Curs 13 Cinetica dezvoltrii microorganismelor i a proceselor de biosintez

Cinetica reprezint studiul schimbrilor fizice i chimice aprute n timp, ntrun proces, n cazul nostru, procesul de cretere al microorganismelor. Schimbrile fizice pot avea loc din cauza schimbrilor de temperatur, presiune i concentraie. Prin fermentaie are loc procesul de cretere al microorganismelor, pe medii de cultur, cu scopul de a biosintetiza diverse substane chimice cu rol n structura i aroma produsului alimentar. Procesul de fermentaie alcoolic, de exemplu, ntlnit n pine, de exemplu, are 3 scopuri: de a produce bioxid de carbon necesar n crearea structurii pinii; de a produce aroma pinii i de a schimba structura proteinelor astfel nct pinea s fie masticabil. Prin inoculare de celule aparinnd unei culturi pure (drojdia n panificaie, bacterii lactice n industria laptelui, mucegaiuri i bacterii n bioreactoare n procesele de biosintez, etc.), ntr-un mediu nutritiv se poate stabili dinamica de cretere a numrului de celule raportat la unitatea de volum a mediului.

Celule de drojdii n aluatul de pine

Curba de cretere a microorganismelor cuprinde mai multe faze: - faza de inoculare; - faza creterii logaritmice a numrului de microorganisme; - faza de retardare; - faza de descretere a numrului de microorganisme. Dup Monod, curba de cretere cuprinde urmtoarele faze: faza de lag sau faza staionar, faza de cretere accelerat, faza de cretere logaritmic sau

exponenial, faza de retardare, faza staionar, faza morii accelerate i faza morii logaritmice. Faza de lag corespunde perioadei de timp n care microorganismele se aclimatizeaz la condiiile de mediu care li se ofer. Nu se constat o cretere a numrului de celule. Aceast perioad depinde de mai muli factori: compoziia mediului, tipul microorganismului, vrsta microorganismului i temperatur. n aceast faz are loc biosinteza de ADN/ARN i o activare a sistemelor enzimatice precum i elaborarea de enzime induse. n cazul drojdiilor, aceast faz poate dura 1-2 ore. Urmeaz faza de cretere accelerat n care au loc reacii metabolice cu vitez mare i constant. n aceast faz se produce o mrire a dimensiunii celulelor prin creterea mai rapid a volumului n raport cu suprafaa celular, ceea ce favorizeaz declanarea procesului de reproducere. n timpul fazei creterii logaritmice are loc cu intensitate, diviziunea celular care se face cu consum mare de substane nutritive din mediu. Creterea masei celulare poate fi determinat cantitativ prin dublarea numrului de celule pe unitatea de timp (pentru drojdii i bacterii) sau ca o dublare a biomasei pe unitatea de timp pentru fungi filamentoi, streptomicete. Prin exprimarea acestor valori pe o scar semilogaritmic rezult o dreapt. Dei celulele schimb compoziia mediului de cultura prin consumarea de nutrieni i eliberarea de metabolii, n faza de log rata de cretere rmne constant. Rata de cretere este dependent de concentraia n nutrieni. Rata de cretere n biomas, X (mg/l), crete ca o funcie a timpului datorit conversiei nutrienilor n biomas:

unde este rata de cretere specific (d-1). Aceasta reprezint masa de celule produs/ masa de celule pe unitatea de timp. Rata de cretere , conform ecuaiei stabilit de Jaques Monod, este dependent de trei parametri: concentraia substratului, S; m (mg/l), rata maxim de cretere; Ks este o constant specific de substrat.

