Guia de TP 2013 PDF

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

QUMICA
BIOLGICA
GUA DE TRABAJOS
PRACTICOS
2013
SECRETARIA DE PUBLICACIONES

CENTRO DE ESTUDIANTES DE VETERINARIA

Curso de Qumica Biolgica
Gua de Trabajos Prcticos

Prof. Asociado a cargo Dr. Pablo Cetica
Prof. Titular Consulta Dra. Martha Beconi

2013

1
Curso de Qumica Biolgica

Gua de Trabajos Prcticos

Edicin 2013

Redaccin: Prof. Titular Consulta Dra. Martha Beconi
Prof. Asociada Regular Bioq. Norma Beorlegui
J efe de T.P. Lic. Laura Pintos

Actualizacin: Prof. Asociado Regular a cargo Dr. Pablo Cetica
Colaboracin del Dr. Gabriel Alvarez, Vet. Silvina Fernndez,
Med. Vet. Noem Mora y Vet. Eva Romero

Rediseo: Prof. Asociado Regular a cargo Dr. Pablo Cetica
J efe de T.P. Dr. Gabriel Dalvit

Docentes 2013

Profesores: Asociado Regular a cargo Dr. Pablo Cetica
Titular Consulta Dra. Martha Beconi

J efes de Trabajos Prcticos: Dra. Mara Vernica Achi
Dra. Elizabeth Breininger
Dra. Mariana Crdoba
Dr. Gabriel Dalvit
Med. Vet. Noem Mora
Mg. Mercedes Satorre

Ayudantes de Primera: Dr. Gabriel Alvarez
Vet. Silvina Fernndez
Vet. Cynthia Gutnisky
Dra. Ana Marqunez
Vet. Sergio Morado
Vet. Mara Sol Prez Aguirreburualde
Dr. Pablo Rodrguez
Vet. Eva Romero
Vet. Matas Tellado

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Indice

MATERIAL DE LABORATORIO Y BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO
BIOQUIMICO.....................................................................................................................pg. 4
1. Material de laboratorio no volumtrico.
2. Material de laboratorio volumtrico.
3. Bioseguridad en el laboratorio de bioqumica.
PROTEINAS.......................................................................................................................pg. 14
4. Comportamiento de protenas en solucin.
5. Mtodos ms usados para el fraccionamiento y/o purificacin de protenas.
6. Protenas plasmticas.
7. Fotometra.
8. Determinacin de protenas plasmticas.
9. Trabajo prctico experimental.
10. Fraccionamiento de protenas plasmticas: Electroforesis.

BIOENERGETICA...........................................................................................................pg. 46
1. Definicin.
2. Principios de la Termodinmica.
3. Variacin de energa libre.
4. Carga energtica de la clula.

ENZIMAS...........................................................................................................................pg. 53
1. Aislamiento y purificacin de enzimas.
2. Determinacin de la actividad de la lipasa pancretica.

FERMENTACION LACTICA.......................................................................................pg. 63
1. Procesos aerbicos y anaerbicos.

REGULACION HORMONAL DEL METABOLISMO DE LOS HIDRATOS
DE CARBONO..................................................................................................................pg. 71
1. Mecanismos de regulacin de glucosa en sangre.
2. Mtodo de dosaje de glucosa sangunea.

3
LIPIDOGRAMA................................................................................................................pg. 80
1. Lipoprotenas plasmticas.
2. Aplicaciones clnicas.

METABOLISMO DE AMINOACIDOS....................................................................pg. 90
1. Enzimas sricas.
2. Transaminasas.
3. Mtodos de determinacin de actividad de las transaminasas.
4. Interpretaciones clnicas.

CUESTIONARIOS.........................................................................................................pg. 103
a) Material de laboratorio y bioseguridad en el laboratorio bioqumico.
b) Protenas I.
c) Protenas II.
d) Bioenergtica.
e) Enzimas.
f) Digestin y metabolismo de hidratos de carbono I.
g) Metabolismo de hidratos de carbono II.
h) Metabolismo de hidratos de carbono III.
i) Respiracin celular I.
j) Respiracin celular II.
k) Aspectos genticos del metabolismo.
l) Hormonas.
m) Regulacin hormonal del metabolismo de los hidratos de carbono.
n) Digestin y metabolismo de lpidos I.
o) Metabolismo de lpidos II.
p) Digestin de protenas y Metabolismo de aminocidos.
q) Digestin y metabolismo en poligstricos.
r) Fotosntesis.

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MATERI AL DE LABORATORI O
Y BI OSEGURI DAD EN EL
LABORATORI O BI OQUI MI CO

TEMARI O

1. Material de laboratorio no volumtrico. Material volumtrico sin graduaciones. Material
no volumtrico con graduaciones aproximadas.

2. Material de laboratorio volumtrico. Matraces. Probetas. Pipetas. Buretas.

3. Bioseguridad en el laboratorio bioqumico. Normas bsicas de bioseguridad en el
laboratorio de bioqumica. Sustancias qumicas peligrosas.

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Para la realizacin de los Trabajos Prcticos es necesaria la correcta utilizacin del
material de laboratorio. Uno de los factores que influyen en la aparicin de errores en el
laboratorio es la inadecuada utilizacin del material destinado a la medicin de volmenes,
generando resultados confusos, principalmente al realizar determinaciones que sirvan como base
para la toma de decisiones teraputicas. El material de laboratorio se puede clasificar en no
volumtrico y volumtrico.

1. MATERI AL DE LABORATORI O NO VOLUMETRI CO

1.1. Material no volumtrico sin graduaciones

Corresponde al material que no posee ningn tipo de escala graduada, como el caso de los
tubos de ensayo. Una caracterstica a tener en cuenta es que el dimetro y longitud de los
mismos es variable entre distintos fabricantes, lo que puede generar confusiones al controlar
visualmente el llenado de los mismos. Los tubos de ensayo se colocan en gradillas diseadas para
ese fin que pueden ser de metal, de plstico o de madera. Las de madera no deben sumergirse
dentro de baos de incubacin, ya que el agua puede arruinar la madera.

1.2. Material no volumtrico con graduaciones aproximadas

La graduacin que presenta este tipo de material no es exacta. Generalmente se indica,
junto al volumen mximo de graduacin, el error aproximado que se puede realizar al medir con
este material, a una temperatura de 20C.
En el laboratorio, comnmente se utilizan: vasos de precipitados, balones y
erlenmeyers.
Este material no se usa para la medicin de volmenes exactos. Por ejemplo, al llenar un
vaso de precipitados hasta la lnea que indica 100 ml no tenemos exactamente 100 ml, sino que
existen aproximadamente 100ml. Esto significa que, aunque hayamos enrasado perfectamente en
la lnea que indica los 100 ml, en realidad puede haber 93, 114 100,4 ml. Esto no se debe a
errores en la manipulacin por parte del operador, sino que es una caracterstica del material
utilizado.
Los erlenmeyers se utilizan para preparar soluciones y facilitar la mezcla acelerando el
proceso de disolucin. Tambin se usan en las titulaciones para facilitar la agitacin.

2. MATERI AL DE LABORATORI O VOLUMETRI CO

Corresponde al material especficamente fabricado para la medicin de volmenes. Por
ejemplo: matraces, probetas, pipetas (manuales y automticas) y buretas.

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Cmo realizar la lectura del nivel en el material graduado (Enrase)
En los tubos delgados de vidrio, debido a la tensin superficial de los
fluidos contenidos en ellos, se forma un menisco cncavo (M en el
grfico) en la superficie del lquido a medir.
La lectura se debe realizar en la lnea de graduacin (G en el grfico)
correspondiente a la parte ms baja del menisco.
Para evitar errores en la lectura, el material deber encontrarse en
posicin vertical, y el menisco deber mantenerse a la altura de los ojos
del operador.

2.1. Matraces

Se trata de material volumtrico con una nica medida. Estn graduados para medir un
volumen determinado cuando son llenados hasta la lnea de graduacin correspondiente, por lo
tanto, no se pueden utilizar, para medir volmenes inferiores o superiores al volumen indicado.
Existen matraces de diversas capacidades, desde 5 hasta 2000 ml (5, 10, 25, 50, 100, 250, 500,
1000 y 2000 ml).
Se utilizan principalmente para la preparacin de soluciones y reactivos y no para
determinar el volumen desconocido de un lquido.

2.2. Probetas

Son cilindros graduados de boca ancha y permiten la medicin de volmenes de 10 a 2000
ml (10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 ml). Siempre se debe utilizar una probeta con capacidad
superior ms cercana al volumen a medir. Por ejemplo: Para medir 45 ml, se deber utilizar una
probeta de 50ml. Para medir 180 ml, se deber utilizar una probeta de 250ml.

2.3. Pipetas manuales (De simple y doble aforo)

Las pipetas ms comunes pueden ser de: 0,1, 0,2, 1, 2, 5 y 10 ml. Para la correcta
utilizacin de las pipetas manuales se debe tener en cuenta:

2.3.1. Conocer que pipeta utilizar
Como en el caso de las probetas, siempre debe utilizarse la pipeta de un volumen superior
prximo al volumen a medir. Po ejemplo, para medir 0,7 ml, se deber utilizar una pipeta de 1
ml. Para medir 2,6 ml, se deber utilizar una pipeta de 5 ml.

2.3.2. I dentificar la pipeta a utilizar

a) I dentificar el volumen mximo y la precisin: Todas las pipetas tienen en su extremo
superior la indicacin de sus caractersticas, por lo tanto se puede observar:
- El volumen mximo que puede ser medido (Por ejemplo, 5 ml)
- El volumen que hay entre dos lneas de graduacin (Por ejemplo, la marca "1/100"
indica que cada lnea de graduacin contiene 1/100 de ml).

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b) I dentificar el tipo de pipeta, de simple o de doble aforo: Las pipetas de simple aforo
se cargan hasta un volumen superior a cero, luego se enrasa y se descarga exactamente hasta el
volumen requerido, o completamente si se necesita el volumen total.
Las pipetas de doble aforo tienen la particularidad de tener el rea graduada separada del
extremo de la pipeta, lo que implica que el volumen mximo a medir queda incluido entre dos
lneas claramente definidas, que indican el inicio y el final de la escala. Por lo tanto, debern ser
descargadas hasta la marca inferior y no hasta el final de la pipeta.
Si es necesario hacer la descarga completa de la pipeta, las mediciones realizadas con una
pipeta de doble aforo son ms exactas que las realizadas con las de simple aforo (excepto al
medir agua destilada). La razn de esto es que en las pipetas de simple aforo las graduaciones
inferiores corresponden a la seccin cnica de la pipeta y el volumen remanente que queda por
capilaridad puede variar de una sustancia a otra.

c) Cargar la pipeta: Para realizar la carga de la pipeta es recomendable el uso de una
propipeta o una pera de goma, ya que el operador se expone menos al riesgo de tragar la sustancia
a pipetear y permite controlar el ascenso de la columna del lquido hasta la graduacin deseada.

Manipulacin de la pipeta
La pipeta debe ser tomada entre los dedos medio y pulgar,
utilizando al dedo ndice como tope en el extremo superior de la
misma.
Esta forma de tomar la pipeta puede ser dificultosa al principio,
pero tiene las siguientes ventajas respecto a tomarla con la mano,
tapando con el pulgar:
- Al tomar la pipeta en la forma correcta, el centro de rotacin de
la misma se encuentra en una posicin ms conveniente, por lo
tanto la manipulacin, ya sea para cargarla o descargarla, es mucho
ms precisa.
- La movilidad fina en el dedo ndice es mejor, permitiendo que la
descarga de la pipeta pueda ocurrir en forma gradual, lo que no
ocurre al ocluirla con el dedo pulgar.

Manipulacin de propipetas
Las propipetas de goma se manipulan de la siguiente forma:
- Para expeler el aire presionar la vlvula A sobre la parte
superior del bulbo.
- Succionar el lquido hacia arriba presionando la vlvula S
ubicada en la parte inferior.
- Para descargar presionar la vlvula E que se encuentra al
costado de la vlvula S.

Las propipetas de mbolo se manejan con una sola mano. Girando
la rueda dentada hacia arriba o abajo se obtiene un llenado o
vaciado preciso y pulsando la clavija lateral se produce el vaciado
automtico.

8
d) Descargar la pipeta: Para efectuar la descarga de la pipeta deber apoyarse el extremo
inferior de la misma a la pared del recipiente en donde se descargue el contenido, liberando
lentamente el dedo ndice y permitiendo la descarga del volumen deseado. En el caso de
descargar completamente el contenido de una pipeta de simple aforo, se considera al volumen
remanente en el extremo de la misma, incluido en el volumen medido, por lo tanto este volumen
remanente no debe ser descargado. Esto implica que nunca se debe soplar el contenido remanente
de la pipeta.

2.4. Buretas

Las buretas se utilizan para realizar titulaciones. Constan de un cilindro graduado (con
doble aforo) y un robinete, que permite ocluir el paso del lquido en forma total o parcial. El
robinete deber ser manipulado con los dedos ndice y pulgar de la mano izquierda,
mantenindose el cuerpo de la bureta en el espacio dejado por estos dedos. Esto permite que
cualquier exceso de fuerza no desplace al robinete de su ubicacin, evitando las prdidas por los
laterales del mismo.
Al realizar una titulacin, el punto de inters es el recipiente en donde se est realizando la
misma, detenindose el proceso en el momento en el que el indicador utilizado realice el cambio
esperado en su coloracin, por lo tanto las buretas permiten independizarse de la lectura del
volumen utilizado, que se realiza despus de finalizar la titulacin.
Los pasos a seguir para la correcta utilizacin de las buretas son los siguientes:

2.4.1. Montaje de la bureta en su soporte

Para tal fin deber armarse el soporte, utilizando una doble nuez que se fija al mismo y
mantiene a la bureta en posicin vertical. Para fijar la bureta, deber ajustarse lentamente la
tuerca mariposa de la doble nuez, hasta que la bureta no tenga ms movilidad. El ajuste deber
ser lo suficientemente firme como para mantener a la bureta en posicin vertical, evitando el
exceso de presin, lo que podra provocar la rotura de la bureta. La altura de la doble nuez no
deber interferir con la lectura de las graduaciones de la bureta.

2.4.2. Cargado de la bureta

a) Llenado: Una vez fijada la bureta con el robinete cerrado, se coloca un embudo en la
parte superior para efectuar la carga, prestando especial cuidado en evitar la formacin de
burbujas en el interior de la misma. En este paso, no es necesario el enrase a cero. El aire
contenido en la porcin inferior al robinete debe ser desalojado para poder utilizar las buretas con
exactitud. Para esto, se deber colocar un recipiente debajo de la bureta, y abrir el robinete, hasta
que la burbuja sea desalojada completamente. En caso que la burbuja persista, se puede descargar
completamente la bureta e iniciar nuevamente la carga con el robinete abierto, habiendo colocado
previamente un recipiente debajo de la misma.

b) Enrase: Una vez cumplidos los pasos anteriores, se proceder al llenado final y enrase
de la bureta, manteniendo las mismas precauciones citadas anteriormente.

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c) Descarga de la bureta: La descarga del contenido de la bureta deber ser realizada en
forma de goteo lento (no abrir el robinete completamente), reduciendo gradualmente el flujo de la
solucin a medida que se aproxima el punto de viraje del indicador utilizado. Cuando se logra el
punto final de la titulacin se debe cerrar el robinete.

d) Lectura del volumen utilizado: La lectura del volumen utilizado deber realizarse al
final de la utilizacin de la bureta, tomando las precauciones descriptas anteriormente para el
enrase y lectura.

e) Recarga: Una vez finalizada la lectura, es recomendable la recarga y el enrase de la
bureta, si es necesario realizar otra titulacin.

Limpieza del material de laboratorio
Todo el material utilizado debe ser enjuagado inmediatamente despus de su uso, para evitar que se tapen y
eliminar sustancias extraas que puedan interferir en futuras determinaciones. Como las buretas son utilizadas
para realizar titulaciones con soluciones de cidos o bases, el secado de dichas soluciones, forma cristales, los
cuales pueden provocar la obstruccin del pico o el bloqueo del robinete, con lo cual quedaran
completamente inutilizadas. Si se trabaja con una pipeta que se utiliz para medir una solucin de protenas
y fue mal lavada, se estar obteniendo e informando un valor de protenas superior al valor real del paciente.
Al finalizar el trabajo prctico se deber lavar el material con detergente y abundante agua corriente,
particularmente si se utiliz material biolgico con materia grasa como leche o yogur. Para ello se puede
utilizar escobillas, que resultan particularmente tiles para lavar el fondo de tubos de ensayo, probetas y
erlenmeyers. Finalmente deben enjuagarse todos los materiales lavados utilizando preferentemente agua
destilada.
Posteriormente se dejar secar al aire, antes de ser colocado en su lugar correspondiente, si no se dispone de
estufa para secar el material. Queda exceptuado del secado en estufa el material de vidrio volumtrico, ya que
el vidrio puede sufrir modificaciones en su forma por efecto del calor y del enfriamiento, afectando la escala
de graduacin.

3. BI OSEGURI DAD EN EL LABORATORI O BI OQUI MI CO

3.1. Normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio de bioqumica

Las prcticas que se llevan a cabo en el laboratorio presentan riesgos propios de cada
actividad. Las reglas bsicas que se detallan a continuacin, son un conjunto de normas
destinadas a prevenir accidentes y proteger la salud de alumnos y docentes. El conocimiento de
esta informacin resulta esencial para evitar o minimizar inconvenientes dentro del laboratorio.

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Se deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad como matafuegos, salidas de
emergencia, duchas y lavaojos.

Se debe utilizar la vestimenta apropiada para el trabajo en el laboratorio. El guardapolvo
constituye una barrera de proteccin, por lo que debe usarse completamente abrochado, sin
arremangar y sin ninguna vestimenta por encima. Las piernas deben estar totalmente cubiertas
y el calzado debe ser cerrado. El cabello largo debe estar siempre recogido.

Las mesadas de trabajo deben estar siempre despejadas, libres de libros, abrigos, materiales
de estudio y objetos personales como celulares.

Las manos deben lavarse cuidadosamente luego de manipular cualquier sustancia qumica o
material biolgico y antes de retirarse del laboratorio.

Se debe dar aviso inmediato al personal docente si detecta fallas en las instalaciones elctricas
o de gas, as como al detectar materiales de laboratorio rotos o daados.

Toda herida o abrasin, por ms pequea que sea, as como el ingerir accidentalmente alguna
sustancia, se deber informar inmediatamente a los docentes. El laboratorio debe contar con
un botiqun de primeros auxilios correctamente identificado y de fcil acceso.

Todo residuo que se genere deber ser depositado en el recipiente destinado para tal fin. Estos
deben estar correctamente rotulados con el tipo de desechos que pueden contener, como
sustancias txicas, material biolgico, papeles, etc. El material de vidrio roto deber
envolverse en papel antes de ser depositado en el cesto de basura.

Utilizar preferentemente dispositivos mecnicos como propipetas o peritas de goma para
pipetear.

Mantener el orden y la limpieza dentro del mbito del laboratorio. Las mesadas debern
quedar perfectamente limpias y libres de cualquier residuo o elemento al finalizar la
actividad.

SI

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No se debe comer, beber o fumar dentro del laboratorio.

No llevar las manos a la boca u ojos cuando se haya manipulado sustancias qumicas y
biolgicas.

No inhalar o probar productos qumicos o biolgicos.

Se debe evitar el uso de accesorios, como pulseras, collares, relojes, anillos, etc.

No retirarse del laboratorio sin haberse quitado el guardapolvo para dirigirse a otras reas
(comedor, sanitarios, aulas, oficinas) o viajar.

No se deben bloquear los pasillos y caminos de escape ante una emergencia con bancos,
sillas, mochilas o cualquier elemento que entorpezca la correcta circulacin. No se permite
correr dentro del laboratorio, el andar dentro del mismo debe ser cuidadoso para evitar
romper los materiales y causar derrames de sustancias.

No utilizar equipos sin haber recibido entrenamiento previo o supervisin del personal
docente.

No se deben guardar alimentos en heladeras o freezers donde se almacenen sustancias
qumicas o material biolgico.

No utilizar el contenido de un recipiente que no est identificado. Todo material a utilizar
debe estar adecuadamente rotulado.

Est prohibido descartar sustancias txicas, inflamables y corrosivas, as como material
biolgico, por las piletas.

3.2. Sustancias qumicas peligrosas

Las sustancias qumicas se clasifican en funcin de su peligrosidad y se reconocen por un
smbolo especfico.

NO

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Sustancias y preparados que pueden explotar al acercarles una llama
o por choques o movimientos violentos. Debe evitarse el calor,
fuego, chispas, percusin o friccin.
Mezclas como sodio y agua, hidrgeno y aire (en contacto con una
llama).

Sustancias que por la accin de una fuerte ignicin, pueden
arder y continuar quemando. Deben mantenerse lejos de llamas,
chispas y fuentes de calor.
Acetona, alcoholes, benceno, magnesio en polvo, hexano,
fenolftalena, ter etlico.
Lquidos con puntos de inflamacin y ebullicin bajos, y gases
que a presin y temperatura ambiente son muy inflamables en el
aire. Deben mantenerse lejos de llamas, chispas y fuentes de
calor.

En contacto con otros productos, especialmente con los
inflamables, reaccionan desprendiendo calor. Pueden provocar
incendios.
Nitrato de amonio, de plomo, de potasio, de aluminio y de cinc,
clorato de sodio y de potasio, cido perclrico, dicromato de
potasio, cido ntrico, agua oxigenada.

Por inhalacin, ingestin o penetracin por la piel pueden producir
envenenamientos graves o incluso la muerte. Benceno, mercurio,
metanol, cianuros, arsnico, dicromato de potasio, tetracloruro de
carbono, xidos de nitrgeno, halgenos, fenol, sulfato de cromo,
anilinas.
La absorcin de estas sustancias en cantidades muy pequeas puede
tener efectos muy graves para la salud, pudiendo llegar a
consecuencias mortales.

Por inhalacin, ingestin o penetracin por la piel pueden producir
daos de gravedad limitada.
cido brico, permanganato de potasio, yodo, algunas sales y xido
de plomo, naftaleno, algunas sales y xidos de cobre.
Por contacto prolongado con piel y mucosas, pueden originar
inflamaciones.
Hidrxido de amonio, sulfato de sodio, cromato de potasio, gases de
muchos cidos (clorhdrico, ntrico, sulfrico, etc.).

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Sustancias y preparados que tienen una accin corrosiva sobre la piel.
Muchos cidos (ntrico, clorhdrico, sulfrico, etc.), nitrato de plata,
bases fuertes (hidrxido de sodio, de potasio, amonaco).

El contacto de esta sustancia con el medioambiente puede causar
daos en el ecosistema.
Benceno, cianuro de potasio, entre otros.

Riesgo de emisin radiactiva.
Ciertos istopos de algunos elementos (yodo, polonio, etc.).

Riesgo de peligro biolgico.
Virus, bacterias, priones, parsitos.

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PROTEI NAS

TEMARI O

Estructura y funciones biolgicas de las protenas. Desnaturalizacin. Propiedades cido-base
de aminocidos y protenas. Significado del punto isoelctrico y pK. (Estos temas debern
repasarse del Curso de Qumica Orgnica de Biomolculas).

1. Comportamiento de protenas en solucin. pH. Fuerza inica. Propiedades dielctricas del
solvente. Temperatura.

2. Mtodos ms usados para el fraccionamiento y/o purificacin de protenas.
Centrifugacin. Cromatografa lquida. Electroforesis. Fraccionamiento Salino. Dilisis.

3. Protenas plasmticas. Composicin de la sangre. Fracciones proteicas del plasma.

4. Fotometra. Introduccin. Teora de la espectrofotometra. Instrumental: Fotocolormetro y
Espectrofotmetro. Curva de calibracin. Utilizacin del blanco. Clculo del factor.

5. Determinacin de protenas plasmticas. La reaccin del Biuret: Fundamento. Otros
mtodos para valorar protenas.

6. Trabajo prctico experimental. Dosaje de protenas plasmticas.

7. Fraccionamiento de protenas plasmticas: Electroforesis. Introduccin. Teora de la
Electroforesis. Electroendsmosis. Variacione fisiolgicas. Aplicaciones clnicas.

8. Trabajo prctico experimental. Proteinograma electrofortico.

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1. COMPORTAMI ENTO DE PROTEI NAS EN SOLUCI ON

La solubilidad de las protenas depende del pH, de la fuerza inica de la solucin, de las
propiedades dielctricas del solvente y de la temperatura. Estas variables pueden usarse para
separar mezclas de protenas.

