Quim. Nova, Vol. 33, No.

6, 1285-1290, 2010 VALIDAO DE METODOLOGIA ANALTICA PARA DETERMINAO DE MERCRIO TOTAL EM AMOSTRAS DE URINA POR ESPECTROMETRIA DE ABSORO ATMICA COM GERAO DE VAPOR FRIO (CV-AAS). ESTUDO DE CASO Sabine Neusatz Guilhen, Maria Aparecida Faustino Pires e Elizabeth Sonoda Keiko Dantas* Centro de Qumica e Meio Ambiente, Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares, Universidade de So Paulo, Av. Lineu Prestes, 2242, 05508-000 So Paulo - SP, Brasil Fernanda Villibor Xavier Fundao de Medicina Tropical do Tocantins, Av. Dionsio Farias, 838, 77814-350 Araguana TO, Brasil Recebido em 31/8/09; aceito em 1/2/10; publicado na web em 3/5/10

VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD FOR THE DETERMINATION OF TOTAL MERCURY IN URINE SAMPLES USING COLD VAPOR ATOMIC ABSORPTION SPECTROMETRY (CV-AAS). CASE STUDY. Mercury is a toxic metal used in a variety of substances over the course history. One of its more dubious uses is in dental amalgam restorations. It is possible to measure very small concentrations of this metal in the urine of exposed subjects by the cold vapor atomic absorption technique. The present work features the validation as an essential tool to confirm the suitability of the analytical method chosen to accomplish such determination. An initial analysis will be carried out in order to evaluate the environmental and occupational levels of exposure to mercury in 39 members of the auxiliary dental staff at public consulting rooms in the city of Araguana (TO). Keywords: validation; mercury amalgam; CV-AAS.

INTRODUO O mercrio um metal txico empregado em uma variedade de produtos e processos. Ocorre naturalmente no ambiente e existe sob as formas metlica ou elementar, inorgnica e orgnica. O mercrio elementar um metal lquido temperatura ambiente, inodoro, de cor prateada e aparncia brilhante. Com a exceo dos gases nobres, o nico elemento cujo vapor monoatmico temperatura ambiente.1 O vapor de mercrio facilmente absorvido pelo corpo devido a sua lipossolubilidade, mas seu tempo de vida bastante limitado por ser rapidamente oxidado de mercrio elementar (Hg0) a mercrio mercrico (Hg2+). O on Hg2+ liga-se a grupamentos sulfidrila (-SH) e seleno-hidrila (-SeH) de protenas e enzimas. Alguns complexos Hg-SH so capazes de mimetizar molculas endgenas dos stios de ligao de protenas na membrana plasmtica e de stios de ligao de protenas e enzimas intracelulares.2 O mercrio elementar (Hg0) solvel em gorduras (lipossolvel), o que lhe permite atravessar membranas celulares e ser absorvido pelo organismo. A absoro ocorre principalmente pelas vias respiratria e digestiva. A primeira , indubitavelmente, a mais importante via de introduo no organismo para o vapor de mercrio elementar, pois este absorvido do ar e se difunde rapidamente atravs da membrana alvolocapilar, passando para o sangue e estabelecendo-se nos eritrcitos.1,3 Segundo a Organizao Mundial da Sade,4 o teor de mercrio total urinrio considerado normal (pessoas no expostas) de at 4 g L-1. No Brasil, a Norma Regulamentadora 7 (NR-7),5,6 que dispe sobre os parmetros do controle biolgico da exposio ocupacional a agentes qumicos, prope a utilizao do mercrio urinrio total como indicador biolgico da exposio (IBE) de trabalhadores ao mercrio e seus compostos. Estabelece ainda o valor de 50 g L-1 como ndice biolgico mximo permitido de mercrio total urinrio e 10 g L-1 como valor de referncia indicando normalidade. Uma aplicao um tanto polmica do mercrio no amlgama dental, uma liga composta de mercrio (Hg0), prata (Ag0), estanho
*e-mail: esdantas@ipen.br