Constanta Ks este concentraia substratului la care se obin din rata specific maxim de cretere ( = m/2) i este echivalent cu constanta Michaelis n cinetica enzimatic. Efectul concentraiei substratului asupra constantei ratei de cretere este curba de mai jos:

Cinetica Monod

Dac exist un exces al tuturor nutrienilor, atunci = m i cultura se afl n faza de log, la rata maxim de cretere. Rata specific de cretere maxim, m, are o importan considerabil n procesele industriale n care se urmrete obinerea de biomas celular i este dependent de natura microorganismului i de condiiile de cultivare. De exemplu, pentru mucegaiuri aceasta poate varia ntre 0,090-0,61 h-1. La cultivarea lui Aspergillus niger pe mediu cu glucoz la 30C s-a obinut m = 0,2 i un timp de dublare al biomasei de 3,46 h. Pe msur ce mediul srcete n substane nutritive, viteza de cretere ncepe s scad i are loc faza de retardare n care se acumuleaz metabolii celulari i n care viabilitatea microorganismelor scade. Urmeaz apoi o faz scurt de staionare a procesului de cretere, cnd se stabilete un echilibru ntre numrul de celule care se formeaz prin reproducere i a celulelor care se autolizeaz. Cantitatea de biomas poate s rmn constant dei se schimb compoziia celulelor. Datorit lizei unor celule se elibereaz noi substraturi care vor servi drept nutrieni pentru celulele viabile. Faza staionar poate fi atins la o concentraie de celule bacteriene de aproximativ 109 celule pe ml. Dimensiunea populaiei va depinde de dimensiunea celulelor, nutrienii disponibili i natura microorganismelor. n faza staionar celulele pot s rmn active din punct de vedere metabolic fr s aib condiii de nmulire. Intrarea n faza staionar a culturilor aerobe, este determinat de limitarea coninutului de oxigen, care este consumat rapid din mediu. Bacteriile anaerobe sunt limitate n cretere din cauza acumulrii de compui de catabolism, toxici pentru celulele care i-au produs. De exemplu, sreptococii lactici sunt inhibai la creterea concentraiei de acid lactic. Faza de declin sau curba de distrugere i inactivare metabolic a celulelor sau fazele morii accelerate sau a morii logaritmice a microorganismelor apare ca urmare a lipsei de surse de nutriie i energie, de denaturare a componenilor celulari n prezena substanelor acumulate (alcooli, acizi, bacteriocine, etc.) de autoliz, nct se poate produce n final sterilizarea mediului (moartea tuturor celulelor) i pierderea culturii. Aceast faz este de obicei logaritmic adic, o proporie constant de celule moare n fiecare unitate de timp (o ora).

Cinetica procesului de fermentaie n sistem nchis (discontinuu) i deschis (continuu) Durata fazelor curbei de cretere a microorganismelor depinde de temperatur, pH, aerarea (intensitatea agitrii i cantitatea de oxigen). Rata de cretere a culturilor este important pentru studiul proprietilor fiziologice a tulpinilor selecionate, pentru stabilirea condiiilor de reproducere cnd acestea sunt utilizate drept culturi starter sau pentru obinerea n condiii avantajoase a unor compui celulari. n timpul fazei logaritmice de cretere, fiecare celul se divide la un interval constant de timp. Timpul mediu de generaie (tg) este timpul necesar unei populaii microbiene de a se dubla (ca numr de celule sau mas celulara). Numrul de generaii la timpul t este: n = (log Nf- log No)/0,301, unde, Nf reprezint numrul de celule la timpul t, No reprezint numrul iniial de celule (al inoculului), Constanta ratei medii de cretere, k, este dat de numrul de generaii pe unitatea de timp (numr de generaii/ ora). De exemplu, pentru o populaie bacterian care a crescut de la 103 (N0) la 109 (Nf) ntr-un timp de 10 ore se obtin urmtoarele valori: K = (log 109 log 103)0,301 x 10h = 2 generaii pe ora tg = 1/k = 1/2generaii/h =0,5h/generaie, sau 30 minute /generaie

(Dan, V., 2001) Timpul de generaie variaz cu specia i cu condiiile de mediu. n tabelul de mai jos se dau valori ale tg pentru unele microorganisme cultivate n condiii optime.

