del DNA ricombinante; infatti, queste sostanze chimiche funzionano come delle forbici, grazie alle quali possibile tagliare e ricomporre i pezzi di DNA necessari per produrre le caratteristiche desiderate nelle piante di interesse (Fig. 1). Ad esempio, il mais MON810 resistente alla piralide stato costituito tagliando e ricucendo attraverso questi enzimi, un complesso genetico (costrutto genico) formato in parte da pezzi di DNA provenienti dal virus del mosaico del cavolfiore e, in parte, dalla sequenza del gene batterico cry1Ab del Bacillus thuringiensis che produce la tossina CRY. Le piante adulte, generate in laboratorio attraverso una o poche cellule totipotenti, trasformate con questo costrutto genico, sono perci in grado di produrre in tutte le loro parti, comprese foglie e granella, la tossina nociva che una volta ingerita dalle larve di piralide distrugge lepitelio intestinale degli insetti provocandone la morte.

Fig. 1: schema del costrutto genico che permette lespressione del transgene allinterno delle piante trasformate.

Nel 1980 K. Mullis e collaboratori inventarono una tecnica per moltiplicare in vitro le sequenze di DNA per mezzo di una reazione polimerasica a catena (PCR). La tecnica PCR stata la pi grande innovazione degli anni 80 nel campo della biologia molecolare ed ha consentito enormi sviluppi in tutti i campi della ricerca biologica, biomedica e nelle applicazioni diagnostiche. Attraverso una speciale macchina denominata termociclatore che in grado di riprodurre le temperature ottimali per la replicazione del DNA e con lutilizzo di particolari sostanze (enzimi), questa reazione consente di moltiplicare la stessa sequenza per migliaia di volte, rendendola cos visibile su particolari supporti. Questo consente perci di isolarla dal resto del DNA ed inserirla successivamente nel nucleo delle cellule che, una volta trasformate, origineranno la pianta geneticamente modificata. Infatti, nella maggior parte degli organismi, il DNA costituito da una lunga sequenza di basi azotate che appaiandosi tra loro a due a due formano una struttura a doppia elica, la quale a sua volta si avvolge su strutture proteiche formando i cromosomi; linsieme dei cromosomi forma il genoma dellorganismo specifico. Ad esempio, il DNA delluomo costituito da due filamenti appaiati tra loro lunghi circa 3 miliardi di paia di basi e suddivisi in 46 cromosomi appaiati a due a due, mentre il genoma del mais costituito da 20 cromosomi sempre appaiati tra loro e formati da circa 2,7 miliardi di paia di basi. Grazie a questa struttura superavvolta lelica del DNA che, se srotolata raggiungerebbe nel caso delluomo una lunghezza di circa 1,8 metri, pu essere racchiusa allinterno del nucleo cellulare di soli 6 micrometri di diametro, ovvero, 6 4

millesimi di millimetro. Quindi, grazie alla scoperta della PCR, ovvero alla possibilit di moltiplicare per migliaia di volte la sequenza specifica di basi azotate che costituisce un gene, allinterno dellintera sequenza che compone il genoma di un organismo, oggi possibile isolare e studiare con maggior facilit i geni che potranno poi essere utilizzati per la trasformazione di piante e per numerose altre applicazioni. Le prime scoperte sulla possibilit di trasferire linformazione genetica nel genoma dei vegetali sono legate agli studi sul batterio Agrobacterium tumefaciens, un batterio patogeno che in natura provoca la galla del colletto nelle piante dicotiledoni, tumore spesso visibile sugli alberi dei viali cittadini in cui le eccessive e spesso scorrette potature aprono ferite che favoriscono la penetrazione del patogeno. Sulla base di queste scoperte fu in seguito sviluppata la tecnica di trasformazione che prevede linfezione delle piante con un A. tumefaciens geneticamente modificato, nel cui DNA, i geni patogeni costitutivi sono sostituiti da geni esogeni di interesse con funzioni specifiche. Unaltra tecnica utilizzata per introdurre linformazione genetica nelle cellule vegetali il metodo detto biolistico. Questo sistema stato ideato originariamente per ovviare al fatto che molte specie di interesse agrario, quali ad esempio i cereali, non sembrava potessero essere infettati da A. tumefaciens. Si pens quindi di usare un sistema di trasformazione meccanico, in grado di superare di forza la barriera costituita dalla parete cellulare. Nel 1988 un gruppo di ricerca americano (Sanford et al., 1988) ide un sistema basato sul bombardamento delle cellule (meristemi o calli in coltura) con microproiettili (oro, tungsteno) sulle quali era stato fatto aderire il DNA da inserire. Questo metodo, che originariamente utilizzava uno strumento a scoppio, con tanto di polvere da sparo, da cui il nome di biolistica (con chiaro riferimento alla balistica), si avvale ora di strumenti a pressione e si applica in particolare a quelle specie vegetali che non possono essere infettate da A. tumefaciens o che sono recalcitranti alla rigenerazione in coltura in vitro (Fig 2).