1.1. pH

Las protenas muestran un mnimo de solubilidad a un determinado pH, que es especfico para
cada una de ellas y se denomina punto isoelctrico (PI), que se define como el pH en el cual, la
molcula proteica no posee carga elctrica neta. En estas condiciones no hay repulsin
electrosttica entre molculas vecinas y tienden a agregarse y a precipitar. A mayores o menores
valores de pH, las protenas tienen carga elctrica neta del mismo signo, incrementando la capa
de solvatacin e impidiendo que se formen agregados insolubles. El PI vara con la composicin
inica del medio. Cuando las protenas estn disueltas en agua pura (deionizada) el PI se conoce
como pH isoinico. El pH isoelctrico de una protena, esta determinado por el nmero y los pK
de cada grupo R que se ioniza.

1.2. Fuerza inica

La fuerza inica de una solucin es una medida de su concentracin salina y se puede calcular a
travs de la siguiente frmula:

=
2
2
1
Zi Ci

, donde Ci es la concentracin de cada in
presente en la solucin y Zi es la carga correspondiente a cada uno de estos iones. Las sales
neutras en solucin se disocian, formando iones solvatados que modifican la solubilidad de las
protenas. A baja concentracin salina, la solubilidad de la protena aumenta: "salting in",
debido a que las cargas de las protenas interaccionan con los iones de las sales, incrementando la
capa de solvatacin de las mismas y disminuyendo la interaccin protena-protena.
Por otra parte, a altas concentraciones de sales neutras, la solubilidad de las protenas disminuye
("salting out") porque los iones de la sal disuelta atraen el agua de solvatacin disponible,
aumentando la interaccin entre las molculas de protena. Las protenas precipitadas por
"salting out", retienen su conformacin nativa y pueden disolverse nuevamente con el agregado
de solvente sin experimentar desnaturalizacin.

1.3. Propiedades dielctricas del solvente

La solubilidad de una protena a una fuerza inica y pH determinados, es funcin de la
constante dielctrica del medio. A medida que disminuye la constante dielctrica del solvente
disminuye la solubilidad de las protenas, porque a menor constante dielctrica aumenta la fuerza
de atraccin entre las cargas opuestas, luego las protenas tienden a agregarse y precipitar. El
agua tiene la mxima constante dielctrica, mientras que los solventes orgnicos tienen valores
ms bajos de constantes dielctricas.

16
1.4. Temperatura

Dentro de un rango limitado entre 0 y 40C, la mayor parte de las protenas aumenta su
solubilidad al aumentar la temperatura. A temperaturas mayores de 40C, aumenta la agitacin
trmica y se rompen las uniones que mantenan las estructuras secundaria, terciaria, cuaternaria y
la protena se desestabiliza y precipita (desnaturalizacin).

2. METODOS MAS USADOS PARA FRACCI ONAMI ENTO Y/O
PURI FI CACI ON DE PROTEI NAS

En el fraccionamiento y/o purificacin de protenas se utilizan mtodos que se describen a
continuacin:

2.1. Centrifugacin

La fuerza centrfuga permite separar partculas en suspensin que posean diferente masa o
diferente densidad, depositndolas en el fondo del tubo a diferentes velocidades. A menor
velocidad se depositan las partculas ms pesadas o de mayor densidad. Los tipos ms usados
son:

2.1.1. Centrifugacin diferencial (se ver ms adelante)

2.1.2. Centrifugacin en gradiente de densidad
Se prepara una solucin de sacarosa de densidad creciente en un tubo de centrfuga, luego
se deposita la mezcla de protenas y se centrifuga en posicin horizontal a alta velocidad. Se
obtienen as diferentes bandas segn su tamao y densidad.

2.2. Cromatografa lquida

Es otra tcnica utilizada comnmente para separar mezclas de protenas, que se basa en la
interaccin entre las molculas disueltas y una superficie slida que se halla contenida en una
columna. Este tipo de cromatografa puede ser:

2.2.1. Cromatografa de exclusin o de filtracin por gel
Las protenas se separan de acuerdo a su tamao. En este caso la columna contiene polmeros con
poros de diferente tamao, de acuerdo a las protenas que se desean separar. La mezcla con las
protenas disueltas fluye sobre la columna, las molculas de pequeo tamao penetran en los
poros del polmero y su movimiento a travs de la columna se retarda. En cambio las protenas
de mayor tamao no pueden penetrar en los poros del gel y fluyen ms rpidamente.

2.2.2. Cromatografa de intercambio inico
Las protenas son separadas por diferencia de carga. Grupos funcionales cargados positivamente
(-NH
3
+
) o negativamente (-COO
-
)

se unen covalentemente a un soporte slido formando un

17
intercambiador aninico o catinico. Cuando una molcula proteica cargada se hace pasar por un
intercambiador de carga opuesta, sta es retenida por fuerzas electrostticas, mientras que las
molculas neutras o de igual carga, pasan a travs de la columna. La unin de la molcula
retenida es reversible y puede ser eluida por el agregado de soluciones de diferentes
concentraciones salinas o por una solucin con un gradiente de pH.

2.2.3. Cromatografa de afinidad
Se basa en la afinidad con que una protena se une especficamente a otra molcula
(ligando). Ej: enzimas unen coenzimas e inhibidores, anticuerpos unen a protenas antignicas,
etc. Un ligando est covalentemente unido al soporte y est dentro de una columna
cromatogrfica. Cuando se coloca una mezcla de componentes, los compuestos que no tienen
afinidad por el ligando, fluyen a travs de la columna, quedando retenida la protena que tiene
afinidad por dicho ligando. La elucin se hace con soluciones que contienen exceso de ligando.

2.3. Electroforesis

Es una tcnica para separar protenas bajo la influencia de un campo elctrico. La
movilidad de cada uno de las molculas cargadas en un campo elctrico depende de su carga y de
su tamao molecular. Si dos molculas tienen la misma masa y forma, la que tiene una carga
elctrica neta mayor, se mover ms rpidamente hacia el electrodo de signo opuesto.
Las ms comnmente usadas son:

2.3.1. Electroforesis en tiras de acetato de celulosa (se utilizar en el trabajo prctico
experimental)

2.3.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-poliacrilamida)
En este caso la mezcla de protenas es tratada con SDS (dodecil sulfato de sodio) que es
un detergente cargado negativamente, que se une a las protenas. Colocando la mezcla sobre el
gel de poliacrilamida y aplicando una corriente elctrica, los complejos SDS-protenas migran a
travs de los poros del gel de poliacrilamida (el tamao de los poros del gel depende de la tcnica
de preparacin del mismo). Las protenas ms pequeas pasan a travs de los poros del gel ms
fcilmente, recorriendo una mayor distancia, lo contrario ocurre con las protenas de mayor
tamao, como consecuencia, las protenas se separan en bandas de acuerdo a su tamao. Estas
bandas se visualizan por tratamientos con un colorante. Si L es el largo del gel y d
1
, d
2
y d
3
son
las distancias recorridas se pueden calcular los Rf ("Running front": frente de corrida) para cada
una de ellas:
L
d
Rf =

A partir de los Rf se puede calcular el peso molecular de cada una de las protenas.

18
2.4. Fraccionamiento salino

Se basa en la separacin de una mezcla proteica por el agregado de sales ("salting in" o
"salting out"). La precipitacin con sales es un mtodo muy efectivo para la purificacin proteica.
El agente precipitante ms usado es el sulfato de amonio: (NH
4
)
2
SO
4.
Se usa para la precipitacin
y purificacin de las distintas enzimas presentes en un tejido determinado, debido a su gran
solubilidad en agua destilada an a bajas temperaturas, lo que permite usarlo en altas
concentraciones, es adems econmico y no tiene efectos nocivos sobre las protenas.

2.5. Dilisis

Permite separar las protenas, de un soluto de bajo peso molecular, haciendo pasar este
ltimo a travs de una membrana semipermeable que retiene a las molculas proteicas.

3. PROTEI NAS PLASMATI CAS

3.1. Composicin de la sangre

La sangre es un tejido que circula dentro del sistema de los vasos sanguneos. Est
compuesta por elementos figurados (eritrocitos o glbulos rojos, leucocitos o glbulos blancos y
plaquetas) y por el plasma que mantiene a las clulas en suspensin.
La sangre constituye el vehculo por el cual la mayor parte de los nutrientes son
transportados al hgado y a los rganos en general, y los productos de desecho retornan a los
pulmones y a los riones, para su excrecin. La sangre transporta el oxgeno desde los pulmones
a los tejidos, y el dixido de carbono, producido durante el metabolismo respiratorio desde las
clulas hacia los pulmones.
Casi la mitad, aproximadamente, del volumen sanguneo lo ocupan sus clulas, que
consisten en su mayor parte en los glbulos rojos y en una cantidad mucho ms pequea, los
glbulos blancos y las plaquetas.
Si se saca sangre de una vena y se agrega un anticoagulante apropiado para prevenir su
coagulacin, los elementos celulares en suspensin pueden ser separados por centrifugacin. El
lquido sobrenadante, normalmente de color ligeramente amarillo, se denomina plasma
sanguneo.
Si al extraer la sangre se deja que coagule, y se somete luego a centrifugacin, se separa
un lquido que se denomina suero sanguneo.
As, la diferencia entre plasma y suero sanguneo es que este ltimo carece de fibringeno
(precursor de la fibrina que forma el cogulo).
El plasma contiene aproximadamente un 10% de solutos disueltos, de estos un 2% esta
integrado por nutrientes orgnicos y sustancias de desecho. Un 1% est representado por sales
inorgnicas y aproximadamente el 7% restante, lo constituyen las protenas plasmticas.
Los principales iones inorgnicos del plasma sanguneo son el Na
+
, Ca
++
, Mg
++
, Cl
-
,
HCO
3
-
y H
2
PO
4
-
, que desarrollan una importante funcin en la regulacin de la actividad hstica.

19
Las protenas plasmticas estn integradas por una mezcla de diferentes fracciones
proteicas. La concentracin total de protenas plasmticas en mamferos vara entre 5,5 y 8,5
g/100ml (ver cuadro pg. 28).

3.2. Fracciones proteicas del plasma

3.2.1. Fibringeno
Es el precursor de la fibrina, que participa en la formacin del cogulo sanguneo. Esta
protena es producida por el hgado y constituye solo el 4 - 6% de las protenas totales del plasma.
El suero no contiene fibringeno puesto que se usa en el mecanismo de coagulacin, pero s
contiene la misma cantidad de albminas y globulinas que el plasma.

3.2.2. Albmina
Es la fraccin ms abundante, aunque las cantidades relativas, varan entre 40-60% de las
protenas totales, segn las distintas especies. La albmina es sintetizada en el hgado y sus
principales funciones son:
a) El mantenimiento del volumen del plasma, o sea del equilibrio osmtico entre la sangre
circulante y el lquido intersticial.
b) El transporte de sustancias poco solubles en agua (Ej: cidos grasos libres).

3.2.3. Globulinas
La fraccin globulnica de las protenas plasmticas es una mezcla muy compleja, que
agrupa las siguientes fracciones principales: o
1
y o
2
globulinas, | globulinas y globulinas.
Todas cumplen funciones biolgicas muy importantes; por ejemplo:
a) Antitripsina (o
1
globulina)
b) Ceruloplasmina: (o
2
globulina), transporta el 90% del cobre presente en el plasma.
c) Transferrina: (| globulina) es una glucoprotena que transporta el Fe
+++
desde el intestino a
los lugares del organismo que lo necesiten.
d) Inmunoglobulinas: ( globulina) son sintetizadas en los linfocitos B, secretadas a la
circulacin sangunea y constituyen un mecanismo importante de defensa del organismo.
Las proporciones de las globulinas varan segn las especies animales.

Las protenas plasmticas se pueden dosar por varios mtodos espectrofotomtricos.

4. FOTOMETRI A

4.1. I ntroduccin

La luz, energa radiante o radiacin electromagntica interacta con la materia
produciendo una variedad de fenmenos ampliamente conocidos: reflexin, refraccin,
absorcin, polarizacin, etc. De todos estos fenmenos, el de absorcin de la luz constituye la
base de los mtodos de anlisis ms importantes de la qumica biolgica y otras ciencias.

20
Cuando un haz de luz llega a un medio homogneo, una parte de la luz incidente se
refleja, otra se absorbe y el resto es transmitida.
Verificndose que: I
0
=I
a
+I
t
+I
r

Donde:Io =intensidad de la luz incidente.
Ia =intensidad de la luz absorbida.
I t =intensidad de la luz transmitida.
I r =intensidad de la luz reflejada.
De la ecuacin anterior puede despreciarse la I r por ser del orden del 4% respecto de la
incidente (cuando se trata de interfase aire-vidrio) quedando:

I
0
=I
a
+I
t

La fraccin de luz transmitida I t depende:
a) De la intensidad de la Io.
b) Del espesor (l) del medio atravesado por la luz.
c) De la estructura molecular de la sustancia disuelta en ese medio y tambin de la estructura del
solvente.
d) De la concentracin (c) de dicha sustancia.
e) De la longitud de onda () utilizada en el haz incidente.
f) De la temperatura del sistema.

Los mtodos fotomtricos se pueden utilizar para:
a) La identificacin de una sustancia por medio de su espectro de absorcin caracterstico.
b) Hallar la concentracin en base a la luz absorbida a una determinada longitud de onda ().
De estas dos posibilidades que brinda la espectrofotometra, estudiaremos aqu la segunda
o sea la medicin de la concentracin de una sustancia en solucin en base a la luz absorbida.

21
4.2. Teora de la espectrofotometra

4.2.1. Ley de Lambert
En 1760, Lambert investig la relacin existente entre I o e I t cuando la luz atravesaba
lminas coloreadas de diferentes espesores, estableciendo que la I t decrece exponencialmente al
aumentar el espesor (l) de la lmina, es decir:
l
0
10

= I I
t
(1)
Siendo c el coeficiente de extincin que es constante y especfico de la lmina utilizada.

4.2.2. Ley de Beer
En 1852, Beer estudi la absorcin de la luz por medio de soluciones coloreadas variando
la concentracin (c) en lugar del espesor, llegando a una expresin matemtica similar:
c
t
I I
c
= 10
0
(2)
Lo que significa que la It disminuye exponencialmente al aumentar c.
Como las soluciones pueden medirse bajo espesores diferentes se pueden combinar las
dos ecuaciones anteriores (1) y (2) en una que rene las leyes de Lambert y Beer:
lc
t
I I
c
= 10
0
o bien
cl t
I
I
c
=10
0

Que al aplicarle logaritmo resulta:
10 log log
0
= cl
I
I
t

Multiplicando por (-1) nos conduce al concepto de absorbancia (A) ya que:
cl
I
I
I
I
t
t
c = =
0
0
log log cl A c = (3)
De la ecuacin (3) podemos despejar el coeficiente de extincin molar:
cl
A
= c que puede
definirse como la absorbancia de una solucin cuando el espesor es igual a 1 cm y la
concentracin es 1 M y sus unidades son:
1 1
M cm ya que la absorbancia no tiene unidades.
Se llama transmitancia (T) a la relacin
0
I
I
T
t
= o fraccin de luz transmitida, y
transmitancia porcentual:

0
100 %
I
I
T
t
=

De estas definiciones se deduce la relacin entre Absorbancia y Transmitancia porcentual:
Como
0
100 %
I
I
T
t
=

Aplicando logaritmos
0
100 I I T
t
log log log % log + =

22
Multiplicando x (-1)
0
100 I I T
t
log log log % log + =

t
I
I
T
0
log 2 % log + =
A T + = 2 % log

Para T% = 100 100% de luz transmitida
la A = 0
Para T% = 0 0% de luz transmitida
la A ~ 2

4.3. I nstrumental: Fotocolormetro y espectrofotmetro

El fotocolormetro se esquematiza en la siguiente figura:

Se emplea usualmente luz blanca de tungsteno que es filtrada por lminas coloreadas
(fotomtro a filtro). De todo el espectro visible, el filtro deja pasar un cierto ancho de longitudes
de onda ( ) que incidir en el tubo o cubeta con la solucin a medir.
Si en lugar de filtros se utiliza un prisma o una red de difraccin (o ambos combinados) se
consiguen medidas ms precisas, pudindose modificar la longitud de onda del espectro en forma
continua. Con esto se consigue ms definicin en las lecturas del aparato (espectrofotmetro).
Por otra parte, puede cambiarse la fuente de luz y alcanzarse, usando otras lmparas,
zonas del espectro no visibles, por ej. lmparas de Deuterio para leer en la zona Ultra Violeta
(U.V.). Todos estos mtodos permiten dosar sustancias en muy pequeas cantidades (trazas).
Las lecturas se hacen en un galvanmetro graduado directamente en unidades de
absorbancia, aunque la mayora de los equipos cuentan con una doble escala paralela de
Absorbancia y Transmitancia porcentual (ver esquema). En el trabajo prctico utilizaremos la
absorbancia que mantiene una relacin lineal con la concentracin.
Por ltimo puede mencionarse que en equipos ms modernos la lectura es digital y poseen
minicomputadoras que permiten obtener directamente la concentracin expresada en las unidades
deseadas.
% log 2 T A =

23

4.4. Curva de calibracin

Se usa para evaluar la concentracin de una sustancia S. De la ecuacin lc A c = se
infiere que si se grafica la absorbancia de una solucin en funcin de concentraciones variables
de la misma, se obtiene una recta que pasa por el origen y cuya pendiente es cl, o sea una curva
de calibracin consiste en un grfico que relaciona absorbancia con concentraciones conocidas de
la sustancia S a dosar.
Para realizar una curva de calibracin:
a) Se utiliza como testigo una solucin de la sustancia a dosar (S), valorada por otro mtodo.
b) Se toman diferentes alcuotas de la solucin testigo, llevndolas en cada caso al mismo
volumen final con agua destilada, luego se agregan el o los reactivos que producen la
reaccin de color. Quedan as diferentes concentraciones de la sustancia y a cada una le
corresponder un valor determinado de absorbancia.
c) Se prepara un blanco en el que intervienen todas las sustancias que participan en la reaccin
colorimtrica menos la que se quiere dosar.
d) Se coloca el blanco en la cubeta de un fotocolormetro o espectofotmetro y se ajusta la
absorbancia a cero.
e) Se lee a continuacin las absorbancias de cada una de las distintas concentraciones de la
solucin testigo.
f) Los datos obtenidos se consignan en una tabla y luego se realiza un grfico de absorbancia en
funcin de la concentracin.
Este grfico puede ser una recta o una curva que en ambos casos pasan por el origen.

En el caso I se observa que la absorbancia es directamente proporcional a la
concentracin o sea, se cumple la Ley de Lambert y Beer: A =clc en todo el rango de
concentraciones elegidas en este ejemplo (salvo pequeas desviaciones experimentales).

24
En el caso I I , se produce una desviacin para concentraciones mayores de 4 mg/ml. Esto
se debe a alteraciones del c que modifican la pendiente.
Una vez construida la curva de calibracin, se procede a hallar la concentracin
desconocida de la sustancia (S) contenida en algn material biolgico; para ello, a una cantidad
determinada de dicha sustancia se le agrega el o los reactivos de color y se lee la absorbancia
(A
s
).
El valor de la absorbancia (A
s
) se busca sobre el eje de las ordenadas y se halla la
concentracin correspondiente.
En el caso I I que no cumple con la Ley de Lambert y Beer se deber hacer una dilucin
de la sustancia en estudio para que el valor de la absorbancia est comprendido en la zona en que
se cumple la ley (menor 4mg/ml).

4.5. Utilizacin del blanco

Se prepara un blanco con los reactivos (R) sin el agregado de la sustancia a dosar (S). El
blanco puede ser utilizado en dos formas:

1
er
Mtodo:
a) Se coloca el blanco en la cubeta del aparato y se ajusta la absorbancia a cero.

Ab=0

b) Se prepara un tubo con la sustancia a dosar (S) ms los reactivos (R+S). Se coloca en la
cubeta del aparato y se mide su absorbancia A
s
. El valor de la absorbancia leda corresponde
al color desarrollado en la reaccin colorimtrica debido a S. A este valor se lo llama
absorbancia corregida (A
c
).

2 Mtodo:
a) Se coloca agua destilada en la cubeta del aparato y se ajusta la absorbancia a cero.
b) Luego se mide la absorbancia del blanco de los reactivos y obtenemos A
b
.
c) Por ltimo se mide la absorbancia de (R+S) y se obtiene A
s
.

Ab As Ac =

Este ltimo mtodo se utiliza cuando el color de los reactivos es casi tan pronunciado
como el de la reaccin. Si se ajustara la absorbancia a cero con el 1
er
mtodo, la lectura de la
absorbancia de la reaccin sera muy baja, movindose la aguja en una zona de la escala en la
cual el aparato tiene muy poca sensibilidad.

4.6. Clculo del factor

Cuando se obtiene una recta, como en el caso I , que mantiene la proporcionalidad como
exige la Ley de Lambert y Beer, puede hallarse un factor para calcular la concentracin

25
desconocida de una sustancia (S). Trazada la recta que pasa por el origen, si se toman dos
puntos sobre la recta para los cuales se verifica:

1 1
lc A c =
2 2
cl A c =

Dividiendo miembro a miembro:
2
1
2
1
c
c
A
A
=

c y l son constantes porque l no vara por usarse la misma cubeta y c es el coeficiente de
extincin molar para la sustancia en estudio.
Luego:
1
2
2
1
A
A
c
c =
Donde: f
A
c
=
2
2

f: es el factor de la reaccin en las condiciones utilizadas, con el cual podremos independizarnos
del grfico. Este factor, que es un dato experimental, no es otra cosa que la inversa de la
pendiente de la recta. Entonces, para cualquier concentracin desconocida (cx) se efecta la
lectura Ax y se emplea la ecuacin:
Ax f cx =

5. DETERMI NACI ON DE PROTEI NAS PLASMATI CAS

5.1. La reaccin del Biuret: Fundamento

Las sustancias que contienen dos o ms uniones peptdicas, forman un complejo
coloreado con sales de cobre en solucin alcalina (reactivo del Biuret). La absorbancia de estos
complejos coloreados vara linealmente con la concentracin de protenas (cumple la Ley de
Lambert y Beer), dentro de ciertos lmites.
En este trabajo prctico se construir una curva de calibracin usando como solucin
testigo: albmina bovina.

5.2. Otros mtodos para valorar protenas

5.2.1. Mtodo de Lowry
Fundamento: El color obtenido es el resultado de:
a) La formacin del complejo entre protenas y el ion cprico en medio alcalino (reaccin del
Biuret).

26
b) Reduccin del reactivo fosfomolbdico-fosfotngstico por accin de la tirosina y el triptofano
presentes en las protenas. Se obtiene as una sensibilidad unas 100 veces mayor que la del
Biuret solamente.

5.2.2. Mtodo de absorcin en el ultravioleta
Fundamento: Las protenas tienen una absorcin mxima de la luz ultravioleta a 280 nm,
luego la lectura directa de una solucin proteica en la =280, es un mtodo rpido y sensible
para calcular la concentracin de protenas.

5.2.3. Mtodo de Bradford
Fundamento: El colorante Coomasie Brillant Blue G250 existe en dos diferentes colores, azul y
rojo, la forma roja se convierte en la azul cuando el colorante se une a protenas formando un
complejo de color azul. Este ensayo evita la mayor parte de las interferencias de los otros
mtodos mencionados y puede ser aplicado a una gran variedad de muestras. Es un mtodo muy
sensible debido al alto coeficiente de extincin del complejo formado. Rango de trabajo: 10 100
g. Puede reducirse la escala y llevarla al rango 1 10 g.

El aumento de la concentracin de las protenas plasmticas (hiperproteinemia) o su
disminucin (hipoproteinemia) estn vinculados con diferentes patologas cuyo diagnstico, debe
ser completado con el estudio de las diferentes fracciones proteicas mediante un proteinograma.

27
6. TRABAJ O PRACTI CO EXPERI MENTAL

DOSAJ E DE PROTEI NAS PLASMATI CAS

DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DEL BIURET

1. Muestra
Suero sanguneo de concentracin proteica desconocida.

2. Reactivos
a) Solucin saturada de hidrxido de sodio
Hidrxido de sodio p.a. 70 g
Agua destilada c.s.p. 100 ml
b) Solucin de hidrxido de sodio 10%
Solucin saturada 42,8 ml
c) Solucin testigo de albmina bovina 10 mg/ml:
Albmina bovina 1 g
Cloruro de sodio 0,9% c.s.p. 100 ml
Disolver a temperatura ambiente.
d) Reactivo del Biuret
Sulfato cprico penta hidratado p.a. 1,6 g
Tartrato de sodio y potasio puro 6,0 g
Solucin de hidrxido de sodio 10% 300 ml
Agua destilada c.s.p. 1.000 ml
Disolver el sulfato cprico y tartrato de sodio y potasio en aproximadamente 300 ml de
agua destilada, agregar 300 ml de solucin de hidrxido de sodio 10% dejar enfriar y llevar a
volumen en un matraz aforado de 1 litro.