Tabel. Timp de generaie pentru microorganisme Microorganisme Bacterii - Escherichia coli - Bacillus subtilis - Clostridium botulinum - Mycobacterium tuberculosis Fungi - Saccharomyces cerevisiae - Manilia fructicola Dup L.M. Prescott, 1990 Temperatur ( C) 40 40 37 37 Timp de generaie (h) 0,35 0,43 0,58 12

30 25

2 30

Randamentul de cretere exprim cantitatea de biomas rezultat prin consumul unui nutrient. Y = masa celular rezultat prin cretere/masa substratului consumat, g/g Randamentul y creste cu concentraia nutrientului, pan cnd, aceasta atinge o valoare, n care are loc o saturare a sistemelor de transport i rata de cretere rmne constant sau scade. n sistem nchis, fermentaiile se fac ntr-un mediu nutritiv aflat n volum limitat, care se consum repede, astfel c dup cteva generaii se instaleaz repede faza staionar de cretere. n scopul meninerii populaiei microbiene n faza exponenial de cretere se folosesc sisteme de fermentare deschise, care sunt alimentate continuu cu nutrieni i din care sunt ndeprtai produii de catabolism. Celula microbian, avnd masa redus, este puternic influenat de condiiile mediului ambiant i reacioneaz foarte rapid la diferii factori fizicochimici i biologici. Creterea microorganismelor este afectat i controlat prin anumii factori ecologici care pot fi divizai n grupul factorilor intrinseci uneori greu de controlat: pH i capacitatea tampon, potenialul de oxido-reducere, structura biologica i prezena unor constitueni antimicrobieni. Factorii extrinseci mai uor controlabili, includ temperatura i durata de pstrare, efectele unor procese asupra aw prin srare, afumare sau uscare, variaia de pH, tratarea cu radiaii, adugarea de CO2 (de exemplu ambalarea n atmosfer controlata), sau adaos de conservani.

Chemostatul este un rezervor de mediu steril care este adugat culturii la o rat constant. Nutrieni proaspei intr constant n cultur, iar produii de catabolism sunt continuu nlturai. Culturile continui se pot produce prin dou metode. Utiliznd chemostatul, cultura este alimentat cu mediu steril la aceeai rat la care mediul care conine microorganisme este nlturat. Un element cheie al chemostatului este ca rata de cretere i producia total pot fi controlate independent. Al doilea tip de cultur continu este un turbidostat. Aceast metod utilizeaz aceeai ipotez ca i la chemostat cu excepia unei fotocelule care monitorizeaz densitatea optic a culturii. Fluxul de mediu ce intr n cultur este ajustat automat meninnd o turbiditate predeteminat. Chemostatele sunt folositoare n studierea fiziologiei microorganismelor deoarece se poate modifica un nutrient i se pot observa modificrile aprute asupra microorganismului. Astfel este posibil s se studieze ct de eficient utilizeaz microorganismele nutrienii. Turbidostatele se utilizeaz cnd este dorit obinerea constant de celule identic metabolic. Factori care influeneaz creterea i dezvoltarea microorganismelor Temperatura Nivelul temperaturii stimuleaz sau inhib procesele enzimatice. Pentru creterea microorganismelor sunt importante 3 nivele de temperaturi: temperatura minim este temperatura la care creterea celulelor mai poate avea loc, sub aceasta creterea fiind oprit; temperatura optim la care rata specific de cretere este maxim; i temperatura maxim la care creterea celulelor nc mai poate fi posibil, dar peste aceasta, celulele mor.