(Sn0), cobre (Cu0) e, possivelmente, outros elementos metlicos como o zinco (Zn0).7 crescente a preocupao com os riscos sade decorrentes da exposio ao vapor de mercrio liberado na preparao do amlgama dental em consultrios odontolgicos.8 Entretanto, existem poucas evidncias para sustentar ou refutar inteiramente tais alegaes. Recentemente, a Fundao de Medicina Tropical do Tocantins iniciou um estudo para avaliar os nveis de exposio ambiental e ocupacional ao mercrio no atendimento odontolgico de consultrios pblicos de Araguana. Em colaborao com este estudo, o Laboratrio de Anlises Qumicas e Ambiental do Centro de Qumica e Meio Ambiente do Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares (IPEN) se responsabilizou pela realizao das anlises das amostras de urina dos indivduos expostos quanto ao teor de mercrio total por espectrometria de absoro atmica com vapor frio (CV-AAS). Para tanto, foi necessrio primeiramente definir uma metodologia analtica adequada e valid-la para garantir a qualidade dos resultados. Neste contexto, portanto, este estudo representa uma etapa prvia s anlises propriamente ditas e tem por objetivo validar a metodologia analtica a ser empregada na determinao de mercrio total em amostras de urina por CV-AAS. O desempenho da metodologia analtica foi testado quanto aos seguintes parmetros: limite de deteco e limite de quantificao, seletividade, linearidade, exatido e preciso. Os ensaios foram realizados com material de referncia certificado, o que assegura a rastreabilidade dos resultados. PARTE EXPERIMENTAL Na literatura, possvel encontrar variadas metodologias para determinao de mercrio total em urina.9-12 A metodologia analtica foi selecionada da literatura com base na estrutura do laboratrio analtico e dos recursos disposio do analista. A metodologia adotada foi descrita por Lopez-Colon e Lozano10 e consiste na determinao de mercrio total em amostras de urina por espectrometria de absoro atmica com gerao de vapor frio.

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Materiais Tubos de polipropileno de 15 mL (120 x 17 mm) da Sarstedt, micro e macropipetas automticas Wheaton Socorex Calibra, bqueres e bales volumtricos foram utilizados na preparao dos reagentes. Reagentes Os reagentes utilizados foram: material de referncia certificado (MRC) de mercrio em gua (SRM 1641d; 1,590 0,018 mg kg-1) e de elementos txicos em urina liofilizada (SRM 2670a; 95,1 0,98 g L1), ambos do National Institute of Standards and Technology (NIST, Gaithersburg, MD, USA), Triton X-100 (C33H60O10,5) p.a. da Merck, dicromato de potssio (K2Cr2O7) da CAAL Reagentes Analticos, cido ntrico 65% (HNO3) p.a. da Merck, cido sulfrico 95-97% (H2SO4) p.a. da Merck, permanganato de potssio (KMnO4) p.a. da Merck, boro-hidreto de sdio (NaBH4) p.a. da Merck, cido clordrico 37% (HCl) p.a. da Merck, hidroxilamina clordrica (NH2OH.HCl) p.a. da Nuclear, hidrxido de sdio (NaOH) p.a. da Merck e uma soluo padro de mercrio em HNO3 5% (1000 mg L1) da Merck. Equipamentos Utilizou-se um espectrmetro de absoro atmica PerkinElmer AAnalyst 800 acoplado a um sistema PerkinElmer de injeo em fluxo FIAS 400, cujas condies de operao esto descritas na Tabela 1, uma balana Gehaka BG400 e uma estufa da tica.
Tabela 1. Condies operacionais para a anlise de Hg por CV-AAS Variveis Tempo de integrao (s) Lmpada Comprimento de onda (nm) Slit (nm) Temperatura da clula (C) Etapa Velocidade da bomba Prefill 1 2 Condies de operao 20 EDL de Hg 253,7 0,7 100 Tempo Bomba 1 Bomba 2 Vlvula (s) (U min-1) (U min-1) 15 10 15 100 100 0 120 120 120 Fill Fill Inject