3. Material de laboratorio (por grupo de alumnos)
13 tubos de ensayo
1 pipeta de 0,1 ml graduada 1/1000
1 pipeta de 0,2 ml graduada 1/1000
1 pipeta de 1 ml graduada 1/100
1 gradilla para tubos de ensayo

4. Aparatos e instrumentos
Fotocolormetro o espectrofotmetro

28
5. Tcnica

5.1. Curva de calibracin

Rotular un tubo de ensayo con la letra B (blanco) y cuatro tubos de ensayo con los
nmeros 1, 2, 3, 4. Agregar los reactivos segn se indica en el cuadro.

Orden de los tubos
en la gradilla

B

1

2

3

4

Sc. Testigo Prot. 10mg/ml

-

0,2

0,4

0,6

0,8

Agua destilada (ml)

2

1,8

1,6

1,4

1,2

Reactivo del Biuret

5

5

5

5

5

Mezclar y leer a los 20 minutos las absorbancias del contenido de cada uno de los tubos,
usando como blanco el contenido del tubo B, para llevar a 0. Usar filtro 546 nm y anotar los
resultados en este cuadro.

Absorbancia corregida
Cantidad de protenas en los
testigos (mg)
- 2 4 6 8

Reproducir "Absorbancias corregidas" en el cuadro de resultados del informe y con ellos
graficar en papel milimetrado la curva de calibracin (Absorbancia corregida en funcin de mg
de protena). El grfico debe dar una recta que pasa por el origen.

5.2. Dosaje de protenas totales en suero sanguneo

Rotular dos tubos de ensayo con las letras B (blanco) y M (muestra). Colocar en los tubos
rotulados los reactivos en el orden que indica el siguiente cuadro.

29

Orden de los tubos en la gradilla

B

M

Suero (ml)

-

0,1

Agua destilada (ml)

2

1,9

Reactivo del biuret (ml)

5

5

Mezclar el contenido de cada tubo y esperar 20 minutos para que se desarrolle color. Leer
las absorbancias a 546 nm usando el contenido del tubo B como blanco. Anotar en este cuadro.

Absorbancia corregida

mg protenas

-

Concentracin de protenas en g/100 ml

-

Buscar e indicar en la curva de calibracin los mg de protenas correspondientes a la
absorbancia de la muestra y anotarlas en la ltima columna. La ltima fila (g/100 ml) se calcular
en base a la cantidad de muestra utilizada, 0,1 ml de suero, teniendo en cuenta que se midi
directamente (sin diluir).
Ej.: Una muestra de suero sanguneo da por el mtodo del Biuret una absorbancia de
0,300. Suponiendo que esta absorbancia corresponda, segn la curva de calibracin, a 6 mg de
protenas, calcular la concentracin en g/100 ml si se utilizaron para la reaccin 0,1 ml de suero.

0,1 ml de suero 6 mg de protenas
100,0 ml de suero x mg de protenas x =6000 mg =6g

Luego la concentracin de protenas =6 g/100 ml de suero.
Reproducir las tres ltimas filas del cuadro anterior en la hoja del informe y calcular la
concentracin de protenas totales. Este valor depende de la edad, sexo, y de la especie animal.
Su alteracin tiene significado clnico en algunas enfermedades. Volcar estos resultados en el
ltimo cuadro del informe.

30
Apellido y nombre:
Comisin:
Fecha:

I NFORME DEL TRABAJ O PRACTI CO EXPERI MENTAL
DOSAJ E DE PROTEI NAS PLASMATI CAS

1. Objetivo y fundamento

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

2. Resultados

a) Curva de calibracin

Tubo

B

1

2

3

4

Absorbancia
corregida

mg Protenas

0

2

4

6

8

31
b) Grfico

c) Dosaje de protenas totales

Tubo

B

M

Absorbancia

mg Protenas

-

g de protenas/100 ml suero

-

3. Conclusiones

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

......................................................................................................................................................

32
7. FRACCI ONAMI ENTO DE PROTEI NAS PLASMATI CAS: ELECTRO-
FORESI S

Introduccin

Se denomina electroforesis al movimiento de partculas cargadas, presentes en una
solucin, bajo la influencia de un campo elctrico. Las partculas cargadas pueden ser enzimas,
cidos nucleicos, lipoprotenas, glucoprotenas o elementos organizados como virus, bacterias,
espermatozoides.
En la electroforesis sobre soporte, la solucin que contiene las sustancias a separar se
coloca (o siembra) sobre un soporte, embebido en un buffer adecuado, cuyos extremos estn
sumergidos en sendas cubas cargadas con dicho buffer y conectadas a los electrodos provenientes
de una fuente de poder. Como soportes pueden utilizarse agar, gel de poliacrilamida, papel de
filtro, acetato de celulosa, etc.
En el trabajo prctico se realizar la electroforesis de protenas plasmticas en tiras de
acetato de celulosa: Proteinograma. El acetato de celulosa contiene la celulosa con parte o
todos los grupos -OH de las unidades de glucosa reemplazados por acetato. Esto elimina casi
enteramente las propiedades adsorbentes de la celulosa. Es un soporte delgado que presenta las
siguientes ventajas:
a) Mnima adsorcin, separacin de las fracciones ms rpida y eliminacin del color de base
ms fcilmente.
b) Material homogneo, microporoso y qumicamente puro.
c) Se usa menos material biolgico que con el papel.
d) Se puede transparentar para su "scanning", o cortar las bandas y medirlas
fotocolorimtricamente.
Las desventajas seran:
a) Tendencia a secarse durante la corrida por su delgadez.
b) Alta electroendsmosis.
c) Alto costo.
El proteinograma se efectuar con un equipo semejante al de la siguiente figura.

33
Una vez colocado el soporte adecuadamente, se siembra el suero en la zona indicada en la
figura, luego se aplica una corriente elctrica para lograr la separacin de las fracciones proteicas
segn la especie, por ejemplo en bovinos las fracciones son albminas, o
1
, o
2
, | y globulinas.
Luego de efectuada la corrida electrofortica, las fracciones proteicas separadas se pondrn de
manifiesto mediante la tincin de las mismas.
El aspecto de la tira coloreada (proteinograma) mostrando las zonas separadas es el
siguiente en una muestra de suero bovino:
Teora de la electroforesis

En principio, podemos considerar que la velocidad de una partcula cargada es
directamente proporcional al campo elctrico aplicado y la constante de proporcionalidad es
llamada movilidad m.
m H v = Donde
d
V
H =

H =campo elctrico v = velocidad de migracin de la partcula
V =voltaje aplicado d = distancia entre electrodos

A su vez, la movilidad depende de la carga neta de la partcula, su radio, la viscosidad del
medio lquido en que se mueve y de la trama microcapilar del soporte slido sobre el cual migra
(papel o acetato de celulosa), siendo adems inversamente proporcional a la raz cuadrada de la
fuerza inica.
En condiciones de trabajo estndar (cubeta, soporte, soluciones buffers y voltaje
definidos) los factores que hacen que la movilidad (m) de cada una de las fracciones proteicas sea
diferente son principalmente su tamao y su carga elctrica neta. La carga elctrica depende a
su vez del punto isoelctrico de cada protena y del pH del buffer elegido.
En general, en la realizacin del proteinograma se utiliza un buffer de pH alcalino (9,2) al
cual todas las protenas del suero estarn cargadas negativamente, dependiendo la cantidad de
cargas del nmero de grupos COO
-
, O
-
de cada una de las fracciones proteicas. Si una
protena tiene mayor cantidad de estos grupos, migrar ms rpidamente hacia el polo positivo o
nodo.
De todo lo dicho puede inferirse que las funciones del buffer sern:
a) Mantener el pH constante por encima del PI de las protenas, para que los grupos COO
-
y
O
-

estn disociados.

34
b) Transportar la corriente elctrica.
c) Proveer al medio de la fuerza inica adecuada para lograr una eficiente movilidad de las
protenas.

Otros factores que, si bien no influyen en la migracin diferencial de las protenas,
determinan una eficiente corrida electrofortica son: intensidad de corriente, temperatura y
evaporacin. La intensidad de la corriente elctrica que depende del voltaje aplicado (V) y de la
resistencia de las tiras (R), genera un calentamiento de las mismas por efecto Joule, efecto que
explica la elevacin de la temperatura de cualquier elemento que funcione como resistencia
elctrica. Al aumentar la temperatura de las tiras, aumenta la evaporacin del solvente en el
soporte, lo que se traduce en un aumento de la concentracin del buffer. Esto a su vez implica un
aumento de la fuerza inica |
.
|
\
|
=

2
2
1
z c y por ende una disminucin de la movilidad, que es
inversamente proporcional a , como se dijo anteriormente.
La evaporacin del solvente puede disminuirse trabajando con la cuba electrofortica
cerrada. Esto producir condensacin del mismo en la cara interna de la tapa de la celda
electrofortica. Cuando se trabaja a elevados voltajes es necesario refrigerar por medios
especiales las tiras electroforticas.
Debido a que los extremos de las tiras estn sumergidos en la cuba se generan corrientes
ascendentes de succin por capilaridad. Para que estas corrientes tengan igual velocidad es
importante que el nivel del buffer en los compartimientos electrdicos sea el mismo.

(1) Succin por capilaridad. (2) Evaporacin. (3) Condensacin en la tapa.

Electroendsmosis

En la electroforesis sobre soporte debe tenerse en cuenta el fenmeno de
electroendsmosis. Como la electroforesis se realiza en presencia de un buffer de pH alcalino (en
nuestro caso veronal sdico pH 9,2), los grupos ionizables del soporte estarn cargados
negativamente (-COO
-
del acetato de celulosa) y se rodean de iones cargados positivamente.

35
Al aplicar la corriente elctrica las partculas cargadas negativamente no se desplazan por
estar unidas al soporte mientras que las cargadas positivamente se desplazarn haca el polo
negativo o ctodo. Esta corriente lquida que se desplaza en sentido contrario al de la corriente
elctrica, se llama corriente electroendosmtica y el fenmeno se llama electroendsmosis.
Dicha corriente puede ser lo suficientemente fuerte como para arrastrar a molculas neutras o con
pocas cargas negativas (como las globulinas) en sentido contrario al resto de las protenas,
como s hubieran estado cargadas positivamente, sobre todo si la muestra fue sembrada cerca del
centro de la tira donde las corrientes de succin se anulan.
Considerando el conjunto de todas las fuerzas e interacciones que intervienen en una
corrida electrofortica, el proceso final se puede resumir esquemticamente en la siguiente figura.

Zona 1 Zona 2

La direccin de la corriente elctrica ser del polo negativo (-) hacia el polo positivo (+) y
la direccin de la corriente electroendosmtica, opuesta a la direccin de migracin de la
corriente elctrica, ser entonces hacia el polo negativo (-). Las corrientes de succin en la zona 1
(segn el esquema) es en el mismo sentido que la electroendsmosis y en la zona 2 a favor de la
corriente elctrica. En la zona central las corrientes lquidas de succin se anulan.
Para que un proteinograma sea ptimo debe ser ntido y contrastado, o sea sus bandas
deben ser paralelas y bien marcadas, con buena resolucin entre ellas (espacios blancos bien
definidos entre ellas).
Variaciones fisiolgicas

36

a) En animales, las observaciones realizadas deben compararse con valores tomados como
normales, segn la especie, la edad y tcnica empleada. Se acepta generalmente que en los
sueros animales se encuentran las mismas fracciones que en el humano, si bien en
proporciones diferentes.
b) Los valores de las protenas totales son menores durante la vida fetal y hasta 2 3 meses del
nacimiento, especialmente en la fraccin globulina, que es la que contiene la mayor parte de
los anticuerpos (los mamferos los reciben durante la ingesta del calostro).
c) En el hombre y el perro el contenido de albmina es superior al de globulinas, en cambio en
el caballo, vaca, oveja y cerdo la relacin se invierte (ver cociente proteico
Albmina/Globulinas en el siguiente cuadro).

Valores Normales de Protenas Sricas en Diferentes Especies

Suero
Protenas Totales
g/100ml
Albminas
g/100ml
Globulinas
g/100ml

C.P.=Alb.
Glob.

Humano
6,0 8,0 3,2 - 4,5 2,7 - 3,6 1,0 - 1,8

Canino
5,5 7,5 2,6 - 4,0 2,1 - 3,4 1,0 - 1,7

Bovino
6,0 8,5 2,7 - 3,9 2,9 - 4,9 0,6 - 1,0

Ovino
6,0 8,0 2,7 - 3,7 3,2 - 5,0 0,4 - 0,8

Equino
6,0 8,0 2,4 - 3,8 2,5 - 4,6 0,5 - 1,0

Porcino
6,0 8,0 2,3 - 4,0 3,9 - 6,0 0,4 - 0,8

Aplicaciones clnicas

El conocimiento de los valores de un proteinograma constituye un valioso elemento de
juicio para elaborar un diagnstico, pero siempre debe acompaarse de otros anlisis y del
examen clnico del animal enfermo. Una disproteinemia puede cursar con normoproteinemia
(valores normales de protenas totales) ya que es posible que el descenso de una fraccin
compense el incremento anormal de otra. Por esto es importante determinar simultneamente las
protenas totales, el proteinograma y la relacin Albmina/Globulinas para adquirir una cabal
idea del estado clnico del paciente.

37
Hiperproteinemia

a) Puede ser causada por hemoconcentracin debido a una deshidratacin que provocar
hiperalbuminemia e hiperglobulinemia, de modo que se mantiene el cociente proteico
albmina/globulina normal.
b) Problemas infecciosos e inflamatorios aumentan las protenas plasmticas totales por
aumento de sntesis de globulinas. El aumento de globulinas se debe a estados de defensa
contra agentes infecciosos (inmunidad natural o adquirida por vacunacin)
Las o y | globulinas aumentan tambin en procesos inflamatorios agudos y/o crnicos.

Hipoproteinemia
Resulta de una variedad de estados patolgicos que se pueden agrupar en:
a) Desrdenes que producen prdida de protenas. Ej: Hemorragias, nefropatas, enteropatas.
b) Desrdenes causados por disminucin de la sntesis de protenas. Ejemplo: Insuficiencia
heptica, mala absorcin, desnutricin, neoplasia heptica, que cursan con hipoalbuminemia;
o hipoplasia y neoplasia linfoide que presentan hipo globulinemia.
c) En preez y lactancia debido a las necesidades proteicas aumentadas. En ovinos la albmina
disminuye en la primera mitad de la gestacin, mientras la globulina disminuye en la etapa
final por lo que el calostro es rico en globulinas.

La electroforesis de protenas sricas ha sido utilizada en estudios inmunoqumicos de
diversas enfermedades en distintas especies (fiebre aftosa, peste porcina, etc.).
En todo proceso inmunitario se produce un aumento de globulinas (debido a la
generacin de anticuerpos que se hallan presentes en dicha fraccin) y muchas veces de las |
globulinas, cuando el organismo atacado se restablece y obtiene una verdadera resistencia a la
infeccin.

38
Proteinogramas normales y patolgicos en distintas especies

39

PROTEI NOGRAMA ELECTROFORETI CO

En la prctica se separarn por electroforesis las diferentes fracciones proteicas del suero
usando como soporte una lmina de acetato de celulosa y como buffer veronal sdico (pH 9,2).
Finalizada la separacin, la lmina de acetato de celulosa se tie con un colorante (Amido
Schwartz) con el fin de que las distintas fracciones puedan observarse y determinarse
cuantitativamente.
Para la determinacin cuantitativa se corta la tira ya teida para separar las distintas
fracciones, luego se sumerge cada una de ellas en solucin eluyente y se realizan las lecturas
fotocolorimtricas respectivas.

1. Material biolgico
Suero sanguneo no bemolizado.

2. Reactivos
a) Solucin reguladora de pH 9,2
Dietilbarbiturato de sodio (veronal sdico) p.a. 8,24 g
b) Solucin colorante
Amido Schwartz 10 B p.a. 5 g
Metanol puro 450 ml
Acido actico glacial puro 100 ml
Agua destilada 450 ml
c) Solucin eluyente
d) Solucin lavadora
Metanol puro 475 ml
e) Solucin para preteido del suero
Azul de bromofenol puro 0,1 g
Etanol puro (96% V/V) c.s.p. 100 ml
f) Solucin para conservar las tiras
Metanol puro 80 ml

3. Material de laboratorio
1 gradilla para tubos de ensayo
6 tubos de ensayo

40
1 varilla de vidrio
1 pipeta graduada de 10 ml (1/10)
1 pipeta capilar o sembrador
1 policubeta o portaobjetos
1 tijera
1 tira de acetato de celulosa

Los equipos utilizados para electroforesis estn constituidos por una fuente de poder que
suministra la fuerza electromotriz necesaria y una cuba electrofortica.
Durante el trabajo prctico experimental se usarn tambin un transformador de corriente
(220-110 voltios) y un fotocolormetro.

5. Tcnica
Carga de los compartimientos electrdicos: Colocar la cantidad apropiada de solucin buffer de
pH 9,2 en los compartimientos electrdicos, cuidando que el nivel del lquido llegue en ambos
casos hasta la misma altura.
Preparacin de las tiras de acetato de celulosa: Sumergir las tiras de acetato de celulosa de 2,5
cm de ancho y 8,5 cm de largo en solucin buffer de pH 9,2 durante 10 minutos para que se
impregnen bien con la misma. Retirar las tiras y eliminar el exceso de lquido secndolo con
papel de filtro (*). Inmediatamente, colocarlas sobre el soporte de la cuba electrofortica tratando
de que queden bien tensas y que sus extremos se hallen sumergidos en cada uno de los
compartimientos.
Preparacin de la muestra: Colocar dos gotas del colorante indicador (azul de bromofenol) en un
portaobjetos o policubetas. Inflamar hasta evaporar el solvente (etanol), dejar enfriar y agregar
dos gotas de suero sobre el residuo slido del colorante. Mezclar hasta que el conjunto tome color
azul bien homogneo. Este preteido servir como indicador del avance del frente de protenas (o
sea de la albmina).
Siembra de la muestra: Cargar el sembrador con la mezcla de suero y colorante. Retirar el exceso
de suero y apoyarlo suavemente del lado no brillante de la tira a 2 cm del compartimiento
catdico.

Esperar 3 minutos para que la muestra sea completamente adsorbida por el soporte y tapar
la cuba.

41
Ajuste de la intensidad de corriente: Conectar la cuba electrofortica a la fuente de tensin de
manera que el ctodo se halle del lado que se sembr la muestra. Mediante el control de ajuste de
la corriente, aumentar la diferencia de potencial hasta que el miliampermetro marque una
intensidad de corriente correspondiente a 1,5 - 2,0 miliamperes por tira. Mantener el sistema en
estas condiciones hasta que la albmina, que corre coloreada, se desplace de 35 a 45 mm
(aproximadamente 45 minutos).
Coloracin de las fracciones proteicas: Una vez finalizada la separacin electrofortica,
sumergir las tiras en el reactivo colorante de 3 a 5 minutos (no ms). Eliminar el exceso de
colorante mediante sucesivos lavados con la solucin lavadora hasta que sta permanezca
incolora (generalmente bastan 3 lavados).

(*) IMPORTANTE: Debe tenerse especial cuidado en evitar que las tiras queden
expuestas al aire sin estar en contacto con el buffer. La deshidratacin de las mismas puede
alterar irreversiblemente al acetato de celulosa.

6. Valoracin cuantitativa:
La valoracin cuantitativa de las fracciones puede realizarse por dos mtodos:
densitometra y elucin.

6.1. Densitometra (no se hace en este trabajo prctico experimental).
El aparato utilizado en este caso es un densitmetro que mide la intensidad del color de
cada zona por transparencia o reflexin.
Primero la tira debe ser sometida a un tratamiento qumico que la transparenta sin alterar
la intensidad de la tincin de cada fraccin proteica.

Tcnica de transparentacin: Se sumerge la tira lavada 1 en metanol anhidro durante 1 minuto,
y 2 en una solucin formada por: metanol (85 ml), cido actico (14 ml) y glicerina (1 ml),
durante 2 minutos. Luego se coloca sobre una placa de vidrio y se deja en estufa a 70C (o bajo
lmpara) durante unos minutos hasta transparencia completa. Se invierte la placa de vidrio sobre
el papel de filtro, se deja enfriar 20 minutos como mnimo y se separa la tira transparentada.

Luego se la coloca en el densitmetro, que esencialmente funciona como un
fotocolormetro. La tira trasparentada se desplaza (como una diapositiva en un proyector)
perpendicularmente a un haz de luz. A medida que este haz intercepta las franjas coloreadas, las
absorbancias producidas son traducidas al movimiento de una pluma o aguja registradora que
va graficando el densitograma sobre un papel milimetrado que se desplaza sincrnicamente con
la tira electrofortica.

42

La superficie de cada "pico" del densitograma (o forograma) obtenido representa la
cantidad de protenas en la fraccin respectiva.

Dicha superficie puede medirse mediante varios mtodos que no se describirn en este
curso.
El porcentaje proteico de cada fraccin se calcula mediante simples reglas de tres; por
ejemplo para globulina:
% 100
%
.
.
=
total Sup
Sup
o bien
ml
T P g
ml
g
total Sup
Sup
100
. .
100
.
.

=

43
En el segundo caso es necesario valorar protenas totales (g%) por cualquier otro mtodo
(por ejemplo utilizando la reaccin del Biuret).
Las ventajas principales del densitograma son que, conociendo bien la forma de la curva
normal, permite visualizar rpidamente alguna posible alteracin patolgica sin necesidad de
recordar cifras y que pueden informarse o archivarse junto con el proteinograma el cual, estando
transparentado, se conserva indefinidamente.
La desventaja reside en que el densitmetro es costoso, tiene una calibracin algo
engorrosa y requiere adems proteinogramas muy bien corridos (sin manchas ni franjas curvadas
o deformadas).

6.2. Elucin. Es el mtodo que se utilizar en el trabajo prctico experimental.
Para ello rotular seis tubos de ensayo: B, Alb., o
1
, o
2
, | y globulinas, colocar en cada
uno 2 ml de solucin eluyente.
Seleccionar la tira de manera que las fracciones queden separadas. Esto se logra cortando
por la parte media de la zona ms clara que separa a las fracciones, como se indica en la figura.

Utilizar como blanco una seccin de la misma tira de una superficie equivalente a la de
cualquiera de las fracciones y que no contenga colorante. Colocar los recortes as obtenidos en
los tubos de ensayos correspondientes. Dejar en contacto y agitar repetidamente durante el
tiempo necesario para que la tira y el colorante sean disueltos por la solucin eluyente.
Realizar la lectura fotocolorimtrica contra un blanco a 620 nm.

7. Clculos:
Una vez realizadas las lecturas en el fotocolormetro se tendrn cinco valores de absorbancia:
A
Alb
, Ao
1
, Ao
2
, A| y A. Sumando todas ellas obtenemos At, que representa la absorbancia total:
| o o
+ + + + = A A A A A A
alb t 2 1

Para obtener la concentracin relativa de cada una de las fracciones tendr que tenerse en
cuenta que At representa 100%. Por lo tanto conociendo la absorbancia de cada fraccin, por
regla de tres puede realizarse el clculo. Calcular tambin la concentracin absoluta de las
distintas fracciones teniendo en cuenta que la concentracin de protenas totales representa el
100% y conociendo la concentracin relativa de cada fraccin por regla de tres puede realizarse
el clculo. Volcar estos resultados en el cuadro del informe. Luego hallar el cociente proteico
como se indica en el informe.

44

Apellido y nombre:
Comisin:
Fecha:

PROTEI NOGRAMA ELECTROFORETI CO


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2. Resultados

Fraccin Absorbancia corregida

Concentracin relativa
(%)

Concentracin
absoluta (g%)

Albmina

o
1
globulina

o
2
globulina

| globulina

globulina

Globulinas Totales

Protenas totales

100

45

En general es muy utilizado el llamado cociente proteico que est dado por la relacin
Albmina/Globulinas.
Globulinas de in Concentrac
a Alb de in Concentrac
P C
. .
min . .
. . =

Este cociente tiene importancia diagnstica en situaciones patolgicas.