Intervalul de temperatur pentru microorganismele cu implicaii n industria alimentar este situat ntre 0 i 75C . n funcie de intervalul de temperatur specific de cretere. microorganismele pot fi mprite n 4 categorii, dup cum se poate observa n tabelul de mai jos:
Tabelul 5.2 Categorii de microorganisme funcie de domeniul de temperatura Tipuri de microorganisme Psihrofile T min. C -10 T opt. C 10-15 T max. C 20 Exemplificri Bacterii de putrefacie: Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Alcaligenes - conin n membrana plasmatic o concentraie mare de acizi grai nesaturai (acid linoleic); - au tendina de a produce pigmeni i structuri extraparietale (capsule) Bacterii: Enterobacter, Hafnia, Yersinia, Pseudomonas, Campylobacter, Vibrio, Listeria; Drojdii: Candida, Rhodotorula - grupul majoritar ce cuprinde: bacterii, drojdii, mucegaiuri, inclusiv microorganismele patogene pentru om/animale Prezint faza log mai redus; Timpul de generaie la temperatur poate fi de 10 minute. g. Candida, mucor, Absidia, Aspergillus fumigatus, Penicillium duponti g. Lactobacillus g Bacillus, g. Clostridium, actinomicete

Psihrotrofe (facultativ psihrofile) Mezofile

20-30

35-40

15-20

30-40

45

Termofile

45

55-65

90

- preferenial - obligat

25-28 37

45-55 50-60

60-65 65-70

Fig. 5.3. Rata de cretere funcie de temperatur

Utilizare a temperaturilor n procesele microbiene industriale Temperaturi care depesc cu 10C temperatura maxim de cretere determin n celula microbian denaturri ireversibile care conduc la moartea fiziologic a celulelor ca rezultat al coagulrii proteinelor, al unor procese de oxido-reducere i al inactivrii enzimelor. La creterea temperaturii se produce desfacerea legaturilor N-glicozidice din ADN cu formare de uracil prin dezaminarea citozinei. Sterilizarea reprezint o complet eliminare a tuturor microorganismelor dintr-un spaiu dat prin folosirea unor temperaturi de 100C sau mai mari. Sterilizarea se utilizeaz pentru tratarea vaselor de fermentare, mediilor de cultur i a unor alimente. Un factor biologic important pentru eficiena sterilizrii este concentraia de celule din produsul supus sterilizrii, deoarece denaturarea termic este un proces de prim ordin i n fiecare fraciune de timp se distruge o fraciune din numrul total de celule din produs. Prima i nc cea mai utilizat metoda de tratament termic, este pasteurizarea, numit dup marele microbiolog Louis Pasteur. Dezvoltat la nceput pentru a preveni denaturarea vinului, este apoi tot mai utilizat pentru lapte. Pasteurizarea este operaia care are drept scop distrugerea majoritii microorganismelor si, n particular, a bacteriilor patogene nesporulate prin utilizarea de temperaturi mai joase dect n cazul sterilizrii. Un bun exemplu este tratarea laptelui la 72 C timp de 15 secunde sau la 66C timp de 30 minute.

Prin acest tratament sunt distrui bacilii tuberculozei, Escherichia coli i Salmonella enterica. Exist dou metode de utilizare a temperaturilor nalte: cldura uscat (incubare ntr-un cuptor) i cldura umed (utilizarea aburului sub presiune), ultima metod fiind mult mai eficient. Cldura umed este mai eficient, deoarece crete rata de penetrare a cldurii n interiorul mediului tratat. Pentru a avea aceeai eficien cu tratamentul care utilizeaz cldura umed, timpul de expunere trebuie prelungit n cazul utilizrii cldurii uscate.

Autoclavele sunt camere metalice cu evi de intrare i ieire a gazului. n timpul sterilizrii, autoclavul este umplut cu abur la presiune, rezultnd o temperatur de 121C.

Un alt factor care influeneaz eficacitatea tratamentului termic este compoziia mediului ce nconjur microorganismele. Concentraia mare de sare i aciditatea crete rata de distrugere a microorganismelor supuse temperaturilor nalte. Invers, pentru a ale proteja, se pot utiliza grsimi i proteine. Un alt tratament termic este tyndalizarea care const n pasteurizri repetate, alternate cu perioade n care proba este meninut n condiii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni care devin vulnerabili i trecnd n stare vegetativ, sunt distrui la o nou pasteurizare. Se poate folosi pentru sterilizarea mediilor ce conin substane termolabile. Dac se exprim matematic denaturarea termic a microorganismelor, dN/dt = -kN