Digesto da amostra de urina A um tubo de polipropileno com capacidade para 15 mL foram adicionados: 1 mL de urina, 0,5 mL de soluo de Triton X-100 0,2% (v/v), 0,1 mL de soluo estabilizadora K2Cr2O7 0,5% em HNO3 50% (m/v), 1 mL de HNO3 e 2 mL de H2SO4. A mistura foi ento aquecida com o tubo fechado temperatura constante de 60 C, pelo perodo de 12 h (overnight), para digesto da amostra. As perdas de mercrio foram evitadas ao mximo por meio da adio de dicromato de potssio e Triton. A soluo de dicromato de potssio em meio cido oxida o mercrio, mantendo-o em soluo na forma de ons Hg2+. A soluo de Triton adicionada previne perdas devido ao bacteriana. A urina uma amostra biolgica e, portanto, sujeita ao de bactrias que convertem os compostos de mercrio solveis em compostos volteis de mercrio. Ambos os reagentes, portanto, evitam perdas por vaporizao. Alm disso, o aquecimento foi feito em tubo fechado, o que dificulta ainda mais as perdas por vaporizao. Oxidao com KMnO4 Aps a digesto, a soluo deve ser retirada da estufa e deixada temperatura ambiente para esfriar e, em seguida, KMnO4 5% (m/v) deve ser adicionado em quantidade suficiente para que a soluo adquira uma cor prpura, indicando o excesso do oxidante em soluo. Se a cor da soluo persistir por cerca de 15 min, significa que o KMnO4 est em excesso, o que garantir a completa oxidao de todos ons de mercrio em soluo a Hg2+. A reao de oxidao do mercrio elementar (Hg0) a mercrio mercrico (Hg2+) ou mercrio (II) pelo KMnO4 mostrada na Equao 1. 3Hg(aq) + 2KMnO4(aq) + H2O(l) 3HgO(aq) + 2MnO2(aq) + 2KOH(aq) (1) A reao de oxidao do on mercuroso (Hg22+) ou mercrio (I) ao on Hg2+ pelo KMnO4 mostrada na Equao 2. 3Hg 2 O (aq) + 2KMnO 4(aq) + H 2 O (l) 6HgO (aq) + 2MnO 2(aq) + 2KOH(aq) (2) Aps 1 h em repouso, adicionam-se 15 L de hidroxilamina colordrica 10% (m/v) para reduzir o excesso de permanganato em soluo. A soluo ento readquire seu aspecto inicial (incolor). Por fim, a soluo diluda a um volume final de 10 mL com soluo diluente. Reduo com NaBH4 A soluo contendo ons Hg2+ introduzida por injeo em fluxo e direcionada ao compartimento de reao, onde ser reduzida a Hg0 pela soluo redutora de boro-hidreto de sdio (m/v) e uma soluo carregadora de cido clordrico 3% (v/v). A reao entre o NaBH4 e o HCl gera os seguintes produtos: NaBH4(aq) + 3H2O(l) + HCl(aq) H3BO3(aq) + NaCl(aq) + 8H*(aq) (3)

Solues As solues utilizadas foram: Triton X-100 0,2% (v/v); HNO3 50% (v/v); K2Cr2O7 0,5% (m/v); KMnO4 5% (m/v); soluo redutora NaBH4 0,2% e NaOH 0,05% (m/v); HCl 3% (v/v); NH2OH.HCl 10% (m/v); soluo diluente HNO3 10% e H2SO4 20% (v/v); e soluo estoque de 500 g L-1 de Hg (v/v), preparada a partir de uma soluo padro de mercrio em HNO3 5% (1000 mg L1) da Merck. A gua utilizada no preparo das solues foi do tipo ultrapura destilada 18,3 M cm1. Etapa experimental O procedimento analtico pode ser dividido em trs etapas distintas: digesto, oxidao com permanganato de potssio (KMnO4) e reduo com boro-hidreto de sdio (NaBH4). A execuo cuidadosa de cada uma destas etapas determina a qualidade dos resultados obtidos no processo como um todo.

