INSTITUTO POLITCNICONACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE FISIOLOGA

PRCTICA 4 POTENCIAL DE DIFUSION Y POTENCIAL DE LESIN

INTEGRANTES:

EQUIPO 5

GRUPO 4FM2

PROFESORES:

FECHA DE ENTREGA 6 DE NOVIEMBRE DE 2012

INTRODUCCIN La tendencia que tienen dos soluciones separadas por una membrana para llegar al equilibrio expresa la tendencia general de los sistemas qumicos para llegar a un equilibrio de sus potenciales qumicos y energticos, fluyendo de regiones de mayor potencial a las de menor. Por lo tanto, el potencial de difusin se denomina como la diferencia de potencial generada a travs de una membrana cuando un soluto con carga (ion) difunde debido al gradiente de concentracin, es decir, se debe a la difusin de los iones y solo puede generarse si la membrana es permeable a ese ion (Martin, 2006) Cuando el flujo del ion, dado por la diferencia de concentraciones llega a ser compensado por el flujo de repulsin, dado por la diferencia de potencial elctrico, se dice entonces que el ion esta en equilibrio electroqumico a travs de la membrana (Alva et al., 2010). Este potencial esta definido por la ecuacin de Nerst:

Donde E(ion)= potencial de equilibrio (volts) R= constante de los gases T= temperatura absoluta F= constante de Faraday z= valencia del ion [ION]i = concentracin del ion en el interior de la clula [ION]o = concentracin del ion en el exterior de la clula Es decir, que el potencial de equilibrio de Nerst relaciona la diferencia de potencial a ambos lados de una membrana biolgica en el equilibrio con las caractersticas relacionadas con los iones del medio externo e interno y de la propia membrana semipermeable. La ecuacin de Nerst se emplea para predecir la direccin del flujo inico en los siguientes casos: 1.- Cuando la diferencia de potencial medida a travs de la membrana es igual a la calculada mediante la ecuacin de Nerst determinando para un ion determinado. En esta situacin el ion se encuentra en equilibrio electroqumico y no habr flujo neto del mismo a travs de la membrana. 2.- Cuando el potencial de elctrico medido es del mismo signo que el calculado por la ecuacin de Nerst para un ion determinado, pero de mayor valor, la fuerza elctrica es superior causada por el gradiente de concentracin, por lo que habr movimiento neto de dicho ion en la direccin determinada por la fuerza elctrica. 3.- Cuando la diferencia de potencial elctrico medida es del mismo signo, pero de menor cuantidad, que la calculada por la ecuacin de Nerst , la fuerza debida al gradiente de concentracin es superior a la elctrica, y el movimiento neto de ion tiende a producirse en la direccin determinada por la diferencia de concentracin.

4.- Cuando la diferencia de potencial elctrico medida es de signo opuesto al predicho por la ecuacin de Nerst, tanto la fuerza elctrica como el gradiente de concentracin se encuentran orientados en el mismo sentido y consiguiente el ion no se encuentra en equilibrio, por lo que tendra a fluir en direccin determinada por ambas fuerzas. Julius Bernstein fue el primero, en 1902, en proponer una hiptesis satisfactoria para explicar el origen del potencial de membrana en reposo en el nervio y en las fibras musculares. Mediante anlisis qumico determino que el interior es rico en K+ y contiene poco Na+ y Cl-. Adems comprob que en el interior de la clula hay aniones a los que la membrana en reposo no es permeable; basndose en esos datos, Bernstein postulo la siguiente hiptesis: El voltaje de transmembrana es consecuencia de una desigual distribucin de iones K+, como puede predecirse mediante la ecuacin de Nerst (Martin, 2006) Bernstein cort fibras musculares de un msculo de rana e insert un electrodo en el rea cortada, haciendo contacto eficaz con el liquido interno de las fibras musculares, pudiendo adems modificar el liquido externo del musculo (Alva et al., 2010). Al registro que obtuvo se le llamo potencial de lesin. El potencial de lesin es el potencial desarrollado entre las partes lesionada y no lesionada de un nervio, debido a la exposicin de la superficie interna con carga negativa de la membrana polarizada en el lugar de la lesin. En los tejidos excitables, la lesin produce despolarizacin en la zona lesionada (potencial de lesin), lo que origina un flujo de corriente elctrica entre ambas zonas (corriente de lesin). En la fibra muscular esqueltica, la despolarizacin causada por una lesin es un proceso irreversible que se propaga gradualmente y despolariza finalmente a toda la clula. Asimismo, el potencial de lesin se aproxima al potencial transmembranal debido a que la superficie lesionada esta casi en el potencial del interior de la clula (Rothstein et al., 2005). La ecuacin de Goldman-Hodkin-Katz predice el potencial de membrana para mltiples iones. Esta se utiliza para calcular el potencial de membrana en reposo resultante de la contribucin de todos los iones que pueden atravesar la membrana: Esta ecuacin incluye los valores de permeabilidad de la membrana porque la permeabilidad de un ion influye en su contribucin al potencial de membrana. Si la membrana en impermeable a un ion, ese ion no afectara el potencial de membrana. La contribucin de cada ion al potencial de membrana es proporcional a su capacidad para atravesar la membrana. La ecuacin de Goldman-Hodking-Katz:

Em= Potencial de membrana en reposo. R= Constante de los gases T=Temperatura absoluta F=Constante de Faraday P= Permeabilidad relativa de la membrana al ion indicado con el subndice. [ion in], [ion out] = Concentraciones del ion dentro y fuera de la clula. Aunque esta ecuacin parece muy complicada, se puede simplificar en estas palabras: el potencial de membrana en reposo esta determinado por las contribuciones combinadas del producto (gradiente de concentracin) x (permeabilidad de la membrana) para cada ion. Si la membrana no es permeable aun ion el trmino de permeabilidad de este ion ser cero y el ion abandonara la ecuacin. La ecuacin de Goldman predice los potenciales de membrana sobre la base de concentraciones inicas y permeabilidades de membrana dadas y explica porque la ligera permeabilidad de la clula al Na+ hace que el potencial de membrana en reposo sea ms positivo que el E determinado con la ecuacin de Nerst. La ecuacin de Goldman

tambin se puede utilizar para predecir lo que sucede con el potencial de membrana cuando cambian las concentraciones inicas o las permeabilidades de las membranas. (Silverthorn, 2009) Para obtener el potencial de difusin se utiliza un huevo que se encuentra constituido as, en la parte externa existe en primer lugar una cutcula o pelcula, de aproximado 10m de grosor acta como revestimiento, disminuyendo la porosidad, la cascara propiamente dicha tiene una matriz esponjosa que emite hacia el interior prolongaciones denominadas protuberancias mamilares. En la parte interna de la cascara existen dos membranas testceas llamadas capa testcea externa (48 m) e interna (22 m) formadas por un entramado de fibras constituidas por un ncleo proteico (4.2%), as como de compuestos inorgnicos (94.3%) como el calcio, fosforo, magnesio, sodio, selenio y en gran proporcin el potasio (2000mg) Estas dos lminas o subcapas estn fuertemente adheridas entre si en la mayor parte de la superficie interior de la cscara salvo en la porcin obtusa del huevo en la cual se encuentran separadas por la cmara de aire. La lmina interna presenta fibras ms finas que la capa externa y muestra una superficie lisa y homognea debido a la presencia de un material no fibrilar conocido como manto. (Gil, 2010). Para la determinacin del potencial de lesin, se utiliza musculo gastrocnemio de rana, el cual por su funcin en la transmisin de impulsos nerviosos para la contraccin del mismo. Los potenciales de electrodo se definen como potenciales de celda para una celda que consiste en el electrodo en cuestin que acta como ctodo y el electrodo estndar de hidrogeno que lo hace como nodo, el potencial de electrodo es de hecho el potencial de una celda electroqumica que implica un electrodo de referencia cuidadosamente definido. (Wilches, 2007). HIPOTESIS Al cambiar el gradiente de concentracin iones potasio ([k+]) en la membrana del huevo, esperamos un cambio en el potencial intramembranal acorde con los resultados obtenidos mediante la ecuacin de Nerst. Esperamos que en la membrana de musculo de la rana exista permeabilidad selectiva al ion [k+], al cambiar el gradiente de ese ion se espera un cambio del potencial de lesin de acuerdo con los resultados obtenidos mediante la ecuacin de Goldman. OBJETIVOS GENERALES Determinar el efecto del cambio de gradiente de concentracin del ion [K+] sobre el potencial de difusin. Determinar el efecto del cambio del gradiente de concentracin el ion [K+] sobre el potencial de lesin.