3. Conclusiones

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46
BI OENERGETI CA

TEMARI O

1. Definicin.

2. Principios de la Termodinmica. Primer principio de la termodinmica. Segundo principio de
la termodinmica.

3. Variacin de energa libre. Direccin de las reacciones qumicas. Energa libre estndar.
Relacin entre la variacin de energa libre estndar y la constante de equilibrio. Reacciones
acopladas.

4. Carga energtica de la clula.

47
1. DEFI NI CI ON

La bioenergtica es el campo de la Bioqumica que estudia la transferencia y uso de la
energa por los sistemas biolgicos.
El universo se define como el sistema ms el medio ambiente. Un sistema termodinmico
puede ser una reaccin qumica, una clula o un organismo entero. Los sistemas pueden ser
abiertos, cerrados o aislados. Los sistemas biolgicos se consideran sistemas abiertos, o sea, que
pueden intercambiar materia y energa con su medio ambiente.
2. PRI NCI PI OS DE LA TERMODI NAMI CA

2.1. Primer Principio de la Termodinmica

Establece que la energa total de un sistema y su medio ambiente es constante. Si a un
sistema con determinada cantidad de energa se le suministra cierta cantidad de calor Q, el calor
suministrado al sistema puede aparecer como un cambio en la energa interna del sistema (AE),
como una cantidad de trabajo (W) realizado por el sistema sobre el medio ambiente:

Q=AE +W W =P AV

El flujo de calor entre el sistema y el ambiente debe ser acompaado por un cambio que lo
compense en el contenido energtico del sistema o en el trabajo realizado por el sistema sobre
dicho ambiente.
Casi todos los procesos biolgicos ocurren a presin constante

Q
p
= AE +P AV

donde Q
p
es el calor consumido en el proceso a presin constante. E, P,V y Q
p
son funciones de
estado.
El calor liberado o absorbido en un proceso que se produce a presin constante es el cambio
de entalpa (A H) para la reaccin.

AH =AE +P AV

La entalpa es tambin una funcin de estado, o sea su valor es dependiente solamente de las
diferencias en el contenido de calor entre los estados inicial y final del sistema, independiente del
camino del proceso dentro del sistema. Un proceso es exotrmico cuando el sistema libera calor y
lo entrega al medio ambiente, el valor de AH <0. Un proceso es endotrmico cuando el calor es
absorbido por el sistema desde el medio ambiente, el valor de AH >0.

48
2.2. Segundo Principio de la Termodinmica

Establece que el desorden del universo se incrementa en cada proceso. Proporciona un
criterio para predecir el sentido de cualquier proceso. Reconoce un estado o condicin de la materia
y de la energa llamada entropa, que se puede definir como dispersin o desorden; es la fraccin de
la energa que no puede ser utilizada para desarrollar trabajo til. Establece que los procesos fsicos
y qumicos se desarrollan en el sentido en que la dispersin o la entropa del universo alcanza un
mximo; en este punto tiene lugar el equilibrio. El segundo principio afirma que ningn proceso
espontneo puede realizarse de modo que la entropa del universo disminuya. Los procesos que
implican un aumento de entropa son, de este modo irreversibles, o sea nunca volvern
espontneamente a su estado inicial. Desde el punto de vista terico, la entropa del universo puede
permanecer constante durante un proceso, y cuando esto sucede se dice que el proceso es
reversible.
Un sistema est en equilibrio con su medio ambiente cuando la entropa se increment a un
mximo y no existe energa disponible para manejar los procesos. As, la tendencia a incrementar
la entropa acta como una fuerza que maneja los sistemas hacia el equilibrio con su medio
ambiente. Cuando un organismo est en equilibrio con su medio ambiente, est muerto.
3. VARI ACI ON DE LA ENERGI A LI BRE

3.1. Direccin de las reacciones qumicas

La habilidad de un sistema para realizar trabajo disminuye a medida que se aproxima al
equilibrio, y en el equilibrio no hay energa disponible para realizar trabajo. La energa libre de
Gibbs (G) es una funcin termodinmica de estado que define la condicin de equilibrio en
trminos de la entalpa y entropa de un sistema a presin y temperatura constantes:

AG = AH - T AS

Donde AG es el cambio de energa libre de Gibbs, AH es el cambio de entalpa, T es la temperatura
absoluta y AS es el cambio de entropa. Si AG es negativo, el proceso es espontneo; si AG es
positivo, el proceso no es espontneo; si AG es cero, el sistema est en equilibrio.
Los sistemas biolgicos (por ej. clulas, organismos, poblacin) son sistemas abiertos, o sea
que pueden intercambiar materia y energa con su medio ambiente; los cambios de energa y de
entropa sern de importancia para determinar la direccin de los procesos termodinmicamente
favorables. Las clulas vivas, son sistemas abiertos de evolucin irreversible que se encuentran en
un estado estacionario dinmico. Un sistema abierto en el estado estacionario es capaz de realizar
trabajo, porque est alejado de su condicin de equilibrio.
El criterio para que un proceso sea favorable a T y P constantes es que AG <0.
AG se puede definir como la fraccin de la energa capaz de realizar trabajo til.

49
3.2. Energa libre estndar

La energa libre estndar de una sustancia (G) se define para una solucin 1 M, excepto
para iones hidrgeno en estado estndar biolgico que es 10
-7
M, a una presin de 1 atm y 298K.
La energa libre (G) de una solucin de una sustancia A est relacionada a su energa libre estndar
(G):
G
A
=G
A
+2,303 RT log [A] =G
A
+RT ln [A] (1)

Cuando la concentracin de A es 1 M, el trmino log es cero, y G
A
es igual a G
o
A
. Bajo otras
condiciones, sin embargo, G
A
y G
o
A
tienen valores diferentes.
Si se considera la reaccin:

aA +bB <> cC +dD (2)

El cambio de energa libre para la reaccin es:

AG
R
=G
p
G
r
=(cG
C
+dG
D
) - (aG
A
+bG
B
) (3)

Reemplazando la expresin para la energa libre estndar de cada componente de la reaccin
anterior, se obtiene:
AG
R =
(cG
C
o
+dG
D
o
- aG
A
o
- bG
B
o
) +2,303 R T log [C]
c
[D]
d

[A]
a
[B]
b
(4)

El trmino entre parntesis en la ecuacin (4) es el cambio de energa libre estndar para la
reaccin, AG
o
mientras que el segundo trmino depender de la relacin X tal que :
X
=
[C]
c
[D]
d

[A]
a
[B]
b

Las condiciones estndares para definir el AG se establecen en P =1 atm, T =298K,
concentraciones de reactivos y productos =1 M, pH =0 en sistemas fsico-qumicos o pH =7 en
sistemas biolgicos. Se diferenciarn ambas situaciones colocando un apstrofe () en caso de
tratarse de sistemas biolgicos ( AG
o
' ).

3.3.1. Relacin entre AG' (variacin de energa libre estndar) y Keq

En el equilibrio, el cambio de energa libre es cero y X es la constante de equilibrio o K
eq

para la reaccin.
0 = AG'+RT ln {[C]
c
.[D]
d
}
eq
(5)
{[A]
a
.[B]
b
}
eq

AG
o
' =-RT ln Keq (6)

50
La ecuacin (6) establece la importante relacin entre la variacin de la energa libre
estndar y la constante de equilibrio de una reaccin.
La variacin de energa libre estndar (AG) de una reaccin da la mxima cantidad de
trabajo til que la reaccin puede producir a T y P constantes en esas condiciones. De acuerdo a la
ecuacin (6), cuando la Keq es >1, significa que la reaccin tiende a completarse en la direccin
en que se ha escrito, la variacin de energa libre estndar es negativa; es decir que la reaccin se
desarrolla en condiciones estndares con un descenso de energa libre, y por eso es
energticamente favorable en esas condiciones. Cuando la K
eq
es <1, la variacin de energa libre
estndar es positiva, la reaccin no es energticamente favorable en condiciones estndares.
Las reacciones que se producen con una variacin de energa libre estndar negativa se
denominan exergnicas; cuando la variacin de energa libre estndar es positiva las reacciones se
denominan endergnicas.

3.3.2. Variacin de energa libre en sistemas biolgicos

Las clulas son sistemas abiertos de evolucin irreversible que se encuentran en un estado
estacionario dinmico.
Los metabolitos difcilmente se encuentren en las clulas en concentraciones estndar. Para
calcular la variacin de la energa libre de una reaccin qumica a concentraciones diferentes de las
estndar se necesita conocer las concentraciones iniciales de reactivos y productos y la AG
o
' de la
reaccin.
AG = AG
o'
+RT ln [C]
c
[D]
d
(7)
[A]
a
[B]
b

El valor de AGpara una reaccin puede ser mayor, menor o igual que AG segn las
concentraciones de los reactantes y de los productos. El criterio de espontaneidad para una
reaccin es AG, no AG. Este concepto es importante porque las reacciones que no son
espontneas basadas en su AG pueden transformarse en espontneas ajustando las
concentraciones de los reactantes y de los productos. Esta condicin es la base del acoplamiento
entre las reacciones para formar las vas metablicas. En los sistemas biolgicos, el conjunto de
reacciones que forman una va metablica debe ser termodinmicamente favorable.

3.4. Reacciones acopladas

Los cambios de energa en las reacciones metablicas estn con frecuencia acoplados.
El caso ms simple de acoplamiento de energa se produce cuando dos reacciones
metablicas comparten un intermediario comn.
K
1

A +B <> C AG
1
o'
=+10 Kcal/mol
K
2

C +D <> E AG
2
o'
=-30 Kcal/mol

51

La constante de equilibrio de la reaccin final (K
3
) es igual al producto de las constantes de
equilibrio de las reacciones individuales.

K
3

A +B +D <>E K
3
=K
2
. K
1

El cambio de energa libre estndar total (AG
3
) para una serie de reacciones qumicamente
acopladas, es igual a la suma algebraica de la variacin de energa libre estndar de las etapas
individuales.

A G
3
o'
= A G
1
o'
+ A G
2
o '
= [+10 +(-30)] Kcal/mol =-20 Kcal/mol

Si la reaccin para la produccin de C es endergnica (AG
1
o'
>0) y el equilibrio se desplaza
hacia la izquierda, la reaccin neta puede todava ser exergnica, resultando en la formacin neta
de E. Esto ocurre si el cambio de energa libre estndar para la formacin de E es lo
suficientemente exergnico como para sobrepasar el cambio de energa libre estndar para la
produccin de C. Las dos reacciones estn acopladas y la segunda reaccin provee la fuerza
termodinmica necesaria para impulsar la primera reaccin.
El flujo de energa en el metabolismo se produce mediante reacciones acopladas en las
cuales participa como intermediario el ATP. La mayora de las reacciones acopladas en las que
participa el ATP involucran la transferencia del grupo fosfato a partir del ATP a otras sustancias, o
a partir de un metabolito rico en energa al ADP formando ATP.
As, el fosfoenolpiruvato (PEP), que tiene un alto potencial de transferencia fosfato (62
kJ/mol), es capaz de agregar un grupo fosfato al ADP en un proceso termodinmicamente
favorecido:

(1) Hidrlisis de
fosfoenolpiruvato (PEP) PEP +H
2
O > piruvato +P
i
AG
1
0'
= -14,0 Kcal/mol

(2) Fosforilacin de ADP ADP +P
i
>ATP +H
2
O AG
2
0
'= +7,3 Kcal/mol
______________________ ____________________________ _________________

(1) +(2): Fosforilacin PEP +ADP >piruvato +ATP AG
T
0
'= -6,7 Kcal/mol
acoplada de ADP por PEP

Por otro lado, el ATP puede ceder el fosfato a la glucosa, ya que el potencial de
transferencia de fosfato de la glucosa 6-fosfato se encuentra todava en un valor ms bajo en la
escala:

52
(1) Hidrlisis de ATP ATP +H
2
O > ADP +P
i
AG
1
0
= -7,3 Kcal/mol

(2) Fosforilacin de la glucosa G +P
i
>

G 6-P +H
2
O AG
2
0
'= +3,3 Kcal/mol
__________________________ __________________________ _________________

(1) +(2): Fosforilacin acoplada ATP +G > ADP +G 6-P AG
T
0
'= - 4,0 Kcal/mol
de glucosa por ATP

Esto explica el comportamiento del ATP como un agente de transferencia de fosfato
verstil a travs de reacciones acopladas.

En otros casos in vivo, las concentraciones de reactantes y productos se encuentran alejados
de los valores de equilibrio. Si los reactantes estn presentes en alta concentracin y los productos
estn continuamente siendo utilizados en reacciones posteriores, el valor de AG puede ser
negativo.
4. CARGA ENERGETI CA DE LA CELULA

La capacidad de una clula para llevar a cabo reacciones manejadas por el ATP dependen de
las concentraciones relativas de ATP y de sus productos de hidrlisis. Una forma para descubrir
esta capacidad es usar la siguiente relacin: [ATP]/[ADP] [Pi]. Este cociente da una medida de la
fuerza que dirige la reaccin de hidrlisis de ATP.
Debido a que la hidrlisis de ADP es tambin una reaccin de alta energa, la cual puede ser
tambin usada en algunos procesos, el estado energtico de la clula puede ser mejor descripto por
la relacin llamada carga energtica.

carga energtica = [ATP] +1/2 [ADP]
[ATP]+[ADP]+[AMP]

En el numerador estn las concentraciones de las formas que pueden actuar como fuente
de energa libre, mientras que el denominador incluye tanto el ATP como todos sus productos de
degradacin. El valor de la carga energtica oscila entre 0 (todo est presente como AMP) y 1
(todo estara presente como ATP). La mayora de las clulas normales funcionan con valores de
carga energtica de alrededor de 0,9.

53
ENZI MAS

TEMARI O

Enzimas como catalizadores biolgicos. Clasificacin. Especificidad. Sitio activo.
Complejo E-S. Cintica enzimtica: Ecuacin de Michaelis-Menten. Estado estacionario.
Significado de las constantes K
M
y Vmx. Representacin grfica de dobles recprocas.
Inhibidores reversibles: competitivos y no competitivos. Enzimas reguladoras: alostricas y por
modificacin covalente.
Estos conceptos deben ser conocidos por el alumno para poder comprender los siguientes
temas.

1. Aislamiento y purificacin de enzimas. Medida de la velocidad. Medida de la actividad
enzimtica. Aspectos tcnicos del trabajo con enzimas. Extraccin y purificacin de enzimas.
Grado de pureza y rendimiento.

2. Determinacin de la actividad de la lipasa pancretica. Introduccin. Medicin de la
actividad de la lipasa pancretica por aparicin del producto: Fundamento.

3. Trabajo prctico experimental. Determinacin de la actividad de la lipasa pancretica.

54
1. AI SLAMI ENTO Y PURI FI CACI ON DE ENZI MAS

La propiedad caracterstica de las enzimas es su capacidad de catalizar ciertas reacciones
qumicas bien definidas. La presencia de una enzima se detecta, en general, por la reaccin que
cataliza y la cantidad de la misma se estima a partir de la velocidad de reaccin.

1.1 . Medida de la velocidad

Es el paso esencial en la tcnica de estudio de una enzima. La velocidad de una reaccin
enzimtica se determina midiendo el aumento de producto formado o la desaparicin de sustrato
en funcin del tiempo.
S +Enz > P +Enz S =sustrato
P =producto

Se observa que la velocidad disminuye con el tiempo. Las causas de este fenmeno
pueden ser varias:
a) El producto puede ser un inhibidor de la reaccin.
b) Al aumentar [P] aumenta la velocidad de la reaccin opuesta.
c) Al disminuir [S] decrece el grado de saturacin de la enzima.
d) Desnaturalizacin de la enzima.
Uno o varios de estos factores pueden interactuar simultneamente; para independizarse
de estos problemas entonces se recurre a la medicin de la velocidad inicial. Slo al comienzo de
la reaccin, cuando los factores mencionados no han tenido tiempo de actuar, las condiciones se
conocen con precisin. Al trabajar con velocidades iniciales slo una pequea fraccin del
sustrato se ha transformado en producto, si la [P] es pequea la reaccin opuesta es prcticamente
nula y tampoco puede actuar como inhibidor. La velocidad inicial se determina trazando la
tangente al tiempo cero (t).

55
Los mtodos usados para realizar las curvas de producto formado en funcin del tiempo
son de dos tipos:

a) En un caso se toman alcuotas de la mezcla de reaccin a distintos tiempos y se determina la
formacin de producto o desaparicin de sustrato.

b) En casos en que la reaccin se pueda llevar a cabo en la cubeta del espectrofotmetro, por
ejemplo:
LDH
Lactato + NAD
+
> Piruvato + NADH +H
+

Se mide la aparicin de NADH en base a su absorcin a 346 nm, sin necesidad de tomar
alcuotas y la curva de producto formado en funcin del tiempo aparece directamente en la
pantalla del aparato.

1.2 . Medida de la actividad enzimtica

Se define la unidad enzimtica como la "cantidad de enzima que cataliza la
transformacin de un mol de sustrato por minuto". Otra posibilidad es definirla en relacin con
el mtodo utilizado para su valoracin.
La actividad especfica (AE) es una medida de la pureza de la preparacin enzimtica y se
expresa como UE/mg de protena. Durante el proceso de purificacin de enzimas tanto las
unidades enzimticas (UE) como la actividad especfica (AE) de la preparacin sufren
variaciones.

1.3. Aspectos tcnicos para el trabajo con enzimas

El xito en el trabajo con enzimas depende del cuidado con que se eviten las condiciones
en las cuales son inestables. Estas condiciones varan con cada enzima, pero en general deben
evitarse las altas temperaturas y la acidez o alcalinidad extremas. Durante el aislamiento y
purificacin se debe trabajar a 0C (para que la enzima no pierda actividad) y evitar pH

superiores a 9 o inferiores a 5. Los solventes orgnicos inactivan muchas enzimas a temperatura
ambiente, de modo que los fraccionamientos con los mismos deben efectuarse a baja temperatura.
Por ltimo las purificaciones deben llevarse a cabo sin prdida de tiempo y en caso necesario los
extractos se deben guardar en congelador, siempre y cuando la enzima est disuelta en un medio
adecuado para ello.
Para determinar la actividad enzimtica se deben tener en cuenta las siguientes
precauciones:
a) La reaccin que cataliza la enzima debe realizarse a la temperatura ptima para la misma.
b) Elegir un buffer adecuado para mantener estable el pH ptimo de la enzima.
c) Evitar la contaminacin con detergentes u otras sustancias contaminantes.

56
1.4. Extraccin y purificacin de enzimas

El paso comn para iniciar la extraccin de una enzima, es la obtencin de un
homogenato. La preparacin de un homogenato de tejidos implica la destruccin o disgregacin
mecnica de las clulas y por lo tanto, de la membrana celular, con lo cual se liberan las enzimas
que pasan a solucin. Algunos de los mtodos utilizados son:
a) Homogeneizacin mecnica: Puede utilizar un homogeneizador de vidrio, con pistn de
vidrio o tefln, un mortero, licuadora o aparatos similares. A veces se hace con la ayuda de
abrasivos tales como almina, bolitas de vidrio, etc.
b) Homogeneizacin snica: La radiacin snica se utiliza en general para las bacterias y
levaduras (debido a la mayor resistencia que presentan sus membranas).
c) Desintegracin trmica: El congelamiento y descongelamiento repetido permite la
desintegracin de la membrana celular. Por congelamiento se forman cristales de hielo
destruyendo la estructura intracelular. Al descongelarse, las clulas son destruidas
osmticamente debido a la presencia del agua, liberndose su contenido.
d) Desintegracin qumica: Actan agentes qumicos destruyendo la pared celular. Los ms
utilizados son el butanol, ter de petrleo, e isopentano.
Muchas veces, una vez obtenido el homogenato, es conveniente hacer una filtracin a
travs de gasa o lana de vidrio para separar tejidos conjuntivos y restos celulares. La suspensin
total obtenida por estos mtodos es lo que se denomina homogenato o extracto crudo.

A partir del homogenato se puede detectar la actividad enzimtica por la reaccin que
cataliza la enzima en estudio, pero en general se procede a realizar el aislamiento de la enzima,
utilizando en primer lugar la centrifugacin diferencial. En la centrifugacin diferencial las
partculas que difieren en densidad y tamao sedimentan a distintas velocidades por aplicacin de
una fuerza centrfuga. Un esquema tipo es el siguiente.

57
Dada la naturaleza proteica de las enzimas, los mtodos de purificacin utilizados son
los mismos que para protenas.

1.5. Grado de pureza y rendimiento

Durante la purificacin de una enzima, en cada fraccin obtenida luego de los distintos
pasos del proceso de purificacin empleado, se determinarn las UE y protenas totales. Con
estos datos se obtiene la AE =UE/mg protenas que nos permite conocer si hubo purificacin,
ya que a mayor AE tendremos menor cantidad de protenas extraas.

1.5.1. Grado de pureza
A la AE obtenida para el homogenato se le asigna el grado de pureza 1, conociendo la AE
de cada fraccin, podemos calcular el grado de pureza de cada una de ellas, a mayor AE, mayor
purificacin.

1.5.2. Rendimiento
Si al homogenato se le asigna el 100% de enzima presente, se puede calcular el
rendimiento de cada fraccin en base a las UE calculadas para cada una de ellas.

El siguiente cuadro, sirve como ejemplo de una buena purificacin acompaada de un
buen rendimiento.

FRACCIN UE
PROT. TOT.
(mg)
AE
(UE/mg)
REND.
(%)
PURIFICACION
Homogenato crudo de hgado 100.000 10.000 10 100 1
Sobrenadante 100.000 g. 98.000 8.000 12,2 98 1,22
Precipitacin con solucin saturada
(NH
4
)
2
SO
4
; 20-35% de saturacin
90.000 1.500 60 90 6
Precipitacin con solucin saturada
(NH
4
)
2
SO
4
; 40-50% de saturacin
60.000 250 240 60 24
Resina de intercambio DEAE*:
50-100
58.000 29 2.000 58 200

* DEAE: dietil amino etilcelulosa (resina de intercambio aninico)

58
2. DETERMI NACI ON DE LA ACTI VI DAD DE LA LI PASA
PANCREATI CA

2.1. I ntroduccin

Los animales superiores degradan los triacilglicridos ingeridos mediante la accin de
enzimas hidrolticas (lipasas) del jugo pancretico, en el intestino delgado. Para que la lipasa
pancretica acte, es necesario que los triacilglicridos estn solubilizados en el jugo intestinal.
En el organismo esto tiene lugar por la accin detergente de las sales biliares. La lipasa
pancretica cataliza la reaccin:

La hidrlisis completa de los triacilglicridos produce glicerol y cidos grasos. Sin
embargo se demostr que la lipasa pancretica es especfica para la hidrlisis de las uniones ester
primarias y de hidrolizar la unin ester en la posicin 2 del triacilglicrido lo hara en forma muy
lenta. Por lo dicho, debido a la dificultad de la hidrlisis de la unin ester secundaria en el
triacilglicrido, resulta que los 2-monoacilglicridos constituyen los principales productos finales
de la digestin de las grasas.

2.2 . Medicin de la actividad de la lipasa pancretica por aparicin del
producto: Fundamento

Para estudiar la actividad de la lipasa pancretica es necesario disponer del sustrato
adecuado: triacilglicridos. Una fuente de triacilglicridos de fcil acceso es la leche que posee
un 3% de sustancias grasas. Los triacilglicridos presentes en la leche se hidrolizan en presencia
de la lipasa pancretica liberando cidos grasos, por lo tanto se medir la actividad de la enzima
por titulacin de dichos cidos grasos liberados (aparicin de producto) con una base de
concentracin conocida.

Lipasa
pancretica

59

DETERMI NACI ON DE LA ACTI VI DAD DE LA LI PASA PANCREATI CA

Leche entera

2. Reactivos
a) Solucin de rojo fenol (fenol sulfonftalena)
(Vira del amarillo al rojo a pH 7,2)
Rojo fenol 0,1 g
Solucin de NaOH 0,01 N 28,2 ml (0,04 g NaOH en 100ml de solucin)
b) Extracto pancretico
c) Solucin de NaOH 0,005 N
NaOH 0,2 g
d) Leche a pH 8,0
A 500 ml de leche entera se le agregan 50 gotas de solucin de rojo fenol y tantos ml de
solucin de NaOH 1 N como para obtener un color ligeramente rosado. Se prepararn 20 ml para
cada grupo de alumnos.

1 tubo de ensayo
1 tapn para tubo de ensayo
1 pipeta de 0,2 ml
1 pipeta de 1 ml
1 pipeta de 5 ml
1 pipeta de 10 ml
1 bureta de 25 ml
1 vaso de precipitacin de 50 ml
3 Erlenmeyers de 50 ml
1 embudo de plstico

Bao termosttico a 37C

5. Tcnica

Colocar en 1 tubo de ensayo los reactivos que figuran en el siguiente cuadro.