A espcie H* gerada reduz os ons Hg2+ na soluo da amostra: nHg2+(aq) + H*(aq)(excesso) nHg0(g) + H2(g)(excesso) (4)

O vapor de Hg0 ento conduzido por um gs de arraste (argnio, Ar) para o compartimento da amostra, posicionado no caminho ptico do espectrmetro, e quantificado. Validao analtica O desempenho da metodologia analtica influenciado essencialmente pela qualidade das medidas instrumentais e pela confiabilidade estatstica dos clculos envolvidos no tratamento dos dados.13

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Segundo a ANVISA,14 a validao deve garantir, atravs de estudos experimentais, que a metodologia atenda s exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. O desempenho da metodologia analtica sob investigao precisa ser consistente com a aplicao para a qual ela se destina.15 A validao analtica um processo demorado, que requer um grande nmero de ensaios e clculos estatsticos, aumentando o custo das anlises. Portanto, necessrio selecionar os parmetros que tm o maior impacto sobre a qualidade dos resultados e a rapidez com a qual so obtidos. Por isso, muitas vezes, no economicamente pertinente realizar todos os ensaios de validao sugeridos nos guias encontrados na literatura.14,16-20 Os parmetros selecionados no presente estudo para testar o desempenho da metodologia adotada10 foram: curva analtica, faixa de trabalho e faixa linear de trabalho, linearidade, seletividade, limite de deteco, limite de quantificao, exatido e preciso. Curva analtica A curva analtica a representao grfica da relao entre a resposta obtida (y) e a concentrao de analito (x). A maneira mais simples de descrever esta dependncia atravs do modelo de regresso linear representado por uma equao matemtica (equao da reta) em que y est em funo de x: y = ax + b (5)

-1, menor a disperso do conjunto de pontos experimentais, ou seja, menor o erro em y. Nestas condies, o ajuste da funo matemtica escolhida para a curva analtica ser mximo. Um coeficiente de correlao maior que 0,999 considerado como evidncia de um ajuste ideal dos dados para a linha de regresso.23-25 A ANVISA14 recomenda um coeficiente de correlao maior ou igual a 0,99 e o INMETRO16 considera um valor de r superior a 0,90 como sendo o valor usualmente requerido. O mtodo ser considerado livre de tendncias (unbiased) se a reta contiver a origem. Portanto, a obteno de um r superior a 0,9 assegura a linearidade da relao entre o sinal medido (y) e a concentrao (x) para o intervalo de concentraes em questo. A correlao entre as variveis de estudo, em termos dos valores de r, pode ser interpretada conforme a Tabela 2.
Tabela 2. Correlao entre as variveis de estudo, em termos dos valores de r. Adaptada da ref. 26 Valor de r r=1 0,91 < r < 0,99 0,61 < r < 0,91 0,31 < r < 0,60 0,01 < r < 0,30 r=0 Tipo de correlao Perfeita Fortssima Forte Mdia Fraca Nula