OBJETIVOS PARTICULARES Determinar la diferencia de potencial generada a diferentes concentraciones de KCl 1, 2.5, 5, 10, 20, 50 y 100mM extracelulares respecto a la de KCl 400 mM contenida en un huevo de gallina y compararlos con los resultados obtenidos mediante la ecuacin de Nerst Determinar la diferencia de potencial generada por las soluciones de Ringer y K2SO4 10, 20, 50, 100, 200mM extracelulares respecto a la solucin de LIC asociada a la parte lesionada del msculo gastrocnemio de rana y compararlos con los resultados obtenidos mediante la ecuacin de Goldman.

FUNDAMENTOS Se utilizo la membrana testcea interna de huevo ya que es permeable al ion potasio. Donde se lleva a cabo un potencial de difusin generado a travs de la membrana cuando un soluto con carga (ion) difunde debido al gradiente de concentracin, es decir se debe a la difusin de los iones y slo puede generarse por que la membrana testcea de huevo es permeable a ese ion. Se utilizo el nervio citico de rana debido a que los en estos mtodos se suelen hacer estudios en clulas musculares o nerviosas, debido a que estas clulas muestran una notable especializacin para este tipo de actividades. La rana suele utilizarse como modelo en este estudio tanto por la facilidad de disponer de estos animales, como por el hecho de presentar muchos aspectos de su anatoma interna claramente visibles. Utilizamos el potencial de lesin donde se mide el de varias clulas (paralelos) si se afecta la diferencia de permeabilidad afecta a la pendiente. Se utilizo KCl y KSO ya que tanto el ion Cl- como el SO-- son impermeables a las membranas del huevo y del musculo gastrocnemio respectivamente.

METODOLOGIA

PRACTICA 4 POTENCIAL DE DIFUSIN Y POTENCIAL DE LESIN

Potencial de difusin

Potencial de lesin.

En la cmara de aire del huevo romper el cascaron 3 cm, retirar membrana, desechar membrana y enjuagar con HO destilada.

Descerebrar y desmedular una rana, cortar la piel de una pata, exponer el musculo gastrocnemio, separndolo cortando los tendones del hueso.

Con pinzas de diseccin golpear levemente el cascaron en el extremo opuesto de la cmara, desprender cascaron.

Pasar el musculo por el anillo de goma hasta la mitad, cortar la mitad restante y jalarlo, para que la parte seleccionada quede dentro del anillo.

Colocar dentro una solucin de 400 mM de KCl y un electrodo.

En 1 vaso de pp. colocar 50 ml de KCl 1 mM y colocar el cascaron en la abertura de 0.5 cm, donde este en contacto con el liquido y el otro electrn, medir potencial.

Introducir el tubo de vidrio en el anillo de goma, llenarlo con la solucin de LIC, sujetarlo a un soporte, introducir el musculo en un vaso de pp. Con una solucin de Riger.

Repetir lo anterior con concentraciones 5, 10, 20, 50 y 100 mM.

Medir el potencial de lesin del musculo, colocando un electrodo de Calomel en solucin LIC. Y el otro electrodo en solucin Ringer

Probar que sucede con la lectura del multimetro si se levanta el cascaron de la solucin.

Sustituir solucin por solucin KSO 0.025M y leer la diferencia de potencial.

Repetir el paso anterior con solucin de KSO en orden creciente de concentraciones.

POTENCIAL DE DIFUSIN CON LA CMARA DE USSING Y MEMBRANA ARTIFICIAL

Recortar la membrana de dilisis al dimetro de la cmara de Ussing, aplicar vaselina al compartimiento de la cmara, colocar en 1 la membrana, centrada, y unir los compartimientos.

Vaciar 1 compartimiento, enjuagarlo con solucin de Na2HPO4 0.1 M y llenarlo con esta. Medir la diferencia de potencial

Sujetar la cmara, llenar los 2 compartimientos con solucin de Na2HPO4 0.05 M, medir diferencia de potencial, con un electrodo de calomel en los compartimiento conectando los electrodos al multmetro

Repetir usando soluciones sucesivamente ms concentradas, enjuagar y reponer la solucin (0.05 M) del compartimiento de referencia.

