Cromatografa y Vigilancia de la Fermentacin Malolctica

VIGILANCIA DE LA FERMENTACIN MALOLCTICA Al terminar las fermentaciones, el vino no est protegido por SO2. El desprendimiento de gas carbnico que se produce durante la fermentacin malolctica o no se percibe o se confunde con el exceso de gas carbnico que resulta de la fermentacin alcohlica. Son necesarios controles analticos y gustativos regulares para detectar toda la desviacin nefasta para la calidad del producto. El conocimiento del pH del vino final de la fermentacin alcohlica permite prever las dificultades de multiplicacin de las bacterias indgenas. La determinacin de la acidez voltil permite revelar desviaciones e intervenir a tiempo. La cromatografa de los cidos orgnicos es interesante para darse cuenta del comienzo de la fermentacin malolctica e indispensable para confirmar la desaparicin completa del cido mlico. La determinacin enzimtica del cido mlico es ms precisa. En caso de duda sobre el final de una fermentacin malolctica, puede ser juicioso hacer la determinacin en un laboratorio enolgico. Al final de la fermentacin malolctica, los azcares residuales pueden ser atacados por las bacterias lcticas, provocando un aumento de la acidez voltil; es el picado lctico. En este estadio, las levaduras patgenas del gnero Brettanomyces pueden desarrollarse. Producen aromas muy desagradables a cuadra y aminas bigenas susceptibles de provocar alergias. En cuanto haya desaparecido el cido mlico, se trasiega el vino con aireacin a una cuba fra y se le aade anhdrido sulfuroso para estabilizarlo. CROMATOGRAFA DE LOS CIDOS ORGNICOS Material necesario: - Papel Whatman n1: una hoja de 20cm x 20cm aproximadamente. - Una cubeta par cromatografa o un tarro de dos litros que cierre hermticamente (bote de conservas). - Micro-pipetas: tubos de vidrio afilados a la llama o, en su defecto, cerillas cortadas por el extremo.

- Un secador de pelo. - Vasos de precipitados de 50 ml. Productos necesarios: - n-butanol 1g de azul de bromofenol por litro. - cido actico al 50%. Se mezcla 50 ml de n-butanol con 1 g/l de azul bromofenol con 25 ml de cido actico al 50%. El disolvente as constituido se coloca en la cubeta de cromatografa. (Es utilizable durante varios das). Principio de la cromatografa de los cidos orgnicos: Se deposita una pequea cantidad de vino sobre un papel especial (papel Whatman) en forma de mancha de dimetro limitado (5 mm). Un lado de la hoja de papel est sumergido en el disolvente. ste asciende por el papel y arrastra los diferentes constituyentes del vino con una velocidad propia de cada uno de ellos. De esta forma, los cidos fijos del vino acaban separndose unos de otros: - El cido tartrico, fuertemente retenido por el papel, se desplaza poco. Se queda, pues, en la base de la hoja. - Los cidos lctico y succnico, por el contrario, son fcilmente arrastrados por el disolvente y migran hacia lo alto del papel. - El cido mlico presenta un comportamiento intermedio. Los diferentes cidos son despus revelados por un reactivo: el azul de bromofenol. Mtodo opertativo: El disolvente preparado como se ha indicado anteriormente (butanol-actico) se coloca con anterioridad en la cubeta con el fin de saturar la atmsfera. La cubeta se mantiene hermticamente cerrada. Se trazan finalmente con lapicero la lnea de depsito de las manchas y las marcas. A 4 cm del borde inferior de la hoja de papel, se depositan las gotas de las distintas muestras que se van a analizar. En el centro de las diferentes muestras, tambin se deposita una gota de disolucin de cido mlico que servir como testigo. El depsito de lquido se hace con la ayuda de miro-pipetas. Hacen falta tantas micro-pipetas como muestras de vino, ms una para el cido mlico, con el fin de evitar cualquier contaminacin de una muestra por otra. El volumen depositado es pequeo con el fin de que las manchas tengan un dimetro que no sobrepase los 5 mm. Un secador de pelo sirve para secar rpidamente la hoja de papel y repetir el depsito encima de la misma mancha; as de ocho a diez veces. La hoja de papel Whatman es entonces enrollada en forma de cilindro sin que los bordes se toquen y se coloca delicadamente en la cubeta sin que toque las paredes. Ni las manchas de muestras de vino ni de cido mlico deben sumergirse en el disolvente. Se cierra hermticamente la cubeta. El disolvente mugra hsta 1 2 cm del borde superior de la hoja. Esto necesita de tres a cuatro horas. Seguidamente, se retira el papel de la cubeta y se cuelga de un hilo para que se seque; su color pasa de amarillo a azul y se revelan manchas amarillas, que corresponden a los cidos orgnicos del vino. Cuando hay cido mlico en el vino, aparece una mancha amarilla sobre la hoja al mismo nivel que la mancha del testigo. Si esta mancha no aparece, es que la fermentacin malolctica ha

terminado. Interpretacin: - Presencia de cido tarrico y de cido mlico; no hay fermentacin malolctica. Aunque aparece una ligera mancha de cido lctico, ste ha podido formarse en el transcurso de la fermentacin maolctica. - Presencia de los cidos tartrico, mlico y lctico: la fermentaicn malolctica ha comenzado. Las cantidades de cidos mlico y lctico pueden ser evaluadas por el tamao de las manchas, pero esta evaluacin es slo aproximada.

CROMATOGRAFA La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia y la fsica. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Las tcnicas cromatogrficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Despus de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separndose, pasan por un detector que genera una seal que puede depender de la concentracin y del tipo de compuesto. Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de los compuestos da como resultado una retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla. La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente: - Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas sntesis). - Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad analtica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeas. La cromatografa en papel: Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar anlisis cualitativos ya que pese a no ser una tcnica muy potente no requiere de ningn tipo de equipamiento. La fase estacionaria est constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeas gotas de la solucin y evaporando el disolvente.

Luego el disolvente empleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase mvil en el fondo. Despus de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se vern las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografa eficaz: la eleccin del disolvente y la del papel de filtro.