Fig. 2: trasformazione con Agrobacterium tumefaciens e con metodo biolistico

Con la tecnica dellinfezione con Agrobacterium fu prodotta nel 1983 la prima pianta transgenica: una pianta di tabacco resistente ad un antibiotico (Herrera-Estrella et al., 1983). Successivamente furono prodotte piante geneticamente modificate con caratteristiche di resistenza agli insetti, ai virus e ai batteri. Nel 1994 venne autorizzata negli Stati Uniti la commercializzazione del primo prodotto di una pianta transgenica: il pomodoro Flavr Savr, caratterizzato da frutti che si mantenevano compatti anche a maturazione avanzata. Questo prodotto fu ritirato dal commercio dopo tre anni perch fortemente suscettibile alle malattie e scarsamente produttivo. Nel 1994 fu autorizzata la commercializzazione negli Stati 6

Uniti della soia Roundup Ready, resistente allerbicida glifosato e del mais YieldGard, resistente alla piralide (Ostrinia nubilalis). Nel 1995 furono realizzate piante transgeniche di patata con il gene Bt e il Dipartimento dellAgricoltura degli Stati Uniti (USDA) diede via libera alla commercializzazione di una pianta di zucca resistente a due tipi di virus. Ad oggi, la coltivazione di piante geneticamente modificate coinvolge una superficie di diversi milioni di ettari. Sperimentazione e ricerca La ricerca nel settore dellingegneria genetica delle piante, fino ad oggi, stata orientata verso tratti genetici di carattere agronomico, quali ad esempio: tolleranza agli erbicidi (glifosato, glufosinato); resistenza agli insetti (Bt); resistenza a virus; resistenza a funghi; resistenza a stress ambientali (basse temperature, salinit, ecc.); aumento della produttivit. Negli ultimi anni, la ricerca si sta indirizzando verso nuovi settori che utilizzano le piante per la produzione di alimenti ad alto valore aggiunto, i cosiddetti OGM di seconda generazione. La modificazione del metabolismo delle piante per ottenere prodotti ad elevato valore nutrizionale pu intervenire a diversi livelli attraverso la modificazione dei costituenti della pianta, quali: proteine, carboidrati, grassi, vitamine, antiossidanti, minerali, isoflavonoidi, glucosinolati, fitoestrogeni, lignine, tannini condensati e anti-nutrienti (fitasi, rimozione di tossine ecc.). Tali modificazioni, volte ad aumentare il valore nutrizionale degli alimenti o a produrre sostanze volte alla prevenzione di alcune malattie, sono spesso confuse con le applicazioni che utilizzano le piante come bioreattori - per la produzione di composti quali peptidi bioattivi, vaccini, anticorpi ed enzimi per lindustria farmaceutica e specifici composti (ad esempio: poliidrossibutirrato) di interesse per la produzione di plastiche biodegradabili - classificati come OGM di terza generazione. La differenza fondamentale tra le due categorie, che lutilizzo delle piante come farmaci richiede dosi di somministrazione precise come avviene per un qualsiasi farmaco, mentre i nutraceuticals sono prodotti alimentari ad uso diretto senza precise dosi di somministrazione come, per esempio, il riso transgenico con un maggior contenuto