Resultados Concentracin extacelular de KCl (mM). Concentracin intracelular de KCl (mM). Relacin C ext/C int Log de C ext/C int E Terico (mV) (Ecuacin de Nerst). -150.91 -127.83 -110.37 -92.91 -75.45 -52.37 -34.91 0 E Experimental (mV).

1 2.5 5 10 20 50 100 400

400 400 400 400 400 400 400 400

2.5x10-3 6.25x10-3 0.0125 0.025 0.050 0.125 0.250 1

- 2.602 -2.204 -1.903 -1.602 -1.301 -0.903 -0.602 0

-145.7 -142.7 -126.60 -118 -112.1 -95.3 -86.3 -62.6

Comparacin de E teorico y E experimental

20 0 -3 E (Mv) -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 -20 0 -40 -60 -80 -100 -120 -140 log C ext/ C int -160
Terico y= 58x + 0 r= 1 Practico y= 32.76x 65.62

r= 0.986

Teoricos Experimentales

Figura 2. Efecto de las concentraciones milimolares (mM) del cloruro de potasio (KCl) sobre la diferencia de potencial generada (potencial de difusin) en un huevo de gallina. En el eje X se tiene al logaritmo natural del cociente de las concentraciones intra y extracelualres del ion.(log C ext / C int ), en el eje Y la diferencia de potenciales en milivolts de color naranja datos tericos y en color rojo datos experimentales.

Concentracion de K+ de la solucion LIC (Mm).

Concentracion de la K+ de la solucion del recipiente (Mm).

Relacin C ext/C int

Log de ext/C int

E Terico (mV) (Goldman).

E Experimental (mV).

140 140 140 140 140 140

Ringer 5 10 25 50 100 0.035 0.071 0.178 0.357 0.714 -1.455 -1.148 -0.749 -0.447 -0.146
-88.27

-40 -31.5 -25 -12.7 -0.53 +3

-69.91

-45.63

-27.27 -8.91

Tabla 2. - Efecto de las concentraciones milimolares (mM) de sulfato de potasio (KSO) sobre la diferencia de potencial generada (potencial de lesin) en musculo gastrocnemio de rana.

COMPARACIN DEL E TEORICO Y EL E EXPERIMENTAL POTENCIAL DE LESION

Teorico 20 Ecuacion de Goldman y 0 = 60.66x - 0.130 0 R = 1 -20 E (mv) -40 -60 -80 Teorico Practico

-1.6

-1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

log Ce/Ci

PRACTICO y = 28.24x + 8.938 -100 R = 0.981

Figura 3. Efecto de las concentraciones milimolares (mM) del sulfato de potasio (K2SO4) sobre la diferencia de potencial generada (potencial de lesin) en musculo gastrocnemio de rana. (E) representa la diferencia de potencial de membrana en milivolts, (log Ce/Ci) al logaritmo natural del cociente de las concentraciones intra y extracelualres de los iones.