O ajuste da curva pelo mtodo dos mnimos quadrados fornecer os coeficientes de regresso que, no caso de um ajuste linear, correspondem ao intercepto da reta com o eixo y ou coeficiente linear (b) e a inclinao da reta ou coeficiente angular (a). A relao matemtica entre x e y previamente determinada empiricamente a partir de solues de concentraes conhecidas de analito (ou padres analticos), dando origem curva analtica.21 Faixa de trabalho, faixa linear e faixa linear de trabalho A faixa de trabalho representa o intervalo de concentrao no qual o mtodo de determinao de mercrio ser aplicado. O limite inferior da faixa de trabalho, normalmente, estipulado pelos valores dos limites de deteco (LD) e quantificao (LQ) do mtodo. A faixa de trabalho adotada neste estudo compreende um intervalo de concentraes de 0 a 12 g L-1. A faixa de concentraes na qual a sensibilidade pode ser considerada constante a faixa linear. A faixa linear de trabalho estabelecida atravs da confirmao de que o mtodo capaz de fornecer um grau aceitvel de exatido, preciso e linearidade quando aplicada s amostras contendo quantidades de analito dentro da faixa de trabalho especificada. Nesta faixa, portanto, o sinal medido (y) ter uma relao linear com a concentrao do analito (x). Linearidade A linearidade corresponde capacidade do mtodo de fornecer resultados linearmente correlacionados s concentraes do analito em uma determinada faixa de aplicao.18,22 A Lei de Beer estabelece que a relao entre o sinal medido (y) e a concentrao do analito (x), descrita pela Equao 1, s vlida para o intervalo correspondente faixa linear da curva analtica. A adequao do ajuste da curva fornecida pelo coeficiente de correlao de Pearson, r, tambm conhecido como coeficiente de correlao produto-momento ou, simplesmente, r de Pearson. O coeficiente de correlao apresenta uma faixa de magnitude entre -1 e 1 (-1 r 1) e indica o quanto a reta pode ser considerada adequada como modelo matemtico.16 Quanto mais prximo de 1 ou

Seletividade A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no sinal analtico de interesse. A seletividade avalia o grau de interferncia destes componentes sobre o sinal medido. A resposta obtida deve corresponder exclusivamente ao analito.27 A seletividade foi avaliada para a metodologia empregada, comparando-se dois grupos de amostras: um contendo a matriz (urina) e outro, no qual a matriz est ausente, ambos com concentraes de analito idnticas em cada nvel de concentrao de interesse. O material de referncia certificado 1641d da NIST foi empregado como padro de mercrio, assegurando a rastreabilidade dos resultados obtidos. Alquotas distintas deste material foram adicionadas aos dois grupos de amostras (com e sem urina) de forma a se obter trs diferentes concentraes da faixa de trabalho: 1,59; 4,77 e 7,95 g L-1. O nmero de amostras paralelas (n) em cada nvel de concentrao correspondeu a 7, conforme recomendao do INMETRO.16 Para avaliar os resultados obtidos, aplicaram-se os testes F de Fisher-Snedecor e o t de Student. Limite de quantificao e limite de deteco Medir a capacidade de deteco e quantificao particularmente til quando o analito que se deseja mensurar est presente em quantidades muito baixas na amostra. Para validar um mtodo analtico, suficiente indicar a concentrao do analito a partir da qual a quantificao e a deteco se tornam problemticas. O limite de quantificao (LQ) ou mnimo valor quantificvel, por sua vez, expresso em termos da concentrao correspondente preciso desejada (10%), levando-se em considerao o desvio padro relativo (DPR%) calculado para uma determinada faixa de concentrao. O limite de deteco (LD) ou mnimo valor detectvel considera os riscos (falso positivo) e (falso negativo). Limite de quantificao O limite de quantificao (LQ) a menor concentrao de analito que pode ser determinada com um nvel aceitvel de preciso e veracidade. O LQ pode ser obtido a partir da anlise de 7 replicatas do branco da amostra:16

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LQ = X + (kQ).s

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O fator de multiplicao kQ dependente da preciso (DPR%) desejada no limite de quantificao. DPR(%) = 100/kQ (7)