ln N0/N= kdt 2,303 lg N0/N = kt t= 2,303 lg N0/N, unde, N0 = numr de microorganisme la nceputul sterilizrii; N = numr de celule care mai pot rmne n produs, fr ca acestea s influeneze calitatea produsului sterilizat (de la 1 la 100 celule/g) Raportul 2,303/k, n care k este o constant specific determinat practic, se noteaz cu D i este numit timp de reducere decimal, respectiv timpul care asigur la o temperatur dat distrugerea unui procent de 90% din totalul celulelor existente iniial. Pentru a avea un tratament termic eficient al alimentului sau mediului de cultur este necesar s se determine cantitativ, rata morii microorganismelor. Una dintre cele mai utilizate metode este determinarea timpului de reducere decimal (valoarea D). Aceasta este o msur a sensibilitii microbilor la cldur i definete timpul necesar ca populaia microbian s descreasc de 10 ori la temperatura dat. Valoarea D poate fi determinat prin incubarea unei culturi la temperatura letal i determinarea periodic a numrului de microbi viabili.

Determinarea valorii D a unei culturi prin incubarea la o temperatur specific i eliminarea unor probe din timp n timp. Se determin populaia viabil din fiecare prob. Datele sunt introduse

ntr-un grafic, cu populaia pe axa y versus timpul pe axa x. Valoarea D este inversul negativ al pantei. Tabelul 5.3. Valori D (in secunde) pentru suspensii de spori/temperatur Bacterii sporogene Bacillus cereus Bacillus subtilis Bacillus sthearothermophillus 105C 12,1 27,8 2857 120C 4,2 4,5 38,6 130C 2,6 3,1 8,8 140C 1,3 2,1 3,9 150C 1 1,1 2,4 160C 0,7 0,5 1,4

n stabilirea formelor de sterilizare, n funcie de raportul de sterilizare dorit i de valoarea stabilit pentru D, se poate calcula timpul de sterilizare la o temperatur dat. Determinarea valorii lui D, la un numr mare de temperaturi, pentru anumite probe, conduce la determinarea timpului morii termice (TDT) i valorii Z, care permite predicia n ceea ce privete valorile D la o temperatur letal. TDT este timpul necesar pentru ca o populaie de celule s ajung la 100 (zero efectiv), la o temperatur dat. Acesta poate fi determinat prin multiplicarea populaiei iniiale de log10, prin valoarea D. Odat ce valorile TDT sunt determinate la cel puin 3 temperaturi, valoarea Z poate fi determinat. Valoarea Z msoar sensibilitatea microorganismelor la o schimbare de temperatur i este definit ca o temperatur necesar de a descrete TDT de 10 ori. Pentru a determina valoarea Z pentru un microorganism, TDT este reprezentat grafic (n scara logaritmic) funcie de temperatur, i se duce o linie printre punctele determinate. Valoare Z este reciproca negativ a pantei acestei linii. Cu ajutorul lui Z este posibil s prezicem rata morii microbilor n mediu specific la orice temperatur letal. Valorile D, TDT i Z sunt foarte utilizate n industria alimentar, unde dorim tratamente potrivite de a reduce populaia microbian cu minimum de efecte negative asupra alimentului. Determinarea valorii Z a unei culturi se calculeaz experimental prin determinarea timpilor termici ai morii microorganismelor la cel puin 3 temperaturi i apoi trasarea unui grafic n scar logaritmic funcie de temperatur. Valoarea Z este inversul negativ al pantei i msoar sensibilitatea microorganismelor la schimbrile de temperatur. De exemplu, pentru a elimina riscul de supravieuire a lui Clostridium botulinum se stabilete raportul de sterilizare de la 1012 la 10 deci: 12 D = 12 x 0,204 = 2,5 min. la 121C (D121 = 0,204 minute, pentru Cl. botulinum ). Dac presupunem c nclzirea se face la 111C n loc de 121C i Z=10, n acest caz D121 = 0,204x10=2,04 iar 12D = 24,5 minute.