60

Extracto pancretico en solucin (ml)

0,2

Agua destilada (ml)

0,8

Leche con rojo fenol pH 8,0 (ml)

12

Tapar el tubo de ensayo y mezclar suavemente por inversin. Incubar a 37C en un bao
termosttico durante 30 minutos. Entre tanto preparar la bureta para titular los cidos grasos
liberados, agregando NaOH 0,005 N mediante un embudo de plstico y enrasar a cero.
Colocar en el vaso de precipitacin 3 ml de leche con rojo fenol (pH 8,0) y el volumen de
agua destilada necesario para usar como referencia de color rosado en la titulacin.
A los 30 minutos tomar 3 ml del contenido del tubo de ensayo, colocarlos en un
erlenmeyer de 50 ml y titularlo con la solucin de NaOH contenida en la bureta, agregando gota a
gota hasta obtener el color rosado de referencia.
Antes de realizar la titulacin de los 30 minutos verificar que el color rosado inicial de
la leche a pH 8,0 haya virado al amarillo por la accin de los cidos grasos liberados por la
lipasa; en caso contrario no se realizar la titulacin y se dejar mayor tiempo de incubacin
(observar a los 5 minutos y anotar el tiempo).
Repetir las titulaciones sacando muestras de 3 ml de leche a los 60 y 90 minutos de
incubacin.
A partir de los volmenes gastados de la solucin de NaOH 0,005 N para titular cada una
de las muestras (30, 60 y 90 minutos), calcular el nmero de miliequivalentes de cidos grasos
presentes en 3 ml de muestra y anotar los datos en la tabla correspondiente al informe del trabajo
prctico experimental.

4. Clculo de la titulacin

La titulacin cido base se fundamenta en que en el punto de equivalencia:

nmero de equivalentes de cido =nmero de equivalentes de base

Siendo el nmero de equivalentes =Volumen x Normalidad (V x N). En este caso los
cidos que se titulan son los cidos grasos liberados a partir de los triacilglicridos de la leche por
accin de la lipasa pancretica y la base utilizada es una solucin 0,005 N de NaOH (0,005
mEq/ml).
nmero de equivalentes de cido =V de base x N de base

Si el volumen de base gastado se mide en ml y la normalidad se expresa mEq/ml, la
cantidad de cido graso titulada se expresar en mEq.
Construir en papel milimetrado un grfico de miliequivalentes de cido en funcin del
tiempo en minutos. Trazar la tangente al origen para determinar la velocidad inicial (Vo)
expresada en UE. Calcular la AE del extracto pancretico (dato: concentracin proteica del
extracto pancretico en mg/ml).

61
Apellido y nombre:
Comisin:
Fecha:

DETERMI NACI ON DE LA ACTI VI DAD DE LA LI PASA
PANCREATI CA


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2. Resultados

Volumen de NaOH (ml)
0,005N
mEq de cido liberado
Tiempo en
minutos

30

60

90

62
Realizar un grfico en papel milimetrado

Calcular Vo en UE : UE
mEq
utos
= =
min

Calcular AE: AE
UE
mg prot
= =
. .

63

FERMENTACI ON LACTI CA

TEMARI O

Entrada de glucosa a la clula. Glucosa metabolizable. Glucolisis. Objetivo de la
glucolisis. Enzimas reguladoras. Balance energtico. Condiciones energticas para el
funcionamiento de la va. Estos conceptos deben ser conocidos por el alumno para poder
comprender los siguientes temas.

1. Procesos aerbicos y anaerbicos. Introduccin. Fermentacin lctica. Accin de las
enzimas de los microorganismos del yogur sobre la lactosa de la leche. Titulacin del cido
lctico producido. Clculo de la acidez. Inhibicin enzimtica de la glucolisis.

2. Trabajo prctico experimental. Fermentacin lctica.

64
1. PROCESOS AEROBI COS Y ANAEROBI COS

1.1. I ntroduccin

Comenzaremos a estudiar la generacin de energa metablica con el estudio de la
glucolisis, que es una va universal en los sistemas biolgicos. La glucolisis est constituida por
una secuencia de reacciones que convierten la glucosa en piruvato con produccin de ATP.
Bajo condiciones aerbicas, el piruvato entra en la mitocondria donde es completamente oxidado
a CO
2
y H
2
O. Si en cambio la cantidad de oxgeno es insuficiente (anaerobiosis) como en el caso
de una contraccin muscular intensa, el piruvato se convierte en lactato en el citosol. En
algunos microorganismos anaerbicos como las levaduras, el piruvato es transformado en etanol.
La formacin de etanol y de lactato a partir de la glucosa son ejemplos de procesos
fermentativos.

CO
2
+H
2
O (aerobiosis)
glucolisis
Glucosa - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ->Piruvato

Lactato (anaerobiosis)

Existen adems otros tipos de fermentaciones que se estudiarn en el metabolismo
ruminal, como por ejemplo la fermentacin actica, propinica, butrica, etc.
El objetivo de la formacin de lactato a partir de piruvato es reoxidar la coenzima
NADH (factor limitante del sistema). El estudio de la va demostr que en ella participan dos
tipos de compuestos: algunos de 6 tomos de carbono y otros de 3 tomos de carbono. Los
primeros derivan de la glucosa o fructosa y los ltimos del gliceraldehdo, de la dihidroxiacetona
fosfato, del glicerato y del piruvato. Todos los intermediarios entre la glucosa y el piruvato estn
fosforilados y los grupos fosfato estn unidos a los -OH de las hexosas o triosas formando steres
fosfricos o anhdridos.

1.2. Fermentacin lctica

En este trabajo prctico experimental se evaluar la fermentacin lctica.
Para estudiar dicho proceso se hacen actuar los microorganismos del yogur (Lactobacillus
bulgaricus y Streptococcus thermofilus) sobre los azcares de la leche, principalmente la lactosa.
El cido lctico producido, se valorar por titulacin con una base de concentracin conocida.

65
1.3. Desdoblamiento de la lactosa de la leche por las enzimas de los microorganismos del
yogur

1.4. Produccin de cido lctico

Se prepara una mezcla leche yogur y se la fracciona en tres partes.
Una de ellas se coloca a 0C para evitar la accin enzimtica y servir como blanco de acidez
(B), debido a que la leche tiene un pH menor a 7.0 por la presencia de pequeas cantidades de
sustancias de carcter cido y al CO
2
disuelto; adems el yogur agregado aumenta la acidez
natural de la leche. A otra fraccin de la mezcla se le agrega un inhibidor de la glucolisis:
muestra +inhibidor (M+I ) y junto con la tercera fraccin sin agregados: muestra (M), se
incuban a 45C, que es la temperatura ptima para la actividad de los microorganismos del yogur.

1.5. Titulacin de acidez y clculo del cido lctico producido

La titulacin cido-base se fundamenta en que en el punto de equivalencia se cumple que:

nmero de equivalentes de cido =nmero de equivalentes de base

66

Siendo el nmero de equivalentes =Volumen x Normalidad

V
cido
. N
cido
=V
base
. N
base
(1)

En este caso el cido es el cido lctico producido durante la fermentacin y la base es
una solucin de hidrxido de sodio (0,6 N ) con la que se realiza la titulacin por lo tanto:

nmero de equivalentes de cido lctico =V
NaoH
. N
NaoH
(2)

Para calcular el nmero de equivalentes de cido lctico producidos durante la
fermentacin, deben descontarse los equivalentes de cido propios de la leche y del yogur
agregado, para lo cual, al volumen de solucin de NaOH gastados en titular el cido lctico de la
muestra (V
muestra
), es necesario restar el volumen de solucin de NaOH gastados en titular el
blanco: (V
blanco
). Remplazando en (2) V
NaoH
por (V
muestra
- V
blanco
) resulta que:

nmero de equivalentes de cido lctico =(V
muestra
- V
blanco
) . N
NaoH
(3)

Las unidades a utilizar son:
a) Si se expresan las normalidades en Equivalente/litro y los volmenes en litros, el resultado
quedar expresado en Eq de cido lctico.
b) Si se expresan las normalidades en mEq/ml y los volmenes en ml, el resultado quedar
expresado en mEq de cido lctico.

1.6. I nhibicin enzimtica de la glucolisis

En el trabajo prctico se estudiar la inhibicin producida por la yodoacetamida
(I CH
2
-CONH
2
) sobre la enzima gliceraldehdo-3-P deshidrogenasa, la que cataliza la siguiente
reaccin:

Gliceraldehdo-3-P + Pi + NAD
+
<> 1,3-bifosfoglicerato + NADH +H
+

La inhibicin irreversible es debida a la combinacin del inhibidor con los grupos -SH
esenciales de la enzima, segn la siguiente reaccin.

E-SH + I CH
2
-CONH
2
> ES-CH
2
-CONH
2
+ I H

enzima inhibidor complejo inactivo
activa yodoacetamida

67


1. Muestra
Leche
Yogur

2. Reactivos
a) Solucin de hidrxido de sodio 0,6 N
Hidrxido de sodio p.a. 24 g
b) Solucin de fenolftalena 0,1%
Fenolftalena pura 0,1 g
Etanol 96% c.s.p. 100 ml
c) Solucin 0,1 M de yodoacetamida
Yodoacetamida p.a. 1,85 g

1 probeta graduada de 100 ml
1 varilla de vidrio
3 Erlenmeyers de 125 ml con tapn de corcho o goma
3 Erlenmeyers de 250 ml
1 bureta de 25 ml graduada 1/10
1 embudo plstico


5. Tcnica

Rotular 3 Erlenmeyers de 125 ml con las letras B (blanco), M (muestra) y M+I (muestra +
inhibidor).
En un vaso de precipitacin de 500 ml colocar 420 ml de leche y 30 ml de yogur (medidos
con probeta). Mezclar muy bien con la varilla de vidrio. Colocar la mezcla obtenida en los
Erlenmeyers B y M de tal manera que al ser tapados no quede aire dentro de ellos (anaerobiosis).
Introducir rpidamente el Erlenmeyer B en un bao de agua con hielo o en el congelador de la
heladera y anotar la hora.
El Erlenmeyer M se deja por el momento a temperatura ambiente. Al resto de la leche y
yogur que qued en el vaso, agregarle 0,7 ml de solucin 0,1 M de yodoacetamida y mezclar muy

68
bien con la varilla de vidrio. Llenar con esta mezcla el Erlenmeyer M+I y taparlo en forma
similar a los anteriores (anaerobiosis). Dejar los Erlenmeyers M y M+I durante 10 minutos a
temperatura ambiente (preincubacin) y luego introducirlos en el bao termosttico a 45C.
Incubar durante 90 minutos.
Al cumplirse los 90 minutos de colocar el Erlenmeyer B en el congelador de la heladera o
en el bao de hielo, sacarlo para titular. Para ello medir 100 ml de su contenido con probeta y
pasarlos a un Erlenmeyer de 250 ml. Agregarle 5 gotas de solucin de fenolftalena 0,1% y titular
con solucin de hidrxido de sodio 0,6 N hasta color rosado persistente de la fenolftalena.
Anotar el volumen gastado (en ml) en el cuadro de resultados (V
blanco
).
Al cumplirse los 90 minutos de incubacin a 45C de los Erlenmeyer M y M+I, retirarlos
del bao termosttico y colocarlos en un bao de agua con hielo (con sto se consigue detener la
accin enzimtica). Una vez fros, titular en forma semejante a la que se us para el Erlenmeyer
B. Anotar los volmenes de solucin de hidrxido de sodio (expresados en ml) gastados en cada
una de las titulaciones en el cuadro de resultados en las columnas V
M
y V
M+I
.

6. Clculo

Efectuar las diferencias V
M
- V
blanco
y V
M+I
- V
blanco
, y anotarlas igualmente en las
columnas correspondientes del cuadro. Con ellas calcular mediante la frmula (3) los
miliequivalentes de cido lctico producidos en los Erlenmeyers M y M+I. Con estos datos
calcular el porcentaje de inhibicin.

mEq de cido lctico producidos en M 100% de actividad
mEq de cido lctico producidos en M+I x% de actividad

100% de actividad - x% de actividad = % de inhibicin

69
Apellido y nombre:
Comisin:
Fecha:



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2. Resultados

V (M)
(ml)
V (M+I )
(ml)
V (Blanco)
(ml)
V (M)
V (Blanco)
(ml)
V (M+I )
V (Blanco)
(ml)
mEq c.
(M)
100 ml.
mEq c.
(M+I )
100 ml
%
I nhibicin

70
4. Conclusiones

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71
REGULACI ON HORMONAL DEL
METABOLI SMO DE LOS HI DRATOS
DE CARBONO

TEMARI O

1. Mecanismos de regulacin de glucosa en sangre. Glucosa sangunea. Vas de entrada y
utilizacin de glucosa. Mecanismos de regulacin hormonal.

2. Mtodo de dosaje de glucosa sangunea. Mtodo enzimtico colorimtrico: Fundamento.

3. Trabajo prctico experimental. Determinacin de glucosa en sangre.

72
1. MECANI SMOS DE REGULACI ON DE GLUCOSA EN SANGRE

1.1. Glucosa sangunea

La glucemia es la concentracin de glucosa libre total en sangre. Es una constante del
medio interno. En mamferos monogstricos la glucemia oscila entre 80 y 120 mg/100 ml y en
poligstricos entre 40 y 60 mg/100 ml. La baja glucemia de los poligstricos se debe a que los
hidratos de carbono de la dieta fermentan a nivel ruminal por accin de los microorganismos;
obtenindose cidos grasos voltiles que se absorben en el rumen, por lo tanto la concentracin
de glucosa en el contenido intestinal es muy baja (10%). La glucemia en los rumiantes se
mantiene en los valores normales por la constante gluconeognesis a partir de precursores como
el cido propinico principalmente y los aminocidos glucognicos. En poligstricos el cido
graso voltil acetato es utilizado como la principal fuente de energa de los tejidos (excepto en el
sistema nervioso central y los eritrocitos).
Homeostasis es la conservacin de la composicin del medio interno, esencial para la
salud. Cuando la concentracin de alguno de los constituyentes del medio interno vara, el
organismo pone en marcha mecanismos de regulacin. El mantenimiento de los niveles de
glucosa en sangre es fundamental para lograr una adecuada distribucin en los diferentes tejidos
y principalmente para el sistema nervioso central, debido a que la glucosa es la principal fuente
energtica que atraviesa la barrera hematoenceflica en un nivel suficiente para sostener la
funcin celular normal.
Los valores de glucosa sangunea se mantienen dentro de ciertos lmites por medio de
mecanismos regulatorios del organismo.

1.2. Vas de entrada y de utilizacin de glucosa

1.3. Mecanismos de regulacin hormonal

Entre todos los mecanismos de regulacin del organismo, el que mantiene los niveles
estables de glucemia es uno de los ms finamente regulados. Cualquier variacin de este valor,
an con modificaciones fisiolgicas, no crticas, desencadena la activacin de mecanismos
reguladores a fin de restablecer los niveles normales de glucemia. En esta funcin intervienen el

73
hgado, los tejidos extrahepticos y varias hormonas (sistemas hipo e hiperglucemiante). El
hgado es el rgano glucosttico por excelencia que regula la concentracin de glucosa en sangre.
El sistema hiperglucemiante acta cuando desciende la concentracin de glucosa en
sangre y su funcin es elevar la glucemia. Est constituido por el glucagn (en situaciones
fisiolgicas), adrenalina y glucocorticoides (en situaciones de stress por ejemplo ayuno
prolongado).
El sistema hipoglucemiante cumple la funcin de disminuir el nivel de glucosa sangunea.
Est constituido por la insulina.
La insulina y el glucagn actan como un par antagnico fisiolgico y el balance entre
estos dos sistemas antagnicos contribuye a la homeostasis de la glucosa en sangre.

1.3.1. Sistema Hiperglucemiante

a) Glucagn: Es secretado por las clulas o de los islotes de Langerhans pancreticos y, a
diferencia de la adrenalina, acta en situaciones fisiolgicas, respondiendo a una disminucin
leve de glucemia o una hipoglucemia no crtica. Tiene receptores en la membrana de clulas de
hgado y tejido adiposo. Produce la activacin de la cascada fosforilante con aumento de la
[AMP
C
] y por ende de la actividad de la proteinquinasa A (PKA).

En tejido heptico:
- Activa la glucogenolisis porque la PKA acta sobre:
PKA
Fosforilasa b quinasa > Fosforilasa b quinasa-P

Fosforilasa b > Fosforilasa a-P

Glucgeno
(n)
+Pi >Glucgeno
(n-1)
+Glucosa 1-P

- Inhibe la glucogenognesis por que la PKA acta sobre:
PKA
Glucgeno Sintasa I >Glucgeno Sintasa D-P

- Estimula la gluconeognesis activando por fosforilacin a la fructosa 2,6-bisfosfatasa que
disminuye la concentracin de la F 2,6-bisP.

- Inhibe la gluclisis inactivando por fosforilacin a la piruvato quinasa y a la fosfofructoquinasa
II (enzima que sintetiza la F 2,6-bisP).

En tejido adiposo:
- Activa la liplisis por que la PKA acta sobre:
PKA
Lipasa > Lipasa-P
Lipasa
TAG > 2 AG +MAG > AG +Glicerol

74

Como consecuencia de la activacin de la glucogenolisis y de la liplisis, se producen
sustratos (Glucosa 1P y Glicerol) y energa (ATP) que son necesarios para que se active la
gluconeognesis heptica.

b) Adrenalina: Es una hormona segregada por la mdula adrenal en situaciones de stress
y/o hipoglucemia crtica. Hay receptores en la membrana de clulas de tejido heptico,
muscular, adiposo, etc. En estos tejidos activa la cascada fosforilante y en consecuencia las
siguientes vas: Glucogenolisis, liplisis y gluconeognesis heptica en forma similar al
glucagn.

En tejido muscular se activa la glucogenolisis, seguida de gluclisis.

c) Glucocorticoides: La accin de los glucocorticoides es ms lenta porque actan a nivel
del genoma sobre el mecanismo de sntesis de protenas. Son hormonas secretadas por la corteza
adrenal en situaciones de stress y/o ayuno prolongado. Hay receptores para los glucocorticoides
en el citosol y/o ncleo de clulas de tejido muscular, heptico, adiposo, etc.
En tejido adiposo estimula la liplisis (por activar la sntesis de lipasa).
En tejido muscular estimula la sntesis de proteasas y transaminasas.
Por estimulacin de estas vas se activa la gluconeognesis heptica.
En tejido heptico induce la sntesis de enzimas clave para gluconeognesis e induce la
sntesis de transaminasas.

1.3.2. Sistema hipoglucemiante
La insulina es secretada por las clulas | de los islotes de Langerhans pancreticos. Su
receptor se encuentra ubicado en la membrana celular de diferentes tejidos y sus acciones son:
- Estimular la captacin de glucosa en los tejidos muscular y adiposo debido a que provoca el
reclutamiento de los transportadores de glucosa desde el citosol hacia la membrana celular.
- Estimular la gluclisis heptica activando por desfosforilacin a la piruvato quinasa y a la
fosfofructoquinasa II que sintetiza la F 2,6-bisP.
- Inhibir la gluconeognesis heptica desactivando por desfosforilacin a la fructosa 2,6-
bisfosfatasa (enzima que disminuye la concentracin de F 2,6-bisP).
- Favorecer la utilizacin de la glucosa por gluclisis porque induce la sntesis de enzimas claves
de la va (fosfofructoquinasa, piruvato quinasa) en todos los tejidos en general y de la
glucoquinasa en el hgado.
- Inhibir la sntesis de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, disminuyendo la actividad de la
gluconeognesis heptica.
- Estimular la glucogenognesis e inhibir la glucogenolisis porque disminuye la [AMP
C
] por
activacin de la fosfodiesterasa que transforma AMP
C
> 5-AMP y de las protena-
fosfatasas (PP1).
- Estimular el ciclo de las pentosas a travs de la induccin de la sntesis de las deshidrogenasas,
aumentando la concentracin de NADPH para la sntesis de cidos grasos.
- Estimular la sntesis proteica a travs de su accin sobre el ncleo

75
- Estimular la sntesis de cidos grasos a travs de la activacin por desfosforilacin de la
AcetilCoA carboxilasa y la generacin de triacilglicridos debido a la induccin de la sntesis de
las aciltransferasas.

2. METODO DE DOSAJ E DE GLUCOSA SANGUI NEA

Mtodo enzimtico colorimtrico: Fundamento.

La glucosa es oxidada enzimticamente por la glucosa oxidasa (GOD) a cido glucnico y
agua oxigenada. El agua oxigenada en presencia de peroxidasa (POD), produce la copulacin
oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF) dando lugar a la formacin de un cromgeno
rojo-cereza con un mximo de absorcin a 505 nm.

GOD
Glucosa + O
2
+ H
2
O > Acido Glucnico + H
2
O
2

POD
2 H
2
O
2
+ 4-AF + Fenol >4-(p-Benzoquinona-monoimino) fenazona +4 H
2
O

Cromgeno rojo-cereza

76

DETERMI NACI ON DE GLUCOSA EN SANGRE

La determinacin debe efectuarse en suero o plasma. Los eritrocitos y leucocitos son
responsables de la destruccin enzimtica de la glucosa sangunea. La prdida de glucosa causada
por la gluclisis de los elementos figurados de la sangre tiene lugar rpidamente,
aproximadamente un 10% por hora a temperatura ambiente y ms rpida si existe contaminacin
por microorganismos. Por lo tanto, la sangre debe centrifugarse dentro de las 2 horas de la
extraccin hasta obtener un sobrenadante lmpido, libre de elementos figurados y transferirlo a
otro tubo.
Cuando no es posible hacer esto dentro del tiempo aconsejado debe agregarse un inhibidor
de la gluclisis, por ejemplo fluoruro de sodio (NaF) 5-10 mg/ml. Los preparados comerciales
suelen combinar NaF (2,5 mg/ml) con EDTA (1 mg/ml). El EDTA acta como anticoagulante.

No se observaron interferencias por los siguientes compuestos:

Bilirrubina hasta 200 mg/l
Acido Ascrbico hasta 75 mg/l
Acido rico hasta 200 mg/l
Hemlisis ligera

2. Reactivos
a) Testigo
Solucin de glucosa 1 g/l (listo para usar).
b) GOD/POD
Solucin de glucosa oxidasa 1.000 U/ml y peroxidasa 120 U/ml (homogeneizar por
inversin antes de usar).
c) Reactivo 4-AF
Solucin 4-aminofenazona 25 mmol/l en buffer Tris 0,92 mol/l (listo para usar)
d) Reactivo fenol
Solucin de fenol 55 mmol/l (listo para usar).
e) Reactivo de trabajo
Se prepara de acuerdo al nmero de muestras que se van a valorar. Colocar los reactivos
en las siguientes proporciones:
Reactivo 4-aminofenazona 50 ml
Reactivo fenol 50 ml
Agregar 3 ml de la solucin GOD/POD previamente homogeneizada, mezclar por
inversin sin agitar, rotular y anotar la fecha.
Duracin de los reactivos a, b, c y d: Son estables en refrigerador de 2 a 10C hasta la
fecha indicada en la caja. No mantener a temperaturas elevadas por lapsos prolongados.

77
Reactivo de trabajo: Es estable por 2 meses a partir de su preparacin; debe ser guardado
en frascos color caramelo a una temperatura de 2 a 10C. Este reactivo puede desarrollar un
ligero color rosado que no afecta su funcionamiento, siempre que se procese un blanco con cada
serie de determinaciones y un testigo peridicamente. Desechar cuando las lecturas de las
absorbancias del blanco sean superiores a 0,160 o las del testigo sean anormalmente bajas.

4 tubos de ensayo
1 frasco de color caramelo de 1 litro
3 pipetas de 0,1 ml.
1 pipeta de 2 ml.

Bao termosttico a 37 C
Fotocolormetro o espectofotmetro
Reloj o timer

5. Tcnica (para suero o plasma)
En 4 tubos de ensayo marcados B (blanco), T (testigo), MI (muestra I) y MII (muestra II)
colocar:

Tubos

B

T

M I

M II

Sc. Testigo

-

20 l

-

-

Suero 1 (M I)

-

-

20 l

-

Suero 11 (M II)

-

-

-

20 l

Reactivo de trabajo

2 ml

2 ml

2 ml

2 ml

Mezclar e incubar 10 minutos en bao de agua a 37 C. Luego leer en el espectofotmetro
a 505 nm o fotocolormetro con filtro verde (490-530 nm) llevando el aparato a 0 (cero) con el
blanco. El color de la reaccin final es estable durante una hora por lo que la lectura puede ser
hecha dentro de ese lapso.