De acordo com Huber,30 os mtodos empregados para quantificar o analito em escalas macro requerem um DPR% de 1 a 2%. Para a anlise de traos, aceitvel um DPR% de at 30%, dependendo da complexidade da amostra. A Tabela 3 mostra a relao entre a concentrao do analito e a preciso esperada.
Tabela 3. Relao entre a concentrao do analito e a preciso esperada. Adaptada da ref. 30 Porcentagem de analito (%) 100 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 0,000001 0,0000001 Proporo de analito 1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 Unidade 100% 10% 1% 0,1% 100ppm 10ppm 1ppm 100ppb 10ppb 1ppb DPR(%) 1,3 2,8 2,7 3,7 5,3 7,3 11 15 21 30

Por exemplo, se a preciso ou DPR% desejada no limite de quantificao for de 10%, kQ ser igual a 10. Limite de deteco O limite de deteco (LD) representa a mnima concentrao ou quantidade de um analito que produz um sinal que o analista consiga distinguir, a um nvel de confiana especificado, do sinal produzido pelo branco. O LD do mtodo foi calculado com base no desvio padro obtido para uma srie de 7 (n) replicatas do branco da amostra (matriz na qual o analito est ausente ou presente em concentraes muito pequenas) adicionadas com a menor concentrao aceitvel do analito. Os valores de desvio padro obtidos so ento aplicados na seguinte frmula:16 LD = X + (kD).s (8)

RESULTADOS E DISCUSSO A linearidade foi investigada para as concentraes da faixa de trabalho para uma srie de 6 pontos distribudos no intervalo de 0 a 12 g L-1. O coeficiente de correlao obtido foi igual a 0,998. O mtodo pode, portanto, ser considerado linear, pois o coeficiente de correlao obtido a partir da curva analtica superior ao valor recomendado pela ANVISA14 (r 0,99). Alm disso, pode-se dizer que a correlao entre as variveis x (concentrao) e y (sinal obtido), de acordo com a Tabela 2, fortssima. A seletividade foi testada para avaliar a influncia dos efeitos da matriz sobre os resultados. Os resultados (em g L-1) para um nmero de amostras paralelas equivalente a 7 (n) encontram-se resumidos na Tabela 4. Pelos resultados obtidos podemos concluir que a matriz no tem um efeito significativo sobre a preciso do mtodo na faixa de concentraes de estudo. Para estimar o limite de quantificao, a preciso do mtodo foi examinada para uma faixa de concentraes do analito de 0,1 a 1 g L-1 (primeiro ponto da curva analtica) e 7 replicatas para cada nvel de concentrao. A mdia (X) e o desvio padro (s) foram calculados com base nos resultados obtidos para cada concentrao e aplicados na equao do desvio padro relativo (DPR%): DPR% = (s/X).100 (10)

onde, X a mdia dos valores obtidos para cada amostra adicionada, kD o fator de multiplicao correspondente ao t de Student para um nvel de confiana de (1- )x100% e (n 1) graus de liberdade e s corresponde ao desvio padro calculado. Exatido improvvel que um resultado obtido experimentalmente seja exatamente igual ao valor de referncia convencionalmente aceito como verdadeiro.16,18,28 A exatido (accuracy) o grau de concordncia entre o resultado de uma medio e um valor verdadeiro do mensurando.29 A exatido do mtodo foi avaliada a partir da realizao de ensaios com material de referncia certificado e testes de recuperao do analito. A interpretao dos resultados obtidos pode ser feita com auxlio de algumas ferramentas matemticas como o erro relativo, o teste F, o ndice Z (Z Score) e o erro normalizado. A recuperao ou fator de recuperao (R) definida como a proporo da quantidade da substncia de interesse, presente ou adicionada na amostra, recuperada por meio do mtodo analtico.21 Reflete, portanto, a quantidade de determinado analito efetivamente quantificada em relao quantidade real presente na amostra. Quando a recuperao obtida a partir da anlise de material de referncia certificado (MRC), calcula-se: R% = (C/CMRC).100 (9)