Tabel . Rezistena termic a microorganismelor Tipuri microorganisme de Valori t/T maxim, letal pentru 106 celule la pH 6,8 i aw 0,98. 30 minute la 65C 10 minute la 90C 10 minute la 115C; 4 minute la 120C 45 minute la 120C Genuri/Specii Penicillium; Aspergillus; Bissochlamys; Microbacterium; Alcaligenes; Enterococcus Clostridium botulinum tip E; Bacillus macerans; Bacillus megatherium; Bacillus cereus Bacillus sthearothermophillus Clostridium nigrificans; Clostridium sporogenes Clostridium thermosaccharolyticum; Xezones

Mucegaiuri i drojdii; Bacterii asporogene Endospori bacterieni cu rezisten mic Endospori bacterieni cu rezisten ridicat Endospori bacterieni cu rezisten de excepie

Tabel Utilizri ale controlului microorganismelor cu temperatura Tratament Incinerare Temperatur >500C Eficacitate Vaporizarea materialelor organice de pe suprafee neinflamabile cu distrugerea unor substane n acest proces. 30 minute de fierbere omoar formele vegetative ale bacteriilor dar nu omoar endosporii bacterieni. Sunt astfel toxine care nu sunt inactivate la 100C. Trei intervale de cate 30 minute de fierbere, urmate de perioade de rcire care omoar endosporii bacterieni. Omoar toate formele de viat inclusiv endosporii bacterieni. Bun pentru sticl, metale. Se observ c mrind temperatura cu 10C timpul de sterilizare este mai mic cu 50 %. Omoar formele vegetative ale celulelor bacteriene, inclusiv patogeni ca streptococi, staphylococi i Mycobacterium tuberculosis. Efectul asupra celulelor bacteriene este similar ca mai sus. Pentru lapte metoda are cteva efecte nedorite asupra calitii i gustului.

Fierbere

100C

Fierberea intermitent Autoclav (abur i presiune) Cldura uscat Cldura uscat Pasteurizare

100C 121C pentru 15 minute la presiune 160C , 2 ore 170C, 1 ora 63-66C, 30 minute

Pasteurizare

72C, 15 secunde

Temperaturile joase scad rata reaciilor chimice, inclusiv a celor catalizate de enzime i descresc fluiditatea membranei celulare.

Pentru mrirea conservabilitii produselor alimentare, se folosesc temperaturi sub valorile temperaturilor minime ale microorganismelor. Pstrarea celulelor sub aceste temperaturi, reduce viteza de desfurare a metabolizrii substanelor nutritive si, n consecin, scderea producerii de proteine/enzime prin biosintez. Aceasta ncetinire a metabolismului variaz n funcie de temperatur, natura microbiotei i cea a substratului nutritiv. La temperaturi sczute are loc o pliere a moleculelor de proteine cu formarea de noi legturi ntre lanurile peptidice, care conduc la mascarea centrului activ al enzimelor, nemaiputndu-se desfura reaciile de anabolism /catabolism, celulele trecnd ntr-o stare latent de via, starea de psihroanabioz. Dac temperaturile scad sub temperatura de ngheare a apei, celula trece n starea de crioanabioz i n acest caz pot avea loc modificri ireversibile de natur fizico-chimic care conduc la distrugerea celulelor. Temperaturile de refrigerare, n jur de 4C previn creterea multor bacterii, n special a celor de alterare, mrind temperatura de valabilitate a multor produse. Congelnd o prob la -20C creterea microbian este stopat. Temperaturile joase, chiar congelarea, nu distrug majoritatea microorganismelor i, cnd sunt aduse la temperatura potrivit, microorganismele ncep s creasc din nou. De fapt microorganismele sunt bine conservate n azot lichid (-196C), aceast metod fiind utilizat n conservarea uselor bacteriene n laboratoarele de cercetare.