6. Clculos
A partir de la Absorbancia y la concentracin del testigo (T) calcular el factor (f).

Concentracin T
f =
Absorbancia T

78
Para calcular la concentracin de glucosa de cada una de las muestras, multiplicar las
absorbancias de MI y MII por el factor calculado. Concentracin del testigo de glucosa =1g/l
(100 mg/100 ml).

7. Limitaciones del procedimiento
- Contaminaciones: Los reductores disminuyen la respuesta de color y los oxidantes
colorean el reactivo aumentando los blancos. Dichos agentes se pueden encontrar en el agua
destilada empleada para preparar el reactivo de trabajo, por lo que conviene controlar la calidad
de la misma o en su defecto usar RECONSTITUYENTE AA DE WIENER.
- Los detergentes, metales pesados y cianuros son inhibidores enzimticos.

79
Apellido y nombre:
Comisin:
Fecha:

DETERMI NACI ON DE GLUCOSA EN SANGRE


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2. Resultados

TESTIGO

MUESTRA I

MUESTRA II

ABSORBANCIA

CONCENTRACION

3. Conclusiones

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......................................................................................................................................................

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80
LI PI DOGRAMA

TEMARI O

1. Lipoprotenas plasmticas. Introduccin. Fracciones lipoproteicas del plasma.

2. Aplicaciones clnicas. Humanos. Felinos. Caninos.

3. Trabajo prctico experimental. Desarrollo de un lipidograma electrofortico.

81
1. LI POPROTEI NAS PLASMATI CAS

1.1. I ntroduccin

Los componentes lipdicos que se encuentran en mayor concentracin en plasma humano
y de animales superiores son el colesterol, steres de colesterol, fosfolpidos y triacilglicridos.
Estos lpidos son insolubles en soluciones acuosas y deben circular en sangre unidos a molculas
proteicas (apoprotenas).
Las lipoproteinas resultantes son clasificadas en cuatro grupos que reciben una doble
designacin segn su densidad (cuando se las separa por ultracentrifugacin) o segn su
movilidad (cuando se las fracciona por electroforesis).

1.2. Fracciones lipoproteicas del plasma

1.2.1. Quilomicrones (Q)
Son sintetizados en la mucosa intestinal a partir de los lpidos contenidos en los alimentos
(previa degradacin y absorcin) y llegan al torrente circulatorio a travs de la linfa. Constituyen
en realidad el medio de transporte de los triacilglicridos de la dieta, que son elementos
energticos de ms fcil utilizacin. Abundan en el perodo postprandial y son degradados por el
llamado (hasta hace poco) factor clarificante del plasma, que es en realidad una enzima, la
lipoproteinlipasa, presente en membrana plasmtica de las clulas endoteliales de distintos
tejidos, especialmente adiposo. Por accin de esta enzima se liberan cidos grasos libres y
glicerol de los trigliacilcridos presentes en los quilomicrones.
El aspecto opalescente (lechoso) del suero extrado despus de una ingesta rica en grasas
es debido a los quilomicrones presentes en la sangre. La permanencia de los mismos despus de
12 hs de ayuno debe considerarse patolgica.

1.2.2. Lipoprotenas de muy baja densidad (VLDL) o pre| lipoprotenas
Son sintetizadas en el hgado y transportan triacilglicridos de origen endgeno haca el
tejido adiposo principalmente. Tambin como los quilomicrones, son degradadas por la
lipoproteinlipasa que hidroliza la mayor parte de los triacilglicridos, dejando un remanente
lipdico (de densidad algo mayor) rico en colesterol llamado LDL.
Las pre| lipoprotenas pueden, en ciertos sueros normales o patolgicos, desdoblarse en
dos fracciones.

1.2.3. Lipoprotenas de baja densidad (LDL) o | lipoprotenas
Resultan de la degradacin de las VLDL y su funcin es transportar colesterol a los
tejidos perifricos y regular la sntesis "de novo" del colesterol.

1.2.4. Lipoprotenas de alta densidad (HDL) o o lipoprotenas
Son sintetizadas por el hgado e intestino y catabolizadas por el hgado, siendo ricas en
fosfolpidos y colesterol al que transportan desde los tejidos perifricos al hgado donde se

82
degradan. Tienen por consiguiente, un rol importante en la prevencin de la ateroesclerosis ya
que no depositan colesterol en las paredes vasculares.
Pueden distinguirse tres subfracciones principales: HDL
1
, HDL
2
y HDL
3
, que difieren en
densidad, tamao y composicin qumica.
2. APLI CACI ONES CLI NI CAS

Si se desea efectuar un estudio completo de las lipoprotenas plasmticas de un paciente,
lo cual es aconsejable toda vez que se pretenda diagnosticar la naturaleza de una dislipemia,
adems de un lipidograma deben realizarse valoraciones de cidos grasos libres o no
esterificados, triacilglicridos, colesterol total, colesterol esterificado, colesterol unido a HDL y a
LDL y fosfolpidos por mtodos independientes.

2.1. Humanos

En el plasma humano normal las HDL presentan dos subfracciones, la HDL
2
y la HDL
3
.
La HDL
3
es la ms abundante y migra en la banda o. Las HDL
2
estn cargadas ms
negativamente y por lo tanto migran ms velozmente en la banda denominada preo lipoprotena
(a veces se las llama lipo-albminas por tener una movilidad semejante a esta fraccin proteica).
Si bien estas subfracciones se han caracterizado perfectamente al separarlas por
ultracentrifugacin, la electroforesis se ha constituido en el mtodo de eleccin en la
investigacin clnica por su simplicidad, menor costo, rapidez, eficiencia y mnimo requerimiento
de muestra.
En la Tabla I se esquematizan para plasma humano un proteinograma y un lipidograma,
sus densitogramas (diagramados superpuestos para una mejor comparacin), las denominaciones
de cada fraccin por densidad y movilidad electrofortica (en acetato de celulosa), su
composicin lipdica y concentracin absoluta y relativa, destacndose el tipo de lpido
predominante transportado por cada una de ellas. Los valores presentados en la tabla difieren
segn los autores, las metodologas y el ncleo poblacional estudiado.
Las dislipemias humanas, especialmente las hiperlipemias (mucho ms frecuentes), han
sido profundamente estudiadas, existiendo la conocida clasificacin de Fredrickson que las
agrupa en cinco tipos segn las distintas fracciones lipoproteicas alteradas, aspecto del suero
(lmpido, cremoso, lactescente) y los diferentes niveles de triacilglicridos y colesterol.
Las enfermedades cerebro-vasculares y accidentes cardacos por formacin de ateromas
(depsitos de colesterol en arterias y arteriolas) no tienen en animales la misma incidencia que en
la especie humana que est sometida a factores de riesgo ampliamente comprobados, muchos de
los cuales no existen en aquellos. Estos factores son la hipertensin, la hipercolesterolemia
causadas fundamentalmente por la dieta, el hbito de fumar, el stress (tensin psquica), la vida
sedentaria, la obesidad, la edad avanzada y la diabetes mellitus.

83

Designacin por
electroforesis

preo lipop. o lipop.

pre|
lipop.

| lipoprotena

Quilomicrn

Designacin por
ultracentrifugacion

HDL
2
HDL
3

<- - - - HDL - - - ->

VLDL

LDL

Q

Densidad (g/l)

1,063 - 1,125 -
1,125 1,210

0,95
1,006

1,006 1,063

<0,95

Concentracin en mg%

180 - 410

20-300

160 - 560
No debe
haber

% relativo

4 13 10 - 26

0 -18

55 - 75

-

Triacilglicridos %

6

55

11

90

Fosfolpidos %

26

22

22

7

Colesterol total %

18

13

46

2

Proteinas %

50

10

21

1

Lpido predominante
Fosfolipidos y
colesterol
TAG
endg

Colesterol

TAG
exgeno
Lpidos totales =450 900 mg%

84
El dosaje de HDL-colesterol (colesterol unido a lipoprotenas de alta densidad) ha
adquirido importancia en humanos por ser un ndice de proteccin frente a los riesgos
mencionados. Esto se debe a que dicho tipo de colesterol es movilizado por las HDL desde los
tejidos hacia el hgado como se mencion anteriormente, evitando su depsito en paredes
vasculares; un nivel normal o elevado de HDL-colesterol (o colesterol) impide, por consiguiente,
la formacin de ateromas. Aunque existen varios mtodos de determinacin de HDL-colesterol,
la electroforesis en gel de agarosa es uno de los ms usados ya que pueden separarse las
fracciones lipoproteicas habituales, la banda en posicin o que contiene las HDL se corta y se
extrae su colesterol el que se cuantifica por un mtodo colorimtrico especfico (-).
En animales, la mayor parte de las hiperlipemias clnicas conocidas son secundarias a
hipotiroidismo, diabetes mellitus, hiperadrenocorticismo (colesterol y triacilglicridos
aumentados) o pancreatitis aguda (triacilglicridos y | lipoprotenas aumentados), sndromes
nefrticos, cirrosis o intoxicacin heptica. Las hiperlipemias primarias, poco comunes, pero
importantes en felinos y caninos fueron identificadas muy recientemente.

2.2. Felinos

El gato presenta cuatro clases de lipoprotenas: Quilomicrones, VLDL, LDL y HDL. En
los animales normales la HDL es la principal lipoprotena y la fraccin ms importante en cuanto
al transporte del colesterol.
La HDL felina est constituida por dos subfracciones (HDL
2
y HDL
3)
que migran juntas
en la banda o
1
.
Si se detecta un plasma hiperlipmico se deben considerar las siguientes alternativas:
a) Que la muestra no fue obtenida en ayunas.
b) Lipemia secundaria a un desorden metablico subyacente: Hiperlipemia medicamentosa,
diabetes mellitus, hipotiroidismo y sndrome nefrtico.
c) Alteracin primaria del metabolismo lipdico.
d) Hiperquilomicronemia hereditaria, debida a la baja actividad de lipoproteinlipasa plasmtica.
En los felinos no se determin la base metablica de esta afeccin.

2.3. Caninos

En el suero de perros sanos fueron identificadas las siguientes fracciones lipoproteicas:
Quilomicrones, VLDL, LDL, HDL
1,
HDL
2
y HDL
3
. La LDL migra en la banda electrofortica |
y a diferencia del humano la LDL canina acta en el transporte de triacilglicridos (30%) y
colesterol (20%).
La lipoprotena ms abundante en caninos es la HDL
2
, de migracin electrofortica o
1
a
causa de su elevada concentracin de apoprotena A (42%). La HDL
2
casi no contiene
triacilglicridos, tiene un 20% de colesterol y transporta la mayor parte del mismo en el animal
sano. La HDL
3
est presente en muy baja proporcin y migra en la banda o
1
junto a la HDL
2
.
La HDL
1
es de mayor tamao y de menor densidad, generndose principalmente por
enriquecimiento en colesterol. En la electroforesis migra en la banda o
2

85
En la Tabla II se muestra la composicin y caractersticas de las lipoprotenas caninas:
Clase de
lipoprotena
TAG
%
Colesterol
%
Fosfolpidos
%
Proteinas
%
Dimetro
nm
Apoprot.
principal
Movilidad
electrofortica
o ultracentr.
(g/l)
Quilomicrn 80 95 2 - 7 3 - 6 1 - 2 80 - 200 A, B, C Origen -
VLDL 59 15 16 10 26 - 90 B, C, E pre| < 1,008
LDL 30 22 24 23 20 B
|
1,006-1,087
HDL
1
2 35 40 22 10 -35 A o
2
1,025-1,100
HDL
2
y HDL
3
1 20 36 42 5,5 -8,5 A o
1
1,070-1,210

Algunas de las enfermedades que sufren los caninos y en las cuales se observa
hiperlipemia son: Diabetes mellitus, pancreatitis aguda, hipotiroidismo, hiperglucocorticoidismo,
enfermedad heptica colesttica, hiperlipemia idioptica.
En la Tabla I II se muestra la proporcin de cada fraccin lipoproteica presente en el
plasma, separadas por electroforesis en gel de agarosa.
Si se compara la Tabla II I correspondiente a suero canino con la Tabla I correspondiente
a suero humano se destacan las siguientes caractersticas:
a) En sueros humano y canino no se observan quilomicrones debido al ayuno (se recomienda un
ayuno no menor a 12 hs) que precedi a las pruebas.
b) En suero canino como en humano los lpidos predominantes de las HDL son los fosfolpidos
y el colesterol. Pero en suero canino las o lipoprotenas (HDL
2
y HDL
3
) constituyen la
fraccin ms abundante (94%).
c) En humanos las | lipoprotenas (LDL) son las que se encuentran en mayor concentracin
relativa (55 a 75%) y transportan especialmente colesterol mientras que la misma fraccin en
suero canino es ms rica en triglicridos y fosfolpidos que en colesterol.

Tabla II I . Composicin lipoproteica relativa del plasma en perros.

Clase de lipoprotena

HDL
1

HDL
2 y
HDL
3

VLDL

LDL

Quilomicrn

Concentracin en mg%

22

645

10

8

-

% relativo

3,2

94,2

1,5

1,2

-

Triacilglicridos %

2,2

0,4

68,8

36,4

-

Fosfolpidos %

31,0

31,9

12,3

21,4

-

Colesterol total %

41,2

21,2

6,4

20,8

-

Colesterol esterificado %

30,7

18,2

2,8

12,6

-

Colesterol libre %

10,5

3,0

3,6

8,2

-

Protenas %

23,6

46,7

12,4

20,7

-

Lpido predominante
Fosfolpidos
y colesterol
Fosfolpidos y
colesterol

TAG endgeno
TAG endgeno y
fosfolpidos

-
Lpidos totales =685 mg%

86

(-) Nota: Es importante remarcar que el colesterol plasmtico se halla libre o esterificado (en el
OH del C
3
) con cidos grasos. Ambos pueden ser a su vez transportados por las HDL o LDL. El
colesterol total (libre + esterificado) puede dosarse colorimtricamente por la reaccin de
Lieberman-Buchard, Wang-Chen u otras. El colesterol esterificado puede determinarse por
reacciones especficas y el colesterol libre se calcula por diferencia.

87

DESARROLLO DE UN LI PI DOGRAMA ELECTROFORETI CO

El desarrollo de un lipidograma es esencialmente semejante al de un proteinograma. Las
diferentes lipoprotenas se separan en gel de agarosa, obtenindose fracciones coincidentes con la
ultracentrifugacin, considerado el mtodo patrn.

Suero o plasma sanguneo no hemolizado. Si la determinacin se efecta utilizando
plasma, se agrega a la sangre una solucin de EDTA al 5% en proporcin de 0,1 ml para cada 1
ml de sangre. La muestra debe conservarse a 4C.

2. Reactivos
a) Solucin reguladora de pH 8,6
Buffer veronal-veronal sdico 0,05 M pH 8,6; =0,05. Disolver 10,3 g de veronal sdico
y 1,34 g de veronal en 700 ml de agua destilada, calentar si es necesario; completar a 1.000 ml
con agua destilada. Conservar a 4C.
b) Solucin de agarosa 0,6%
Disolver 0,6 g de agarosa en 100 ml de buffer, calentando hasta disolucin total o hasta
comienzo de ebullicin. Fraccionar en tubos y guardar a 4C. La solucin solidificada dura
aproximadamente 20 das.
c) Solucin fijadora
Etanol : Metanol : Isopropanol : Agua, segn la siguiente proporcin: 45:1:1:20
respectivamente. Duracin 30 das.
d) Solucin colorante
Disolver 0,4 g de Sudan-Black, 4 g de acetato de Zn y 120 ml de etanol en 80 ml de agua
destilada. Dejar reposar y filtrar antes de usar. Duracin aproximada 20 das.
e) Solucin para preteido del suero
Disolver 0,1 g de azul de bromofenol puro en etanol puro (96% V/V) c.s.p. 100 ml.

1 pipeta de 2ml
1 tela metlica
1 trpode
1 mechero
1 imn
1 pipeta de 0,1 ml
portaobjetos de 7 x 2,6 cm perfectamente desengrasado
agujas de 0,9 mm de dimetro y 18 mm de longitud
papel de filtro

88

Ver proteinograma

5. Tcnica
Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado con alcohol, derramar con una pipeta 1,8 ml
de solucin de agarosa, calentada a bao mara. Inmediatamente, colocar a 2 cm del borde un
trozo de aguja, cuidando de hacerlo antes de que solidifique el gel. Esperar 10 minutos y retirar la
aguja con un imn. En la canaleta as formada en la agarosa, sembrar alrededor de 10 l de suero
con una micropipeta. Una de las muestras debe ser teida con azul de bromofenol.
Colocar los portaobjetos en la cuba de electroforesis y poner en contacto con el buffer por
medio de puentes hechos con papel de filtro. Aplicar el amperaje adecuado (de 3 a 5
mA/portaobjetos). La electroforesis se detiene cuando la banda azul de bromofenol se ha
desplazado 4 cm.
Sumergir los portaobjetos en la solucin fijadora durante por lo menos 2 horas. Retirarlos,
cubrirlos con papel de filtro mojado con agua y colocarlos en la estufa a 70C media hora.
Luego sumergirlos en colorante 2 horas, lavarlos con agua destilada y dejarlos secar al
aire.
Se procede as a realizar la evaluacin semicuantitativa del lipidograma comparndolo
con otros lipidogramas normales y patolgicos.

89
Apellido y nombre:
Comisin:
Fecha:

LI PI DOGRAMA ELECTROFORETI CO


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2. Resultados

Realizar el esquema correspondiente al lipidograma obtenido y al normal correspondiente
a la especie en estudio.

3. Conclusiones

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90
METABOLI SMO DE AMI NOACI DOS

TEMARI O

1. Enzimas sricas.

2. Transaminasas. Mtodos de determinacin de la actividad de las transaminasas.

3. Mtodos de determinacin de actividad de las transaminasas.

4. I nterpretaciones clnicas.

5. Trabajo prctico experimental. Determinacin de la actividad de la GPT.

91

1. ENZI MAS SERI CAS

Las enzimas presentes en el suero provienen de los tejidos y de los elementos figurados de
la sangre. En circunstancias normales la actividad de las enzimas en plasma se mantiene
constante dentro de ciertos lmites, pero en procesos patolgicos se altera el equilibrio normal
durante un perodo de tiempo variable en que las concentraciones o actividades enzimticas
sricas aumentan como consecuencia de las alteraciones producidas en el tejido lesionado.
Las enzimas dentro de la clula pueden tener distinta localizacin, algunas son citoslicas
o mitocondriales exclusivamente (enzimas uniloculares), otras en cambio pueden encontrarse
simultneamente en citosol y mitocondrias (enzimas biloculares).
Los procesos de necrosis o destruccin tisular de los distintos rganos van acompaados
de la liberacin de las enzimas propias de ese rgano, las que pasan a la circulacin aumentando
su nivel srico en forma proporcional al porcentaje de membrana celular afectada. En los daos
celulares mnimos pasan a la sangre las enzimas citoslicas (ubicadas cerca de la membrana
plasmtica) y en los daos ms intensos lo hacen las enzimas localizadas en mitocondrias y hasta
las nucleares.
La determinacin de la actividad enzimtica srica como ayuda para el diagnstico clnico
puede ser til en distintos sentidos:
a) Indicaciones sobre existencia de enfermedad.
b) Signos para un diagnstico diferencial, al considerar la especificidad de rgano que poseen la
mayora de las enzimas.
c) Estimacin de la gravedad de la lesin celular.
d) Seguimiento del curso de la lesin.
Las enzimas que abandonan la clula pasan a sangre donde no existen los cofactores
naturalmente presentes en el interior de las mismas. Por consiguiente, las enzimas del suero son
funcionalmente poco activas, en parte por carencia de cofactores y en parte por ausencia de
sustratos.
La mayora de las enzimas son degradadas despus de su liberacin a partir de un rgano
lesionado o despus de su inyeccin en cuestin de horas o unos pocos das como mximo. En

92
particular las transaminasas desaparecen en dos o tres das, su vida media tiene una duracin
breve, especialmente si se compara con las de las protenas plasmticas.
La implicancia prctica de estas diferencias en la vida media es que los cambios de la
actividad enzimtica en suero reflejan una respuesta sumamente rpida a alteraciones de la
funcin celular, que se puede apreciar a las pocas horas de producirse la alteracin. Por el
contrario, las variaciones de las distintas fracciones de las protenas sricas que suelen ser lentas,
son ms indicativas de alteraciones de tipo crnico.

2. TRANSAMI NASAS

Las transaminasas (aminotransferasas) son enzimas que catalizan en forma reversible la
transferencia del grupo amino desde un o-aminocido al tomo de carbono de uno de los tres o-
cetocidos siguientes: piruvato, o-cetoglutarato y oxalacetato, de acuerdo a la siguiente reaccin
general.

Las transaminasas se encuentran en plantas, bacterias y tejidos animales y participan en
algunas de las etapas del catabolismo de casi todos los aminocidos. La funcin de las reacciones
de transaminacin es reunir los grupos -NH
2
de casi todos los aminocidos, en forma de un solo
aminocido, usualmente el cido glutmico o glutamato. Aunque se han encontrado varias
transaminasas, el dosaje de dos de ellas reviste importancia clnica, que son la transaminasa
glutmico pirvica (GPT) (alanina aminotransferasa ALT-) y la transaminasa glutmico
oxalactica (GOT) (aspartato aminotransferasa AST-), que catalizan las siguientes
reacciones reversibles:

GPT
Alanina + o-Cetoglutarato <> Piruvato + Glutamato (1)

GOT
Aspartato + o-Cetoglutarato <>Oxalacetato + Glutamato (2)

Ambas enzimas son citoslicas y la GOT es tambin mitocondrial. La GPT se encuentra
en alta proporcin en el tejido heptico, mientras que la GOT se encuentra adems en msculo
cardaco en grandes cantidades. As, un aumento de ambas transaminasas en el suero, es
indicativo de trastorno heptico y un aumento de la GOT con poco o nada de incremento de GPT
es indicativo de un problema cardaco.
El dosaje de ambas enzimas se puede utilizar para evaluar el grado de necrosis heptica
siempre que se conozca el estado de integridad de los dems tejidos.

93
La actividad de una enzima se puede medir determinando la velocidad de desaparicin del
sustrato o la velocidad de formacin del producto.

3. METODOS DE DETERMI NACI N DE ACTI VI DAD DE LAS
TRANSAMI NASAS

3.1. Mtodo espectrofotomtrico de Karmen

Karmen, en 1955, desarrolla un procedimiento para medir la actividad de enzimas
transaminasas en suero. Este mtodo se basa en la determinacin espectrofotomtrica de la
desaparicin del NADH que absorbe a 340 nm segn dos reacciones sucesivas:

GPT
Alanina + o-Cetoglutarato > Piruvato + Glutamato
LDH
Piruvato + NADH +H
+
> Lactato + NAD
+

Para la determinacin se requiere un espectrofotmetro U.V., provisto con cubeta
termostatizada para asegurar la temperatura constante durante la reaccin y un extracto purificado
de lactato deshidrogenasa (LDH) que se agrega en cantidad suficiente como para asegurar que
todo el piruvato originado por la actividad de la GPT sea reducido a lactato.
El decaimiento de la absorbancia debida a la desaparicin del NADH se registra durante
unos cinco minutos (mtodo cintico). Como todo el piruvato presente reacciona con el NADH
para formar lactato en forma proporcional, la reaccin catalizada por la GPT no ocurre en
sentido opuesto.
Karmen define UE como la cantidad de enzima transaminasa capaz de producir un
descenso de 0,001 de absorbancia/minuto en las condiciones del mtodo (UK).
Si bien este procedimiento es el mtodo de referencia para la determinacin de la
actividad de transaminasas, su uso en el laboratorio clnico se encuentra limitado debido a que
requiere el uso de un espectrofotmetro U.V. y extractos enzimticos purificados.
En este trabajo prctico se medir la actividad enzimtica de la GPT en suero por el
mtodo de Reitman y Frankel el cual determina la formacin de uno de los productos, el piruvato.

3.2. Mtodo colorimtrico de Reitman y Frankel

En 1957 Reitman y Frankel (R y F) desarrollaron un mtodo para medir la actividad de la
GPT y GOT. La metodologa de determinacin de GPT en suero es el siguiente:
Se incuba el suero con los sustratos (alanina y o-cetoglutarato, Reaccin 1) durante media
hora a 37C. Luego se agrega 2,4-DNFH (2,4-dinitrofenilhidracina), que con el piruvato formado
durante la transaminacin forma una hidrazona que es un compuesto coloreado en medio alcalino
(castao) que absorbe la luz a 505 nm (Reaccin 2).