Com base nos valores de DPR% calculados, foi possvel decidir a concentrao limite, isto , a menor concentrao de mercrio que pode ser determinada com a preciso desejada que, no caso, corresponde a 10%.
Tabela 4. Valores de DPR% obtidos no estudo do LQ Concentrao (g L-1) DPR (%) 1,0 3 0,8 2 0,6 3 0,4 5 0,3 7 0,2 22 0,1 123

onde: C a mdia das recuperaes obtidas para n repeties e CMRC a concentrao verdadeira. O material de referncia certificado 2670a da NIST foi empregado na avaliao da exatido do mtodo. Preciso A preciso avalia a disperso dos resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres, em condies definidas16,18 e pode ser expressa pelo desvio padro relativo (DPR%), tambm conhecido como coeficiente de variao. Para avaliar a preciso, o desvio padro relativo foi calculado para uma srie de 7 replicatas independentes do material de referncia certificado 2670a da NIST, em 3 diferentes concentraes da faixa de trabalho.

De acordo com os valores de DPR% apresentados na Tabela 4, pode-se atribuir concentrao de 0,3 g L-1 a denominao de menor concentrao aceitvel do analito, pois a menor concentrao que pode ser determinada dentro da preciso desejada. O limite de quantificao (LQ) , portanto, 0,3 g L-1. O limite de deteco foi calculado da seguinte forma: LD = 0 + (kD).s (11)

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onde o fator de multiplicao (kD) corresponde ao valor de t de Student para um nvel de confiana de 99% e 6 graus de liberdade (t = 3,143) e s o desvio padro obtido para uma srie de 7 (n) replicatas do branco da amostra adicionadas com a menor concentrao aceitvel do analito (LQ). O LD calculado foi igual a 0,07 g L-1. A preciso foi determinada a partir do desvio padro relativo (DPR%) calculado para uma srie de medies (n = 7) sucessivas do analito sob condies de repetitividade. O desvio padro foi calculado para cada concentrao investigada na faixa de trabalho. Todos os resultados ficaram abaixo do limite considerado como aceitvel (at 20%) para que se considere o mtodo preciso.30 Pode-se concluir, portanto, que o mtodo adotado preciso. A exatido foi avaliada comparando-se os valores obtidos experimentalmente dos valores certificados a partir do estudo da recuperao. Tambm se calculou o erro relativo, o ndice Z e o erro normalizado. Os resultados podem ser observados na Tabela 5. Podese observar que o erro maior para as concentraes mais prximas aos extremos (inferior e superior) da curva analtica, como previsto pela lei de Beer. Com base nos valores de Z obtidos, pode-se afirmar que o mtodo capaz de gerar resultados satisfatrios, pois |Z| 2 em todas as concentraes.16 O material de referncia certificado 2670a da NIST foi empregado no ensaio da recuperao e os resultados obtidos para uma srie de 7 medies independentes em cada nvel de concentrao so mostrados na Tabela 5. O t de Student foi calculado para avaliar a exatido do mtodo. O mtodo pode ser considerado exato se o valor de t obtido estiver dentro do intervalo estabelecido pelo valor tabelado de t para (n 1) graus de liberdade e nvel de confiana de 99%. Todos os valores calculados de t (tcalculado) so inferiores ao valor de t tabelado (ttabelado) em todos os nveis de concentrao investigados. O mtodo pode, portanto, ser considerado exato.
Tabela 5. Conjunto de resultados obtidos atravs dos ensaios de validao Parmetro r Resultados 0,999