DISCUSIN El potencial de difusin en el huevo, debido a su composicin, su membrana es sumamente permeable al K+ de esta forma, como los iones de K+ estn presentes en gran concentracin dentro de la clula, stos tienden a difundirse de dentro hacia fuera de la membrana a favor de su gradiente de concentracin, y esto se observa tericamente como experimentalmente, la concentracin extracelular se vuelve menos negativa se debe al ligero exceso de K+ y la intracelular se vuelve mas negativa por la ligera deficiencia del K+. La difusin de los iones K+ fuera de la membrana del huevo origina una diferencia de potencial elctrico, positiva afuera y negativa dentro. Tanto mas K+ se difunda a favor de su gradiente de concentracin mayor ser la diferencia de potencial, a concentraciones milimolares pequeas de KCl extraceluar se genera mayor diferencia de potencial ya que se alcanzara mas rpido el equilibrio disminuyendo la diferencia de potencial. Sin embargo llegara un punto cuando la diferencia de potencial ser 0 la fuerza elctrica que arrastra al K+ al interior de la clula es igual a la fuerza qumica que arrastra los iones de K+ fuera de la clula y este potencial recibe el nombre de potencial de equilibrio y este equilibrio se calcula mediante la ecuacin de Nerst. En la figura 2 se observa el efecto de las concentraciones extracelular e intracelular sobre la diferencia de potencial, al comparar los resultados tericos con los prcticos se observa que difieren mayormente en el dato 5, y al observar la ecuacin de la recta difieren mucho, esto lo podemos a atribuir que al hacer el experimento no se contaba con la misma temperatura ya que nos encontrbamos aproximadamente a 21 C este factor afectara directamente a la pendiente de la recta, tambin otro factor influye a la pendiente es que la permeabilidad del huevo no es infinita. En la ordenada tambin se observa una gran diferencia los factores que pueden influir en esta son que el huevo a pesar de enjuagarlo muy bien quedan protenas cargadas en la membrana, estas cargas afectan directamente la diferencia de potencial, otro factor influyente es el potencial de electrodo. En el potencial de lesin al musculo gastrocnemio de rana, contiene iones K+, Na+ y Cl- en su interior por la solucin de LIC estos contribuirn al potencial de membrana pero en cuanto mayor es la concentracin de una clase de ion en particular y mayor la permeabilidad de la membrana a este ion tanto mayor es su importancia en la determinacin del potencial en este caso es al ion K+. Utilizamos soluciones extracelulares de K2SO4 y el ion SO42- es un anin prcticamente impermeable, solo se considera la concentracin del K+ extracelular, sin embargo, al utilizar la solucin de Ringer extracelular la cual contiene iones K+, Na+ y Cl-el potencial no puede considerarse solo al ion K+ y esto se obtiene por la ecuacin de Goldman. Sin embargo, al tener solo concentraciones del ion K+ extracelulares, y la membrana es mas permeable a este que a los otros iones podra decirse que bajo estas condiciones se espera obtener el potencial de membrana en reposo. En la grafica podemos observar que los valores experimentales y los valores tericos difieren esto se puede atribuir a la temperatura ya que no se trabajo a la temperatura absoluta, que el musculo gastrocnemio contiene clulas de tejido conectivo, vasos sanguneos y nervios, si al manipular el musculo lo rompemos puede quedar expuesto el LIC y el LEC combinndose ambos estos factores afectaran directamente el potencial de lesin y con esto la pendiente de nuestra grafica.

Conclusiones Determinamos el efecto del cambio de gradiente de concentracin del ion [K+] sobre el potencial de difusin de la membrana testcea de huevo de gallina. Comprobamos que la membrana testcea tiene una permeabilidad selectiva al ion K+. Observamos que entre mayor sea la concentracin extracelular del ion K+ de la membrana testcea, la diferencia de potencial se har menos negativa hasta que el ion K+ llegue a su potencial de equilibrio. Determinamos el efecto del cambio del gradiente de concentracin el ion [K+] sobre el potencial de lesin del musculo gastrocnemio de rana. Comprobamos que la membrana del musculo gastrocnemio de rana permeabilidad al los iones K+. La diferencia de potencial de la membrana interna y externa del musculo gastrocnemio de rana por su potencial de lesin predice el potencial de membrana para mltiples iones que atraviesan la membrana.

Bibliografa Alva S. C., vila V. G., Barrera S. J., Chuc M. E., Escalona C. G. N., Franco C. M., Garca. R. M., Guarneros B. E., Ortiz B. M. R. E., Pacheco R. J., Paniagua C. N., Ramrez S. J. E., Villanueva B. I., Zamudio H. S. R., 2001. Manual de laboratorio de fisiologa general (Q.F.I), 6 Ed. Edit. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. Instituto Politcnico Nacional, Mxico, D.F. Koeppen, B. M., Levy, M. N., Stanton, B. A., 2006. Berne Y Levy Fisiologa. 4 Ed. Edit. Elsevier, Espaa. Martin, C. E., 2006. Fundamentos de fisiologa. Edit. Paraninfo Rothstein, M. J., Roy, H. S., Wolf, S., 2005. Manual del especialista en rehabilitacin. Edit. Paidotribo Strand, L. F., 1982. Fisiologia humana: un enfoque hacia los mecanismos reguladores. Ed. Mdica Panamericana Fisiologa humana 4 edicion editoria medica panamericana Espaa 2009 Silverthorn Dee unglaub Tratado de nutricin composicin y calidad de los alimenos angel gil 2010 2 edicion editorial panamericana espaa