Reaccin 1

94

Adems la 2,4-DNFH desnaturaliza a la enzima GPT deteniendo la reaccin de
transaminacin. Finalmente el medio se alcaliniza para estabilizar el producto y su color.
La absorbancia debida a la hidrazona formada es proporcional al piruvato presente, el cual
depende de la actividad de GPT durante la incubacin del suero con los sustratos, pero esta
dependencia no es lineal. Debido a que en el mtodo de R y F la reaccin de transaminacin se
realiza en un tubo de ensayo, el producto formado (piruvato) se acumula y desplaza la reaccin
en sentido opuesto; por lo tanto, la cantidad de piruvato formado no es la mxima posible para la
cantidad de enzima presente, vale decir, no es directamente proporcional a la actividad de
transaminasa presente. Por ese motivo R y F comparan su mtodo de ensayo con el de Karmen y
establecen una correspondencia entre los valores de absorbancia medidos por su mtodo y la
actividad de transaminasas obtenida por el mtodo de Karmen.

Reaccin 2

95
Elaborando la siguiente tabla:

Piruvato (g)

UK de GPT

8,7
17,4
26,1
34,8
43,5

37
77
116
163
234

Para una mayor comprensin de esta tcnica, ejemplificamos un posible resultado
experimental de la realizacin de una curva de calibracin y de trabajo, y dosaje de GPT en una
muestra de suero.

N
Tubo

Sc. Testigo piruvato

g piruvato

UK/ml

Dato experimental
Abs. corregida

Blanco
1
2
3
4

0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25

-
8,7
17,4
26,1
34,8
43,5

-
37
77
116
163
234

-
0,080
0,160
0,240
0,320
0,400

6

0,1 ml suero

-

I ncgnita

0,072

Las curvas de calibracin y trabajo resultantes de estos datos son las que muestran las
siguientes figuras.

96
Comentarios
a) En realidad graficar la "curva de calibracin" no tiene ninguna utilidad prctica; su nico
objeto es mostrar el cumplimiento de la Ley de Lambert y Beer para la reaccin colorimtrica
de formacin de hidrazona. En los Kits comerciales para la determinacin de GPT y GOT
solamente se recomienda graficar la "curva de trabajo" a la que llaman curva de calibracin.
b) Como la 2,4-DNFH reacciona con ceto-compuestos, podra pensarse que el o-cetoglutarato
tambin forma hidrazona con este reactivo interfiriendo en el dosaje deseado. Si bien esto es
cierto, ocurre que las hidrazonas del o-cetoglutarato, oxalacetato y piruvato absorben a
distintas longitudes de onda, por lo tanto, midiendo a 505 nm la lectura se hace especfica
para la hidrazona del piruvato.
c) Actualmente se expresan los resultados en mUI/ml, de manera que en los Kits comerciales
proporcionan una tabla de equivalencias entre UK y mUI/ml.

Conversin de unidades: mUI/ml =UK/ml x 0,482
UK/ml =mUI/ml x 2,07
d) Valores normales de GPT y GOT para algunas especies animales:

Especie Actividad de GPT (mUI/ml) Actividad de GOT (mUI/ml)

Canino y felino <25 <30
Equino sin valor diagnstico 100 - 250
Hombre <18 <18

4. I NTERPRETACI ONES CLI NI CAS

La GPT es una enzima especfica del hgado, ya que las altas actividades slo se pueden
detectar all; esto es vlido para perro, gato y primates.
En equinos y bovinos con hepatosis y hepatitis se produce escasa variacin de la
actividad.
Se han observado elevaciones significativas de la actividad de la GPT en el suero de
perros con las siguientes afecciones: Hepatitis infecciosa, neoplasia heptica, degeneracin grasa
del hgado, envenenamiento con arsnico o tetracloruro de carbono. Para los casos de necrosis o
fibrosis heptica en perros se recomienda la determinacin de la actividad de la GPT,
conjuntamente con otras pruebas de funcionamiento heptico.

97

DETERMI NACI ON DE LA ACTI VI DAD DE LA GPT

Suero sanguneo. El suero no debe presentar hemlisis porque los glbulos rojos tienen un
alto contenido de la transaminasa y se cometera un error por exceso.

2. Reactivos
a) Sustrato de la GPT
Solucin 0,2 M de L-alanina y 2 mM de o-cetoglutarato en buffer fosfato 0,1 M pH 7,4
(Na
2
HPO
4
=1,779 g +KH
2
PO
4
=1,360g +H
2
O c.s.p. 100 ml)
b) Solucin 2,4-DNFH
Solucin 1mM de 2,4-dinitrofenilhidrazina en HCI 1 mM. Guardar en heladera al abrigo
de la luz.
c) Solucin 0,4 M NaOH
NaOH 16 g
d) Solucin testigo
Solucin de piruvato de sodio 2 mM

8 tubos de ensayo
3 pipetas de 1ml graduadas 1/10
1 pipeta de 5 ml
1 pipeta de 0,2 ml

4. Aparatos e I nstrumentos
Fotocolormetro o espectrofotmetro

5. Tcnica

a) Realizacin de las curvas de calibracin y de trabajo

Rotular 6 tubos de ensayo y colocarlos ordenados en una gradilla.

98

Tubo Sc. Test.
Agua
dest.
Sc. 2,4-
DNFH
Sc.
NaOH
Abs.
Abs.
correg.
Unidades Enzimticas
mUI/ml UK/ml

B

-

0,60
0,5 5

0

0

1

0,05

0,55
0,5 5

18

37

2

0,10

0,50
0,5 5

37

77

3

0,15

0,45
0,5 5

56

116

4

0,20

0,40
0,5 5

79

163

5

0,25

0,35
0,5 5

113

234

Colocar los reactivos de las dos primeras columnas, mezclar por agitacin y agregar a
cada tubo 0,5 ml de la solucin de 2,4-DNFH guardando un intervalo de 1/2 minuto entre uno y
otro. Mezclar por agitacin e incubar durante 10 minutos a 37C (contados desde el agregado de
la solucin de 2,4-DNFH al primer tubo).
Retirar del bao a 37C y agregar 5 ml de la solucin de NaOH a cada tubo manteniendo
el intervalo de 1/2 minuto entre ellos.
Mezclar cada tubo por inversin, esperar 10 minutos y leer las absorbancias en
fotocolormetro con filtro verde (500-550 nm) o en espectrofotmetro a 505 nm llevando a 0 de
absorbancia con agua destilada.
El color es estable durante 30 minutos.
Consignar los datos obtenidos en el cuadro del informe.

b) Determinacin de la actividad de la GPT en suero sanguneo

Rotular dos tubos de ensayo con las letras B (blanco) y M (muestra). Colocar los reactivos
procediendo segn la siguiente tabla.

99

B M
Sustratos (ALA +o-CG) 0,5 ml 0,5 ml
Colocar en el bao termosttico a 37C durante 2 3 minutos
Suero
-- 0,1 ml
Agua destilada
0,1 ml --
Mezclar por agitacin suave e incubar a 37C durante 30 minutos
Reactivo 2,4-DNFH
0,5 ml 0,5 ml
Mezclar y dejar 10 minutos a 37C
NaOH 0,4 M
5 ml 5 ml

Mezclar por inversin y leer despus de dos minutos en el fotocolormetro a 505 nm,
llevando el aparato a 0 de Absorbancia con agua destilada. El color es estable durante 30
minutos.
El tubo blanco (B) contiene todos los reactivos excepto la enzima activa, de modo que no
habr reaccin y la coloracin que presenta este tubo se debe nicamente al color propio de los
reactivos agregados.
En el tubo muestra (M) se produce la reaccin enzimtica y la intensidad de color
desarrollada se deber a la actividad de la enzima presente en el suero y a la coloracin de los
reactivos, de modo que una vez ledos los dos tubos M y B tendremos dos lecturas de
Absorbancias donde:
Abs
muestra
- Abs
blanco
=Abs
corregida

En el caso de trabajar con suero hiperlipmico o ictrico se modifica la tcnica de la
siguiente manera: En lugar de agregar agua destilada en el tubo B, se agrega 0,1 ml de suero
despus de agregado el reactivo 2,4-DNFH. Esto se realiza con el objeto de igualar en el blanco y
en la muestra la absorbancia debida a este tipo de suero, que de no restarse con el blanco se
atribuir errneamente a la actividad de la GPT.

100
Apellido y nombre:
Comisin:
Fecha:

DETERMI NACI ON DE LA ACTI VI DAD DE LA GPT


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2. Resultados

a) Realizacin de las curvas de calibracin y de trabajo

Tubo Sc. testigo Absorbancia
Absorbancia
corregida

Unidades Enzimticas

mUI/ml

UK/ml

B

-

0

0

1

0,05

18

37

2

0,10

37

77

3

0,15

56

116

4

0,20

79

163

5

0,25

113

234

101
b) Grficos: Representar grficamente absorbancia corregida en funcin de ml de solucin testigo
(curva de calibracin) y en funcin de mUI/ml o UK/ml (curva de trabajo).

102

c) Determinacin de la actividad de la GPT en suero sanguneo

Absorbancia de la muestra =
Absorbancia del blanco =
Absorbancia corregida =

Unidades enzimticas presentes en el suero sanguneo:

mUI/ml =
UK/ml =

Conversin de unidades:

mUI/ml =UK/ml x 0,482
UK/ml =mUI/ml x 2,07

3. Conclusiones

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103
CUESTIONARIO

MATERI AL DE LABORATORI O Y
BI OSEGURI DAD EN EL LABORATORI O BI OQUI MI CO

1) Qu ventajas obtendra al utilizar una pipeta de doble aforo respecto a una de simple aforo?

2) Qu tipo de error cometera al vaciar completamente una pipeta de doble aforo? El error
sera por exceso o por defecto? Justifique.

3) Por qu es mejor utilizar una bureta que una pipeta para realizar una titulacin?

4) Al llenar cuatro tubos de ensayo con el mismo volumen de una solucin, se observa que la
altura de la misma en los distintos tubos es diferente. A qu se puede deber esto?

5) Para medir 45 ml de una solucin se comparan las siguientes alternativas:
a) Utilizar una probeta de 25 ml, cargarla completamente, volverla a utilizar cargando 20 ml
b) Utilizar una probeta de 50 ml
c) Utilizar una probeta de 250 ml
Cul sera la alternativa ms vlida? Describa qu ocurrira en los otros casos.

6) Para medir 0,53 ml de una solucin de fluoruro de sodio tiene dos pipetas, con las siguientes
inscripciones:
a) 1 ml 1/10
b) 1 ml 1/100
Cul utilizara? J ustifique.

7) Qu posibles accidentes pueden ocurrir durante el trabajo dentro del laboratorio?

8) Qu ventaja tiene el uso de las propipetas?

9) Con qu elementos de seguridad considera que un laboratorio debe contar para brindar
seguridad a sus operadores?

10) Qu importancia tiene conocer la potencial peligrosidad de las sustancias qumicas?

104
CUESTIONARIO

PROTEI NAS I

1. Qu representa el coeficiente de extincin molar en la ley de Lambert-Beer y en qu
unidades se mide?

2. Cul es la posible causa de la desviacin de la ley de Lambert-Beer?

3. De qu depende la constancia del factor f?

4. En qu se fundamenta la reaccin del Biuret?

5. Indique a que % de transmitancia corresponde un 0 de Absorbancia. Qu significado fsico
tiene?

6. Determinar los puntos isoelctricos de los siguientes aminocidos a 25C. Los valores de pK
a

vienen referidos a esa temperatura.

a) Fenil alanina: pK
1
: 1,83 pK
2
: 9,13
b) Tirosina: pK
1
: 2,20 pK
2
: 9,11 pK
3
: 10,07 (-OH)
c) Glutmico: pK
1
: 2,19 pK
2
: 4,25 pK
3
: 9,67 (-NH
3
+
)

7. Calcular la fuerza inica que corresponde a las siguientes soluciones.

a) (NH
4
)
2
SO
4
0,2 M
b) NaCl 0,2 M
c) NaCl 0,1 M

8. En qu direccin migrarn en un campo elctrico la cisteinil glicina a los valores de pH de:
1,5; 4,0; 7,0 y 13,0? Cisteinil glicina: pK
1
: 2,34; pK
2
: 8,18 (-SH); pK
3
: 10,28

9. Para la determinacin cuantitativa de protenas por el mtodo del Biuret se tienen los datos
del siguiente cuadro.

105

Tubo

Solucin testigo (ml)

H
2
O dest. (ml)

mg Prot.

Absorbancia

Abs. corregida

B

-

2,0

0,020

1

0,2

1,8

0,105

2

0,4

1,6

0,215

3

0,6

1,4

0,325

4

0,8

1,2

0,425

Teniendo en cuenta que se trabaj con una solucin testigo de concentracin =10 mg/ml.
a) Completar el cuadro.
b) Construir el grfico correspondiente a absorbancia vs. mg de protenas.
c) Para 2 muestras cuyas absorbancias corregidas son 0,35 y 0,65 respectivamente,
determinar los g% de protenas para los 2 casos teniendo en cuenta que se parti de 0,1 ml
de suero y que se llev al mismo volumen final en cada caso.

10. Para determinar la concentracin de protenas en g% de una muestra de suero se obtuvieron
los siguientes datos.
Absorbancia corregida mg.Prot.

Muestra 0,35
Testigo 0,23 4

Calcule la concentracin de protenas (g%) teniendo en cuenta que se cumple la ley de
Lambert-Beer y se utilizaron 0,1 ml de suero y que procedi de igual forma con la muestra
y el testigo.

106
CUESTIONARIO

PROTEI NAS I I

1. Mencione dos mtodos de fraccionamiento de protenas y explique brevemente en que
consisten.

2. Cul es el mtodo ms adecuado para separar:
a) Protenas de distinto peso molecular.
b) Protenas de distinta carga elctrica.
c) Protenas de iones.
d) Anticuerpos.

3. Qu tipos de compuestos pueden separarse con la electroforesis?

4. Mencione los factores de que depende la movilidad de una partcula en un campo elctrico.
Al trabajar en condiciones estandarizadas se eliminan algunos factores. Cules son los
factores que permanecen y son responsables de la migracin diferencial de las protenas?

5. Explique la relacin existente entre el buffer elegido y la electroforesis. Cules son las
funciones del buffer?

6. La intensidad de corriente y la temperatura, si bien no afectan a la migracin diferencial,
influyen en los resultados de una corrida. Explique como y por qu.

7. Cules son las ventajas de trabajar con la cuba tapada?

8. Electroendsmosis: explique cmo y porqu se produce.

9. Esquematice las diferentes fuerzas que intervienen en la corrida electrofortica y explique el
origen de cada una de ellas.

10. Qu fracciones proteicas espera encontrar en la corrida electrofortica de una muestra de
suero bovino? Grafique y especifique el sentido de la migracin.

11. Cmo realiza el blanco en el trabajo prctico de electroforesis?

107
12. Sabiendo que la concentracin de protenas totales es de 7,1 g% y su absorbancia corregida es
0,85; calcular las concentraciones relativas y absolutas en g% de las albminas y globulinas

FRACCIN ABS. CORREGIDA FRACCIN ABS. CORREGIDA
Albminas 0,30 Beta globulinas 0,18
Alfa-1 globulinas 0,05 Gama globulinas 0,28
Alfa-2 globulinas 0,04 Protenas totales 0,85

13. Calcular el cociente proteico de la muestra. Cmo se vera modificado este valor en un
animal con desnutricin, hemorragia severa o infeccin aguda?

108
CUESTIONARIO

BI OENERGETI CA

1. Cuando se incuba una solucin de glucosa 1-P con cantidades catalticas de fosfoglucomutasa,
la glucosa-1-P se transforma en glucosa 6-P hasta alcanzar el equilibrio segn la siguiente
reaccin:
PGM
Glucosa 1-P <>Glucosa 6-P

En el equilibrio: [Glucosa 1-P] =4,5 10
-3
M y [Glucosa 6-P] = 9,6 10
-2
M.

Calcule la Keq y AG' de esa reaccin a 25C y pH 7,0. Dato: R =2 cal/Kmol.

2. Las concentraciones celulares de sustratos y productos que intervienen en la fosforilacin de la
fructosa-6-fosfato catalizada por la enzima fosfofructoquinasa en tejido cardaco son las
siguientes:
Metabolito Concentracin (M)
Fructosa 6-fosfato 0,087 . 10
-3
Fructosa 1,6-bisfosfato 0,022 . 10
-3
ATP 11,52 . 10
-3
ADP 1,320 . 10
-3
PFK
(F-6-P +ATP > F 1,6-bisP +ADP)

Datos: AG'= -3,4 Kcal/ mol, 25C y R =2 cal/Kmol.

a) Calcular la constante de equilibrio de la reaccin.
b) Para las condiciones del problema, indicar en qu sentido se produce la reaccin.

3. La glucosa 1-P se convierte en fructosa 6-P en dos reacciones consecutivas.

Glucosa 1-P <> Glucosa 6-P AG
1
'= -1,0 Kcal/mol.
Glucosa 6-P <> Fructosa 6-P AG
2
'= 0,4 Kcal/mol.

a) Determinar el valor de AG' para la reaccin global.
b) Indicar si la reaccin global es exergnica o endergnica. Justifique.
c) Calcular la Keq de la reaccin global.

4. Para la reaccin: Fructosa 6-P <> Glucosa 6-P

Si la Keq =19,7 a 25C, pH 7,0 y R =2 cal/Kmol.

109
a) Calcule AG'
b) Calcule AG para [F 6-P] =1,5 . 10
-3
M y [G 6-P] =0,5 . 10
-3
M
c) Por qu son diferentes AG y AG'?

5. Calcular la variacin de la energa libre (AG) (pH 7,0 y 25C) para la hidrlisis del ATP a
ADP y Pi, suponiendo que el ATP y el ADP estn presentes en concentraciones
equimoleculares y que la concentracin de [Pi] es: a) 0,01 . 10
-3
M; b) 0,1 . 10
-3
M; c) 1 . 10
-3

M. Dato: AG'= -7,3 kcal/mol.

6. Cul debe ser la concentracin mnima de malato que debe hallarse presente para conseguir que
la reaccin de la fumarasa (malato <> fumarato +H
2
O) transcurra hacia la
derecha a 25C y pH 7,0 si el fumarato est presente en una concentracin 1. 10
-3
mM. Datos:
AG'~ 0 y R =2 cal/Kmol.

7. Dada la reaccin: ATP +H
2
O > ADP +Pi AG'= -7,3 Kcal/mol

a) Calcular la variacin de energa libre de la reaccin, sabiendo que las concentraciones
son: [ADP] =[Pi] =0,02 M y [ATP] =0,015 M a 25C y pH 7,0.
b) Indicar si la reaccin es exergnica.
c) Indicar si la reaccin es espontnea en las condiciones del problema.

110
CUESTIONARIO

ENZI MAS

1. Una enzima que cataliza la reaccin S >P se ensay con distintas concentraciones
de sustrato, obtenindose las siguientes velocidades iniciales:

Velocidad inicial (moles/min) Concentracin de sustrato (M)

0,150 0,20
0,200 0,40
0,275 0,85
0,315 1,25
0,340 1,70
0,350 2,00
0,360 4,00

a) Represente grficamente en papel milimetrado la velocidad inicial en funcin de la
concentracin de sustrato.
b) Halle grficamente Vmx y K
M
.
c) Represente grficamente 1/Vo en funcin de 1/[S] (dobles recprocas) y a partir del grfico y
calcule nuevamente Vmx y K
M
.

2. Dado los siguientes datos: [S] = 0,22 mM, Vo = 0,171 mmoles/min, Vmx = 0,640
mmoles/min. Calcule el K
M
de la enzima mediante la ecuacin de Michaelis-Menten.

3. Se han hecho investigaciones del efecto de pH sobre el valor de K
M
de la enzima 6-
fosfogluconato deshidrogenasa de hgado de rata. Empleando diferentes soluciones
reguladoras se trabaj a pH 7,6 y a pH 9,0. Para cada uno de los pH mencionados, se midi
la actividad de la enzima, siguiendo la velocidad de reduccin del NADP
+
a 340 nm y se
obtuvieron los siguientes resultados:
Enzima
6-P-Gluconato +NADP
+
>Ribulosa 5-P +NADPH +H
+

111

[S] (mM)

Velocidad inicial

(moles/hora)

pH 7,6

pH 9,0

0,18
0,30
0,54
1,60
4,0
5,0

0,050
0,063
0,084
0,114
0,116
0,116

0,034
0,047
0,075
0,128
0,167
0,168

Determine grficamente a que valor de pH la enzima tiene su mxima afinidad por el
sustrato.

4. Explique el comportamiento de las enzimas reguladoras:
a) Alostricas.
b) Por modificacin covalente.

5. a) En los grficos 1 y 2 cules son las variables que corresponden a los ejes de coordenadas?
Qu informacin obtiene de ellos?

112
b) En el grfico 3 qu curva corresponde a un modulador positivo y cul a uno negativo,
sabiendo que se trata de una enzima alostrica?

6. Cul de los efectos cinticos tiene un inhibidor enzimtico competitivo puro?
a) Aumenta K
M
sin afectar Vmx
b) Disminuye K
M
sin afectar Vmx
c) Aumenta Vmx sin afectar K
M

d) Disminuye Vmx sin afectar K
M

e) Disminuyen ambos

7. El salicilato inhibe la accin cataltica de la glutamato deshidrogenasa. Determine por anlisis
grfico si la inhibicin es competitiva o no competitiva.

[S] (mM)
Velocidad inicial (mmoles/minuto)

Sin inhibidor

Con inhibidor

15
20
30
40
80
100

0,20
0,21
0,28
0,33
0,37
0,40

0,081
0,097
0,120
0,130
0,160
0,185

113
8. En una reaccin enzimtica la velocidad de reaccin vara al agregar un inhibidor de acuerdo
a los siguientes datos:

[S] (mM)
Velocidad inicial (mmoles/minuto)

Sin inhibidor

Con inhibidor

1
2
3
4
5
10

17,8
25,4
38,4
45,4
50,0
62,5

3,3
6,3
9,0
11,8
14,5
24,4

Determine grficamente si se trata de un inhibidor competitivo o no competitivo (utilice
grfico de dobles recprocas).

9. Para aislar y purificar una enzima citoplasmtica, una vez obtenido el homogenato, se
someti a ste a centrifugacin a 100.000 g durante 60 minutos. El sobrenadante (Fraccin A)
fue precipitado al 40% de (NH
4
)
2
SO
4
, obtenindose de esta forma la Fraccin B que contiene
la enzima. En las tres fracciones, es decir, homogenato, Fraccin A y Fraccin B se
determinaron las unidades enzimticas (UE) y las protenas totales, obtenindose los
siguientes resultados.

Fraccin Enzimtica

UE

Prot. (mg)

AE

Rend.

Pureza

Homogenato

127.400

9.800

Fraccin A

112.500

7.500

Fraccin B

81.250

3.250

a) Logr purificar la enzima?
b) Qu rendimiento obtuvo?

10. Se desea purificar una enzima contenida en un homogenato que tiene 150.000 UE/ml. Si se
pretende que el rendimiento del proceso no sea menor de 60%, indique hasta que nmero de
UE/ml puede descender la concentracin de enzima durante la purificacin.

114
11. En un proceso de purificacin enzimtica, se obtuvieron los siguientes resultados.

Fracc. Enz.

UE

Prot. (mg)

AE

Rendimiento

Pureza

Homogenato

100.000

10

Fraccin A

90.000

1.500

Fraccin B

29

2000

a) Complete el cuadro.
b) Indique si hubo purificacin. J ustifique su respuesta.

12. Una preparacin enzimtica que contiene 1,5 10
-2
g de protena produce 0,016 moles de
producto en 4 minutos. Calcule las unidades enzimticas y la actividad especfica.

115
CUESTIONARIO

DI GESTI ON Y METABOLI SMO
DE HI DRATOS DE CARBONO I

1. Por qu es necesario digerir los principios nutritivos principales (hidratos de carbono, lpidos
y protenas) antes de que puedan ser utilizados por los tejidos?

2. Explique la diferencia que hay entre procesos digestivos y metablicos. Ejemplifique.

3. Mencione las enzimas digestivas de los hidratos de carbono.

4. Describa los diferentes mecanismos de transporte de la glucosa a la clula en los distintos
tejidos.

5. Indique qu tipo de va metablica es la glucolisis y en qu tejidos se produce.
Explique la importancia funcional de la va en msculo esqueltico, tejido adiposo y
eritrocitos.