atendimento odontolgico de consultrios da rede pblica da cidade de Araguana (TO). Do total de amostras analisadas, 6 (15%) apresentaram nveis de mercrio urinrio superiores ao limite de normalidade equivalente a 10 g L-1. A concentrao obtida para uma das amostras ficou na concentrao limiar [(10,01 0,03) g L-1] e o resultado obtido para o restante das amostras ficou abaixo de 10 g L-1, o que revela uma exposio ao mercrio, ainda que dentro do limite de normalidade. A mdia dos resultados obtidos foi de 6 g L-1 em uma faixa de concentrao de 1 a 23 g L-1 com at 11% de preciso. CONCLUSO A validao analtica comprovou a adequao da metodologia adotada para quantificar Hg total em amostras de urina por espectrometria de absoro atmica com vapor frio. Todos os testes foram efetuados de modo a abranger a faixa de concentrao na qual se pretende aplicar o mtodo de determinao de mercrio. A menor concentrao de Hg que pode ser determinada com uma preciso aceitvel corresponde a 0,30 g L1 (LQ). Alm disso, o limite de deteco do mtodo (LD = 0,07 g L1) assegura a determinao de Hg em quantidades trao. Entretanto, a relevncia dos ensaios de validao recai sobre os parmetros que confirmam a boa performance do mtodo na faixa de aplicao. O desempenho satisfatrio do mtodo nesta faixa essencial para que se possa extrair um significado bioqumico dos resultados, levando em conta os limites pr-estabelecidos. Os resultados devem possibilitar ao analista dizer se o teor de Hg urinrio (HgU) determinado est ou no dentro da faixa de normalidade (at 10 g L1). Neste quesito, os testes para verificar a exatido e a preciso do mtodo foram fundamentais para demonstrar que os erros associados aos resultados no so estatisticamente significantes e que os mesmos so confiveis. Alm disso, a metodologia permite uma recuperao quase que total do analito investigado. A metodologia adotada representa, portanto, uma importante ferramenta para avaliar a exposio ao Hg e os resultados obtidos constituem uma evidncia de que esta exposio possa ter, de fato, alguma influncia sobre os nveis de Hg no organismo. Ainda que direcionada questo do amlgama dental, esta metodologia pode tambm ser aplicada para investigar outros casos nos quais exista uma exposio ao Hg, salvo exposies aos compostos orgnicos de Hg, para as quais a urina no o IBE mais adequado. Espera-se, com isso, que o laboratrio possa, futuramente, ampliar a sua rea de atuao. Uma anlise inicial permitiu constatar o teor de Hg urinrio (HgU) de 39 indivduos pertencentes ao estudo da Fundao de Medicina Tropical do Tocantins, 6 dos quais apresentaram nveis de HgU superiores ao limite de normalidade. Os resultados obtidos encontram-se em uma faixa de concentrao de 1 a 23 g L1 com at 11% de preciso. Testes adicionais devero ser realizados para constatar se existe alguma alterao em funo do tempo e da carga de exposio dos indivduos aos quais correspondem as amostras analisadas. REFERNCIAS
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Resultados (g L-1) F F tcalculado ttabelado s/ Matriz c/ Matriz calculado tabelado 1,43 1,54 1,00 1,21 Seletividade 4,88 4,99 1,93 0,79 4,28 3,05 8,82 8,78 1,15 0,18 LD 0,07 g L-1 LQ 0,30 g L-1 Concentrao Resultados DPR (g L-1) (g L-1) (%) 1,90 1,83 5,8 Preciso 4,75 4,73 2,6 9,51 9,19 4,4 Concentrao Resultados ER Recuperao Z tcalculado ttabelado (g L-1) (g L-1) (%) (%) 1,90 1,83 3,66 0,65 96,3 1,59 Exatido 4,75 4,73 0,40 0,15 99,6 0,38 3,14 9,51 9,19 3,42 0,80 96,6 1,96 r = coeficiente de correlao; LD = limite de deteco; LQ = limite de quantificao

Aplicao da metodologia em amostras reais de Tocantins A metodologia analtica foi aplicada em uma anlise inicial para determinao de mercrio total em 39 amostras de urina enviadas pela Fundao de Medicina Tropical do Tocantins. Estas amostras fazem parte de um estudo referente aos riscos da exposio ao mercrio no

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Guilhen et al.

Quim. Nova

6.

7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

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