di vitamina A (Golden Rice). La strada per la commercializzazione di questi prodotti resta ancora lunga. Tra gli OGM di prima generazione, al vaglio delle autorit competenti e di possibile prossima introduzione, non risultano infatti nuovi tratti genetici rispetto a quelli gi autorizzati in Europa. Si tratta infatti di mais, riso, soia, barbabietola, colza e cotone geneticamente modificati per conferire loro la resistenza ad alcuni insetti patogeni (Piralide, Diabrotica, Sesamia), oppure per renderli tolleranti agli erbicidi glifosato e glufosinato o per entrambe le caratteristiche. Per quanto riguarda gli OGM di seconda generazione da circa 10 anni che si discute sui possibili benefici che possono derivare dallintroduzione in commercio del Golden Rice, una variet di riso creata per produrre alte concentrazioni di betacarotene (pro-vitamina A), allo scopo di contrastare la malnutrizione causata da carenze di vitamina A. I numerosi problemi legati alla propriet intellettuale dei circa 70 brevetti utilizzati per produrre la tecnologia, quelli relativi al dosaggio di riso indispensabile per somministrare una dose giornaliera di vitamina A circa 300 grammi con le variet transgeniche ottenute fino ad ora e lincertezza sui possibili impatti su ambiente e salute di tale riso, hanno fatto si che fino ad ora non sia mai stata presentata a livello mondiale nessuna richiesta per la commercializzazione del Golden Rice, la cui sperimentazione ancora in corso. Tra gli OGM di seconda generazione, quelli che sembrano invece pi vicini ad una possibile introduzione sul mercato europeo sono la patata Amflora, geneticamente modificata per produrre nei tuberi un maggior quantitativo di amilopectine che ne determina una maggior resa in amido e, il mais Mavera, la cui granella presenta un maggior contenuto in lisina, che ne aumenta il valore nutrizionale come ingrediente per la produzione di mangimi. Un linea di ricerca che negli ultimi tempi sta riscuotendo particolare interesse sia per il settore agricolo che industriale la produzione di biomasse da energia. In questo campo, il mais sembra la coltura pi vicina ad una possibile introduzione sul mercato per tali scopi. Al momento infatti al vaglio delle autorit competenti europee una richiesta di autorizzazione per il mais 3272, geneticamente modificato dalla Syngenta per produrre un maggior contenuto di alfa-amilasi nella granella dal quale ne deriva un aumento della resa in etanolo nei processi industriali. Oltre alla modificazione di piante erbacee e legnose, sono in fase sperimentale anche microrganismi geneticamente modificati per accelerare i processi di fermentazione industriale volti alla produzione di bionergie.

Per quanto riguarda gli OGM di terza generazione, allo stato attuale, visto lelevato rischio per lambiente e per la salute che pu derivare dallincrocio o dalla commistione accidentale dei semi di colture tradizionali e quelli ingegnerizzati per la produzione di farmaci, la ricerca in questo settore limitata, a livello europeo, in ambiente confinato e controllato, costituito in generale da piccole serre. In altri paesi, sono invece presenti prove sperimentali di pieno campo per testare piante modificate per la produzione di farmaci. Ad esempio negli Stati Uniti, gi dal 1997 si stanno conducendo prove in campo con variet di riso trasformate a scopo farmaceutico. Tra queste, il Ventria rice, riso transgenico costituito dalla Ventria Bioscience allo scopo di produrre tre composti farmaceutici con attivit antimicrobica: la lattoferrina, il lisozima e lalfa1-antitripsina. Sono inoltre in fase di sviluppo numerose altre linee di ricerca per la trasformazione di piante in grado di produrre farmaci e vaccini sia per lutilizzo veterinario che per luomo (Tab. 2). Tab. 2: alcune linee di ricerca per la produzione di proteine importanti per la salute umana ed animale prodotte in piante transgeniche. Pianta Colza Tabacco Tabacco Tabacco Tabacco Tabacco Riso, rapa Tabacco Tabacco Riso Tabacco, pomodoro Pomodoro Patata Tabacco, patata, mais Tabacco, patata, lattuga Erba medica, arabidopsis Proteina Irudina Somatotropina GMCSF (fattore di crescita) Eritropoietina EGF (fattore di crescita) Emoglobina Interferone-alfa Interferone-beta Trimeri di collagene Alfa-1-antitripsina ACE, enzima convertitore dellangiotensina Glicoproteina del virus della rabbia Proteina del vibrione del colera Ceppo di E. coli enterotossico Proteina di superficie del virus dellepatite B Afta epizootica Uso terapeutico Inibitore della trombina Ormone della crescita Neutropenia Anemia Ferite Sostitutivi del sangue Epatite B e C Epatite B e C Collagene Fibrosi cistica Ipertensione

Vaccini

A fronte dellampia attivit di ricerca svolta fino ad oggi nel settore dellingegneria genetica in campo vegetale, soli pochi prodotti hanno raggiunto il mercato o si sono avvicinati alla richiesta di autorizzazione per la loro immissione nellambiente e in commercio. Questo perch il tasso di mortalit della ricerca transgenica, ossia il numero di tentativi di sviluppo di variet o razze transgeniche che portano i caratteri desiderati estremamente alto. Stando ai pochi dati disponibili, si stima che il costo per portare una variet transgenica sul mercato si aggiri fra i 30 e i 50 milioni di dollari (altre stime parlano anche di 300 milioni) per un ciclo di ricerca e sviluppo pari a 10-12 anni. Si intuisce quindi che solo pochi soggetti industriali siano capaci di sostenere uno sforzo cos impegnativo e che, il tasso di remunerazione dellinvestimento possa essere assicurato solo da prodotti di diffusa commerciabilit e rivolti a mercati solvibili.

Bibliografia
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