6. Cules son las semejanzas y diferencias entre las enzimas glucoquinasa y hexoquinasa?

7. Cules son las etapas de la glucolisis?

8. Cules son las reacciones claves de la gluclisis?. Mencione las enzimas reguladoras, tipo de
regulacin de cada una y sus efectores alostricos positivos y negativos.

9. Qu funcin cumple la Fosfofructoquinasa II?

10. Por qu el NAD es el factor limitante de la va glucoltica?

11. Escriba con frmulas la reaccin de oxidacin fosforilante que ocurre en glucolisis. Explique
la importancia de la relacin NAD
+
/NADH+H
+
.

12. Establezca si hay prdida o ganancia de ATP cuando se pasa de F 6-P >PEP.
Justifique su respuesta escribiendo las reacciones en las que se intercambian molculas de alta
energa.

13. Explique el significado de fosforilacin a nivel del sustrato, su importancia e indique en
qu reacciones de la gluclisis se lleva a cabo este proceso.

fosfofructoquinasa I

14. Dada la reaccin Fructosa 6-P +ATP >Fructosa 1,6-bis P +ADP.

116
Explique cmo y por qu en esta reaccin el ATP puede actuar como sustrato y como efector
negativo.

15. Qu destinos posibles tiene el piruvato formado en la gluclisis? Cul es el balance
energtico de la va?

16. Qu importancia metablica tiene la fermentacin lctica? Escriba la reaccin que permite
reoxidar la coenzima en estas condiciones.

117
CUESTIONARIO

METABOLI SMO DE HI DRATOS DE CARBONO I I

1. Cul es el objetivo de la gluconeognesis?

2. Qu condiciones metablicas son necesarias para que ocurra el proceso de gluconeognesis
y en qu tejidos ocurre?

3. Mencione precursores de esta va de sntesis, indique su procedencia y a que nivel de la va
gluconeognica ingresan.

4. De qu forma afecta al msculo la acumulacin de lactato y cul es el proceso que permite
su eliminacin y reutilizacin por el hgado?

5. Escriba las reacciones que permiten a la clula sintetizar PEP a partir de piruvato. Cul es la
ubicacin celular de las enzimas y qu cofactores intervienen?

6. Cules son las enzimas claves de la va? Indique su regulacin y efectores alostricos
positivos y negativos en los casos que corresponda.

7. Explique la regulacin de la actividad de la Enzima Bifuncional (Fosfofructoquinasa II para
gluclisis y Fructosa 2,6-bisfosfatasa para gluconeognesis) y el rol de la Fructosa 2,6-
bisfosfato como nexo regulador de ambas vas.

8. Cuntas molculas de ATP se requieren para la sntesis de un residuo de D-glucosa a partir
de piruvato? En qu reacciones se utilizan?

9. Cul es el objetivo funcional de la va de las pentosas, ya que en ella no se produce ni se
gasta ATP? Mencione las 3 fases de la va.

10. En qu tejidos est activa la va? Mencione la localizacin celular de las enzimas.

11. Mencione cmo se regulan las deshidrogenasas de la 1ra. fase de la va.

12. El msculo no posee gran actividad de las deshidrogenasas, sin embargo necesita sintetizar
pentosas para obtener nucletidos y cidos nucleicos. Cmo logra ese objetivo?

118
CUESTI ONARI O

METABOLI SMO DE HI DRATOS DE CARBONO I I I

1. a) Escriba las ecuaciones correspondientes a la entrada de fructosa a la va glucoltica en el
hgado.
b) Qu otra va alternativa existe en espermatozoides?

2. a) Qu es un nucletido azcar?
b) Escriba la ecuacin fundamental de los nucletido azcares.

3. a) Describa el metabolismo de la galactosa.
b) Qu es la galactosemia?

4. Cul es el polisacrido de reserva en los vegetales? Describa su estructura qumica Cul es
el polisacrido de reserva en los animales? Describa su estructura qumica.

5. a) Describa el proceso de glucogenolisis, enzimas involucradas, localizacin celular y tejidos
en que se produce la va.
b) Cul es la enzima regulable y cules son los productos obtenidos?
c) Cul es el beneficio, desde el punto de vista energtico, de la fosforlisis en la
degradacin de glucgeno?

6. Cul es la importancia funcional del glucgeno en el hgado y en el msculo? Indique el
destino de sus productos finales respectivamente.

7. Indique las diferencias entre la fosforilasa heptica y la isoenzima que se encuentra en
msculo.

8. Esquematice sin frmulas las reacciones necesarias para incorporar un residuo de D-glucosa
al glucgeno, indicando las enzimas correspondientes y su localizacin celular.

9. a) Cul es la enzima reguladora de la glucogenognesis y qu caractersticas tiene dicha
enzima respecto de su actividad cataltica?
Describa su mecanismo de regulacin en hgado y en msculo.

10. Cul es el balance energtico de la incorporacin de una molcula de glucosa al glucgeno?

11. Escriba las ecuaciones correspondientes a la formacin de glucgeno a partir de galactosa.

12. En los sujetos galactosmicos, falta la enzima galactosa 1-P uridntransferasa. El metabolismo
de galactosa est bloqueado y su ingestin produce trastornos graves. Si se elimina la
galactosa de la dieta y se la reemplaza por glucosa, estos sujetos se normalizan e inclusive

119
sintetizan galactolpidos. Por qu caminos se puede sintetizar la galactosa necesaria, ya que
el precursor de los galactolpidos es UDP-galactosa? Detalle las reacciones involucradas.

13. Escriba la ecuacin de sntesis de lactosa en glndula mamaria.

14. Describa la situacin metablica que se produce en el msculo, para un equino entrenado:
a) Durante una carrera corta.
b) En la fase de recuperacin.

120
CUESTIONARIO

RESPI RACI ON CELULAR I

1. Escriba la reaccin de descarboxilacin oxidativa del piruvato, indicando su ubicacin
celular, composicin del complejo de la Piruvato Deshidrogenasa, su regulacin e
importancia de la irreversibilidad de la reaccin.

2. Explique por qu el Ciclo de Krebs es considerado como una va anfiblica.

3. a) Cules son las enzimas reguladoras del ciclo de Krebs?
b) Mencione sus efectores y destaque la enzima reguladora principal de dicha va
.
4. Si el Ciclo de Krebs se haya frenado por una alta concentracin de ATP, mencione los
metabolitos del mismo que pueden utilizarse para vas de sntesis e indique qu productos se
obtienen de cada uno de ellos.

5. Cuntas molculas de ATP se obtienen cuando cada uno de los sustratos enumerados se
oxida hasta CO
2
+H
2
O?
a) PEP
b) Piruvato
c) Glucosa
Se suponen activas las mitocondrias. J ustificar cada respuesta con las ecuaciones
correspondientes.

6. A un homogenato de hgado de mamfero se lo somete a una centrifugacin diferencial a
100.000g y se obtiene una fraccin particulada (f.p.) y un sobrenadante (s). Se coloca cada
fraccin en tubos rotulados f.p., s , f.p.+s.

TUBO N
O

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10
Fraccin
Incubada
f.p. f.p. s s f.p.+s f.p.+s f.p. f.p. s s
Sustrato
Utilizado
gluc. gluc gluc gluc gluc gluc piruv. piruv. piruv. piruv.
Condiciones
de incubacin
aerob. anaerob aerob anaerob aerob. anaerob aerob. anaerob aerob. anaerob
Rendimiento
en ATP

Complete el cuadro indicando el nmero de moles de ATP formados en cada caso. J ustifique

121
7. Qu son las reacciones anaplerticas? Escriba la principal reaccin anaplertica del ciclo de
Krebs.

8. Por qu mecanismos se reoxida el NADH+H
+
citoslico producido en glucolisis en
presencia de oxgeno?

122
CUESTIONARIO

RESPI RACI ON CELULAR I I

1. El ciclo de Krebs no utiliza O
2
pero depende de l. Explique por qu es necesario el O
2
para
el funcionamiento del ciclo.

2. Mediante una tabla consigne el estado de xido-reduccin de los transportadores de la cadena
respiratoria mitocondrial:
a) En presencia de CO o CN
-

b) En presencia de antimicina.
c) En presencia de barbitricos.

3. Cul es el nico citocromo capaz de reaccionar directamente con el oxgeno? Justifique.

4. Qu tipo de inhibidor debe agregarse a una suspensin de mitocondrias para que stas
puedan:
a) Consumir O
2
pero no sintetizar ATP.
b) No consumir O
2
ni sintetizar ATP.
c) Disminuir el consumo de O
2
y no sintetizar ATP.
Justifique cada respuesta.

5. Defina control respiratorio y explique su importancia en el funcionamiento de la cadena
respiratoria mitocondrial.

6. Esquematice los grficos de consumo de O
2
(especifique que parmetro se representa en cada
eje) considerando los siguientes casos:

CASO I:
Hasta 2 minutos estado de reposo (estado 4)
A los 2 minutos agregado de ADP
A los 3 minutos agregado de dinitrofenol
A los 4 mintuos agregado de antimicina

CASO II:
Hasta 2 minutos estado de reposo (estado 4)
A los 2 minutos agregado de ADP
A los 3 minutos agregado de oligomicina
A los 4 mintuos agregado de ADP
A los 5 minutos agregado de dinitrofenol

121
CUESTIONARIO

ASPECTOS GENETI COS DEL METABOLI SMO

1. Escriba la reaccin catalizada por la fosforribosilpirofosfato sintetasa, enzima involucrada en
la sntesis de nucletidos. De que va metablica proviene el sustrato de la reaccin?

2. En qu fase del ciclo celular se produce la replicacin del ADN?

3. Mencione las enzimas que participan en el proceso de replicacin del ADN en procariotes e
indique su funcin.

4. Indique las diferencias que existen en la replicacin del ADN en clulas de eucariotes
respecto de las clulas de procariotes.

5. Indique las 4 etapas del proceso de transcripcin en procariotes y enzimas que intervienen en
el mismo. Qu diferencias existen con las clulas de eucariotes?

6. Explique por qu el ARNm inmaduro en clulas de eucariotes no puede ser utilizado para
sintetizar protenas.

7. Cul es la estructura del ARNt y qu funciones cumplen las diferentes zonas que conforman
la molcula?

8. Qu son los ribosomas y cul es su composicin qumica?

9. Indique las 5 etapas del proceso de biosntesis de protenas en procariotes. Qu diferencias
existen con las clulas de eucariotes?

10. Escriba la ecuacin de activacin de un aminocido para la formacin del aminoacil-ARNt.

11. a) Cmo es leda la informacin del ARNm para la sntesis de protenas?
b) Explique si existe superposicin de bases en la lectura.

12. Se hizo una experiencia in vitro para sintetizar una determinada protena utilizando los
siguientes componentes: ARNt de levadura, ribosomas de reticulocitos de conejo y ARNm de
hepatocitos de tiburn. A qu especie pertenece la protena sintetizada? Justifique.

13. Qu significa que el cdigo gentico sea universal?

14. Qu son las modificaciones postraduccionales y qu funcin tienen?

122
15. El agregado de un compuesto a un cultivo de bacterias produce la sntesis de dos nuevas
protenas. Explique el mecanismo de regulacin gnica que permite este proceso.

16. Explique el mecanismo de regulacin de la expresin gnica en eucariotes a nivel de los sitios
promotores, potenciadores y silenciadores.

17. Cules son los productos finales de la degradacin de los cidos nucleicos? Mencione las
diferencias entre especies.

123
CUESTIONARIO

HORMONAS

1. a) Qu es una hormona?
b) Cmo se clasifican segn su estructura qumica?

2. Explique la formacin del complejo Hormona-Receptor y su cintica.

3. Cules son los sistemas de secrecin hormonal?

4. Qu funcin cumple?
a) El hipotlamo
b) La adenohipfisis
c) La neurohipfisis

5. Explique la relacin que existe entre el mecanismo de accin de una hormona y la velocidad
de su respuesta en la clula.

6. Explique detalladamente los mecanismos de accin para las hormonas que tengan receptor en
la membrana celular, segn estn asociados a Protena Gs, Protena Gi, Protena Gq.

7. En el mecanismo de amplificacin en cascada producido por activacin hormonal asociado a
Protena Gs indique:
a) Cul es el significado de accin amplificada?
b) A qu se llama mensajero intracelular y por qu?
c) A partir de la activacin inespecfica de una proteinquinasa, explique cul es el proceso
qumico que implica modificacin covalente y activacin o inhibicin de diferentes
enzimas.

8. Explique el mecanismo de accin para el caso de una hormona que tenga su receptor en
citoplasma. De Ejemplos.

9. Explique el mecanismo de accin para el caso de una hormona que tenga su receptor en
ncleo. De Ejemplos.

10. Describa la estructura qumica, ubicacin celular y tisular del receptor de insulina. Explique
su mecanismo de activacin.

11. Explique los diferentes mecanismos de accin de la insulina.

124
CUESTIONARIO

REGULACI ON HORMONAL DEL METABOLI SMO
DE LOS HI DRATOS DE CARBONO

1. Defina glucemia y su importancia como constante del medio interno.

2. Establezca las diferencias entre mamferos monogstricos y poligstricos en cuanto al nivel
de la glucemia.

3. Indique:
a) Las vas que aportan glucosa a la sangre.
b) Las vas que disminuyen la concentracin de glucosa en sangre.

4. a) Cul es el sistema hormonal hipoglucemiante?
b) Cul es el sistema hormonal hiperglucemiante?

5. a) Cul es el par fisiolgico hormonal que regula la glucemia?
b) Cul es el sistema hormonal que acta en hipoglucemia crtica?

6. a) Cul es la enzima de la gluconeognesis directamente involucrada en la salida de glucosa
a la sangre?
b) En qu tejido/s aparece actividad de gluconeognesis?

7. Describa:
a) Las acciones del glucagn y la adrenalina sobre el metabolismo de hidratos de carbono a
nivel heptico. Explique el mecanismo de accin.
b) Las acciones de la adrenalina sobre el metabolismo de hidratos de carbono a nivel muscular.
Explique el mecanismo de accin.

8. a) Mencione las acciones de la insulina sobre el metabolismo de hidratos de carbono
(explicando los mecanismos de accin).
b) Mencione las acciones de la insulina a nivel del tejido adiposo.
c) Integre las diferentes acciones y justifique el resultado final de disminucin de la glucemia.

9. Explique los efectos que ejercen los glucocorticoides a nivel heptico y extraheptico.

10. Por qu se habla de accin lenta o de refuerzo en el caso de los glucocorticoides?

125
CUESTIONARIO

DI GESTI ON Y METABOLI SMO DE LI PI DOS I

1. Explique cmo y en qu parte del aparato digestivo se produce la digestin de los lpidos
de la dieta.

2. De los componentes que contiene la dieta, por qu los lpidos son los nicos que no
pasan a la circulacin porta-heptica?

3. La Acil-CoA sintetasa cataliza una reaccin reversible:
cido graso +ATP +CoA Acil-CoA +AMP +PPi
De qu modo puede favorecerse la formacin de Acil- CoA?

4. Explique cmo ingresan los cidos grasos a la mitocondria.

5. Explique el mecanismo por el cual se reoxidan las coenzimas que se reducen en la |-
oxidacin.

6. Calcular el nmero de enlaces de alta energa que se forman en la degradacin del
palmitato (cido graso saturado de 16 tomos de carbono) hasta:
a) AcetilCoA
b) CO2 y H2O

7. Cmo se halla regulada la |-oxidacin de cidos grasos?

8. Explique los pasos metablicos por los cuales la clula logra obtener Acetil-CoA en el
citosol para la sntesis de novo de cidos grasos.

9. a) Cul es la enzima reguladora de la sntesis de cidos grasos?
b) Escriba la reaccin que cataliza y mencione su tipo de regulacin.

10. Cul es la funcin de la descarboxilacin en la sntesis de cidos grasos?

11. La biosntesis de cido palmitoleico (cido graso insaturado de 16 tomos de carbono con
una doble ligadura entre C
9
y C
10
) utiliza como precursor al cido palmtico (cido graso
saturado de 16 tomos de carbono). Puede realizarse esta sntesis en condiciones
anaerbicas estrictas? Justifique.

12. a) Cmo sintetiza el tejido adiposo los lpidos de depsito?
b) De dnde proviene el glicerol activado?

126
13. Cuntos fosfatos de alta energa se necesitarn para la sntesis de un triacilglicrido en
tejido heptico partiendo de glicerol y cidos grasos libres?

14. Comparar los siguientes aspectos entre la |-oxidacin y la sntesis de los cidos grasos:
a) Lugar de la clula donde ocurren los procesos.
b) Transportador de los acilos.
c) Reductores y oxidantes.

15. Respecto a la biosntesis de colesterol indique la ubicacin celular de la va, la enzima
reguladora y el tipo de regulacin.

127
CUESTIONARIO

METABOLI SMO DE LI PI DOS I I

1. Respecto a las lipoprotenas plasmticas mencione:
a) Tipos de lipoprotenas.
b) Origen.
c) Lpido predominante.
d) Funcin.

2. Indique las funciones de las siguientes apo-protenas y a qu lipoprotenas pertenecen:
a) Apo C-II
b) Apo A-I
c) Apo B-100
d) Apo E

3. Mencione cules son las principales diferencias entre los mamferos HDL y los LDL.

4. Qu otro tipo de lpido puede hallarse en sangre? Cmo se transportan?

5. Respecto a la LIPOLISIS mencione:
a) Situaciones nutricionales en que est activa
b) Efectos del par fisiolgico insulina-glucagn sobre la misma.

6. Respecto a la LIPOGENESIS mencione:
a) Situaciones nutricionales en que est activa.
b) Efectos del par fisiolgico insulina-glucagn sobre la misma.

7. Mencione cules son los efectos de la adrenalina sobre el metabolismo de los lpidos,
indicando las enzimas involucradas.

8. Mencione cules son los efectos de los glucocorticoides sobre el metabolismo de los
lpidos, indicando las enzimas involucradas.

9. Respecto a los cuerpos cetnicos indique:
a) Situacin metablica en que se favorece su sntesis y tejidos donde sucede.
b) Secuencia de reacciones de degradacin de los mismos y tejidos que la realizan.
c) Por qu el exceso de acetilos provenientes de la |-oxidacin de cidos grasos no puede
acumularse en forma de Acetil-CoA.

10. Explique las relaciones metablicas existentes entre la disminucin de la glucemia y la
liplisis en monogstricos.

128
11. Explique las relaciones metablicas existentes entre el aumento de la glucemia y la
lipognesis en animales monogstricos.

129
CUESTIONARIO

DI GESTI ON DE PROTEI NAS Y
METABOLI SMO DE AMI NOACI DOS

1. Describa la digestin de protenas en el estmago de un animal monogstrico. Explique las
funciones del HCl y las enzimas proteolticas.

2. Clasifique las enzimas gstricas, pancreticas e intestinales segn el sitio de accin sobre los
diferentes sustratos e indique si son especficas para algn tipo de aminocido.

3. Describa el mecanismo de absorcin de los aminocidos a nivel intestinal.

4. Se observ que suministrando glucosa marcada con C
14
en posicin 6 a un animal
monogstrico, apareca alanina marcada con C
14
en posicin 3. Escriba las secuencias
metablicas que expliquen esta incorporacin.

5. Escriba la reaccin ms importante de desaminacin oxidativa e indique compartimento
celular y tejidos donde se realiza. Explique su regulacin en el sentido anablico y catablico.

6. Cite la secuencia de reacciones a travs de las cuales se cataboliza la alanina hasta urea y CO
2

+H
2
O. Qu camino alternativo puede ser propuesto para el caso en que el aminocido sea
aspartato?

7. Cite la secuencia metablica que explica el carcter glucognico de la glutamina.

8. Cules son los principales aminocidos encargados de transportar el grupo amino en sangre?
Indique tejidos de origen y destino final.

9. En que se basa la diferencia entre aminocidos glucognicos, cetognicos y mixtos? De
ejemplos.

10. Cules son los aminocidos esenciales? Por qu se los denomina de esa forma?

11. Mencione 3 aminocidos glucognicos e indique de qu producto metablico son precursores,
en qu reaccin se encuentran dichos productos y su va metablica.

130
CUESTIONARIO

DI GESTI ON Y METABOLI SMO EN POLI GASTRI COS

1. Caracterice a los microorganismos ruminales.

2. Describa las caractersticas del medio ambiente ruminal, indicando el pH, potencial de xido-
reduccin y temperatura.

3. Explique la regulacin del pH ruminal. Mencione cada uno de los factores que influyen en
dicha regulacin.

4. Mencione y caracterice a los hidratos de carbono, protenas y lpidos presentes en la
alimentacin habitual de los rumiantes.

5. Explique cmo se degradan los polisacridos por accin de los microorganismos del rumen

6. Mencione los productos finales de la degradacin de los hidratos de carbono ingeridos e
indique a qu nivel se absorben.

7. Explique el mecanismo de reoxidacin de las coenzimas en las fermentaciones actica,
propinica y butrica.

8. a) Por qu la fermentacin actica no se considera una verdadera fermentacin?
b) A qu proceso debe necesariamente acoplarse?
c) Quines lo realizan?

9. Mencione los distintos tipos de lpidos que integran la dieta del rumiante y explique su
degradacin en el rumen.
a) Qu transformaciones sufren los cidos grasos provenientes de la dieta?
b) Qu caractersticas tienen los cidos grasos sintetizados por los microorganismos?
c) A qu nivel se absorben los distintos cidos grasos de alto peso molecular?
d) Qu caractersticas tienen los cidos grasos de la grasa de depsito de los poligstricos a
diferencia de los monogstricos?

10. a) De qu manera son degradadas las protenas de origen vegetal por accin de las enzimas
de los microorganismos?
b) Cmo se sintetizan las protenas de los microorganismos y qu caractersticas tienen?

11. Describa el ciclo rumino-hepato-salival. Mencione las ventajas para el animal rumiante y para
los microorganismos ruminales.

131
12. Compare el metabolismo intermedio en lo referente a sntesis de triacilglicridos entre
monogstricos y poligstricos.

13. De qu manera son utilizados cada uno de los cidos grasos voltiles por el animal
rumiante?: a) Cuando ste necesita energa. b) Cuando ste no necesita energa.

14. De qu depende que el acetato de origen ruminal derive a la produccin de grasa corporal o
de leche?

15. Por qu el valor de la glucemia en los rumiantes es aproximadamente la mitad comparada
con los monogstricos?

16. Por qu la gluconeognesis es fundamental en rumiantes? Cules son sus precursores?

17. Cmo es normalmente el valor de la cetonemia de los poligstricos comparados con el de los
monogstricos? A qu se debe esta diferencia?

132
CUESTIONARIO

FOTOSI NTESI S

1. Explique que funcin tiene la fotosntesis en plantas superiores. Escriba la ecuacin general y
explique la funcin de cada uno de los reactantes.

2. a) Cules son los principales pigmentos fotosintticos? Qu funcin cumplen los mismos?
b) Cmo es captada la energa luminosa y cmo es transmitida por los pigmentos
mencionados?

3. a) Qu son los fotosistemas I y II?
b) Establezca las diferencias existentes entre el sistema pigmentario P700 y P680.

4. a) Describa el flujo electrnico no cclico de la etapa luminosa.Qu productos se obtienen?
b) De acuerdo con el potencial de reduccin que tiene el P700 (+0.43v), por qu puede ceder
el electrn a un aceptor que tiene un potencial negativo (-0.55v)?

5. a) Describa el flujo electrnico cclico de la etapa luminosa.
b) Qu productos se obtienen en la misma?

6. En qu lugar del cloroplasto y en qu condiciones se produce el proceso de
fotofosforilacin?

7. Explique cmo se produce la energa para la sntesis de ATP (Teora de Mitchell).

8. a) Qu es la etapa oscura de la fotosntesis?
b) Cul es el primer producto de fijacin de CO
2
en plantas de C
3
?
c) Cul es la enzima fundamental que regula la velocidad del ciclo de Calvin? Cul es el
efector positivo?

9. a) Cul es el primer producto de fijacin del CO
2
en plantas de C
4
?
b) Qu enzima interviene?
c) Explique diferencias con la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa.

10. Qu es la fotorespiracin? En qu tipo de plantas superiores se produce?

11. Cules son las hexosas sintetizadas a partir del gliceraldehido 3-P, producto del ciclo de
Calvin? Cules son los principales disacridos y polisacridos producidos en las hojas a
partir de dichas hexosas y la funcin de cada uno de ellos en el vegetal?

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